Thomas Hunt
Morgan
(1866-1945)
Její Veličenstvo
královna
Octomilka
0,1 mm
Drosophila melanogaster : životní cyklus
dospělec
metamorfóza
oplozené vajíčko
rýhování
gastrulace
vylíhnutí
3.
2.
1.larvy 1.- 3. instaru
kukla minut
po
oplození
hodin po
oplození
dny
6
Chromosomy Drosophila
• 3 páry autosomů
• samečci a samičky
se liší v pohlavních
chromosomech
– samečci XY
– samičky XX
geny
maternální
velkých mezer
párového pravidla
polarity segmentů
Indiduální vývin octomilky je kaskádou řízenou
maternálními a zygotickými geny
fúzí parentálních gamet vzniká diploidní zygota
9 cyklů dělení jader vytváří mnohojaderné cyncytium
jádra migrují k povrchu vajíčka – jaderný blastoderm
jádra migrují k povrchu vajíčka – jaderný blastoderm
pólové buňky
tvoří posteriorní pól
4 další cykly dělení jader u buněčného povrchu
zárodečné buňky
tvorba jednobuněčné vrstvy – buněčný blastoderm
Vývoj drosofily
• srovnání larvální
a adultní segmentace
• plán těla zahrnuje
hlavovou oblast,
hrudní články
a zadečkové
– prothorax (T1) má jen nohy
– mesothorax (T2) má nohy a
křídla
– metathorax (T3) má nohy a
kyvadélka
Specifikace hlavní tělní osy
• anterior-posteriorní polarita
• geny s maternálním účinkem
• geny velkých mezer
• geny párového pravidla
• geny polarity segmentů
• homeotické geney
A P
Geny s maternálním účinkem
• translace mRNA bicoid a nanos po fertilizaci
• gradient proteinu Bicoid aktivuje více transkripci genu
hunchback v anterioru
• současně protein Bicoid inhibuje translaci caudal mRNA.
• gradient proteinu Nanos v posterioru inhibuje translaci mRNA
Hunchback, zatímco protein Caudal se tvoří v posterioru
• proteiny Bicoid a Hunchback aktivují geny odpovědné za
specifikaci anteriorní části těla
• protein Caudal aktivuje geny odpovědné za posteriorní vývin
• nesegmentované anteriorní a posteriorní póly jsou regulovány
aktivací proteinu Torso v anterior- a posterior-pólech
Embrya drosofily mají anteriorně-posteriorní
a dorzo-ventrální osy, které jsou založeny
prezygoticky maternálními genovými produkty.
Distribuce maternální
mRNA genu bicoid
ve vajíčku
a proteinu bicoid
po fertilizaci
0,1 mm
jedna kopie genu bicoid
šest kopií genu bicoid
anterior - posterior
anterior - posterior
koncentrace bicoid
koncentrace bicoid
prahová hodnota
prahová hodnota
Hladina maternálního
proteinu bicoid řídí
expresi zygotického
genu hunchback
zvýšený počet funkčních
maternálních kopií genu
bicoid vede ke zvýšení
koncentrace proteinu
ve vajíčku i rozšíření
účinku směrem
k posterioru
A P
vajíčko wt normální larva
mutant vajíčko mutantní larva bicoid
bicoid
vajíčko wt vajíčko bicoid částečný anteriorní vývoj
vajíčko wt vajíčko bicoid
protein
bicoid
protein
bicoid články hlava články
hrudi hrudi
Úloha produktu
maternálního genu
bicoid rozhoduje
o tvorbě anteriorních
struktur embrya
drosofily
Transplantace pólové
cytoplasmy může indukovat
tvorbu zárodečné linie
…
primordiální zárodečné
buňky jsou prvními
odlišnými, na posteriorním
konci
…
u drosofily,
hlístice (granule P)
a žab
ink
ellow
ellow
reen
cytoplasma posterioru oplozeného vajíčka
přenesena do anterioru jiného
anteriorní buňky (s pólovou plasmou)
přeneseny do jiného posterioru
moucha G vytváří zárodečné buňky
s genotypem G a Y
migrace
do gonád
syncycium
celularizace
hunchback nanos hunchback nanos
anterior posterior anterior posterior
distribuce maternální mRNA distribuce proteinu
Maternální podstata A – P gradientu proteinu hunchback
- po fertilizaci je nanos mRNA translatována
a protein brání translaci hunchback mRNA v posterioru
Gradient maternální bicoid RNA v oocytu drosofily
spouští transkripci zygotického genu velkých mezer
Exprese zygotického genu hunchback
je řízena maternálním proteinem bicoid
chimérický reportérový gen hunchback
normální promotor „částečný“ promotor delece promotoru
promotor genu hunchback má vazebné místo k proteinu bicoid
řez syncytiálním blastodermem
žloutková
cytoplasma
D D
V V
V
protein Dorsal
v cytoplasmě
jádra
receptorový protein Toll je aktivován ventrálně
koncentrace
proteinu
Dorsal
v jádrech
protein
Dorsal
v jádře
aktivace receptoru Toll na ventrální
straně maternálně získaným ligandem
receptorový protein Toll
ligand
( Spaetzle )
Dorso-ventrální orientace embrya je určována maternálním faktorem
kaskáda vede od ventrální
posttranslační úpravy
maternálního proteinu
Spaetzle uloženého v membráně
membrána
SPAETZLE
TOLL
DORSAL
Diferenciace dorzo-ventrální osy embrya octomilky. Příčný řez ukazuje interakci mezi membránovým
receptorovým proteinem Toll a proteinem spaetzle, která indukuje diferenciaci podél dorzo-ventrální osy.
Ke tvorbě interagujícího polypeptidu dochází v prostoru mezi plazmatickou membránou a žloutkovou
membránou na ventrální straně embrya.
Krok 1: Receptorový protein Toll je
uniformně distribuován na povrchu
plazmatické membrány embrya.
Protein spaetzle se nachází v prostoru
mezi žloutkovou a plazmatickou
membránou.
Krok 2: Proteáza easter štěpí protein
spaetzle a vytváří tak aktivní
polypetid spaetzle.
Krok 3: Aktivní polypeptid spaetzle
interaguje s receptorovým
proteinem Toll.
Krok 4: Aktivní polypeptidový
komplex Toll/spaetzle vpouští protein
dorsal do jader (indikováno
oranžově) na ventrální straně embrya
(tmavočerveně).
Vývojová kaskáda tvorby tělního plánu drosofily,
SEGMENTAČNÍ GENY :
geny velkých mezer
geny párového účinku
geny orientace tělních článků
Segmentační geny (zygotické)
• vývojové určení buněk nastává ve dvou stádiích :
– specifikace – osud buňky je určován vnějšími vlivy,
specifikace buněčného osudu je flexibilní a může být měněna
signály z jiných buněk
– determinace – buňka se nakonec podrobuje přechodu
(transition) z „volného určení“ (loose commitment) na
„konečný osud“ (fixed determination)
• tranzice ze specifikace na determinaci je u drozofily
zprostředkována segmentačními geny
• tyto geny dělí embryo na opakující se sérii segmentů
podél A-P osy
• segmentační geny rozdělí embryo na 14 parasegmentů
Geny velkých mezer (gap genes)
• gradienty maternálních transkripčních
faktorů Bicoid,
Caudal a Hunchback regulují
transcripci genů „gap“
• vysoká hladina proteinu
Hunchback indukuje expresi
genů Giant, zatímco inhibuje
transkripci Knirps
• transkript Kruppel se objeví v
oblasti, kde klesá Hunchback
• exprese genů Giant je také
regulována posteriorně
produktem genu Caudal
0,1 mm
Proužkované embryo
- parasegmenty (před celularizací) jsou určovány expresí
„sudě-skákajících“ a „liše-skákajích“ párových genů
even-skipped
fushi tarazu
• Geny párového pravidla jsou exprimovány v průběhu 13.
buněčného dělení, dělí embryo na 15 částí. Jeden vertikální
proužek jader exprimuje „párový“ gen, další nikoli, následující
opět ano.
• Je známo 8 genů párového pravidla. Ne všechna jádra exprimují
stejné „párové“ geny. Uvnitř každého parasegmentu každá řada
jader má svůj „pattern“ exprese „párových“ genů.
• „Pattern“ exprese „párových“ genů je určován distribucí
produktů genů velkých mezer.
Geny
párového
účinku :
eve ftz eve ftz
en wg en wg en wg en
Časově-místní souslednost exprese segmentačních
genů v embryu :
geny párového účinku geny polarity segmentů
eve = even skipped en = engrailed
ftz = fushi tarazu wg = wingless
hladiny proteinů
kódované geny
párového účinku
A ….. P
hladiny proteinů
kódované geny
polarity článků
The Red Model, René Margitte (1935)
William BatesonWilliam Bateson
(1861-1926)
MaterialsMaterials forfor thethe StudyStudy ofof
VariationVariation (1894)(1894)
… HOMEOSIS… HOMEOSIS isis aa particularparticular
typetype of variationof variation,, in whichin which
one member ofone member of aa repeatingrepeating
series assumes features thatseries assumes features that
areare normally associated withnormally associated with
aa different numberdifferent number ……
„přední“ komplex
Antennapaedia
„zadní“ komplex
Bithorax
Expresní domény homeotických genů podél předozadní osy embrya
hlava hruď zadeček
Chromosomální lokalizace homeotických genů
Homeóza je výskyt správné struktury …
Homeotická mutace je změna …
Homeotický gen je odpovědný za …
Homeobox je konzervativní úsek DNA …
Homeodoména je část proteinu kódovaná …
Ne všechny homeotické geny mají homeobox !
Ne všechny homeoboxové geny mohou
způsobovat homeózu !
Homeotické geny (proteiny) jsou definovány
strukturou či funkcí …
Edward Lewis (1963) :
pravidlo spacio-temporální kolinearity
HOMEOTICKÉ GENY - jeden z klíčů specifikace
embryo dospělec
moucha
myš
Antennapedia Bithorax komplex
komplex (anterior) (posterior)
BITHORAX specifikuje třetí článek
hrudi a zadeček: při ztrátě funkce –
místo kyvadélek se tvoří druhý pár křídel
( more anterior phenotype )
Homeotické geny
řídí anteriorně -
posteriorní
specifikaci těla :
WT
ztráta funkce genu C „více
anteriorní“ fenotyp
ektopická exprese genu B –
„více posteriorní“ fenotyp
ANTENNAPEDIA specifikuje mesothorax (T2):
jeho ektopická „dominantní“ exprese vyvolává tvorbu
nohou na hlavě ( more posterior phenotype )
Antennapedia
wt mutant
zadeček hruď hlava
Bithorax
Evoluce homeotických
(selektorových) genů
• vysoký stupeň podobnosti mezi geny skupin
Antennapedia a Bithorax, duplikace
• všechny obsahují homeobox, 180 bp
• kódují 60-amino-kyselinovou
homeodoménu, která se váže k DNA
• příbuzné geny nalezeny i u všech jiných
živočichů, člověka i rostlin
gen Antennapedia
protein Antennapedia
homeodoména
homeobox
Strukturní organizace genu Antennapedia
a jím kódovaného proteinu
- vysoce konzervativní je zejména homeodoména, u všech eukaryot
- homeobox má 180 nukleotidů, lokalizován v exonu 8
- homeodoména se nachází u karboxyterminálního konce
moucha
myšžába
Model vazby
homeodomény
(transkripčního faktoru)
na úsek DNA
(obvykle promotor)
I, II, III – alfa-šroubovice
1 – 60 aminokyseliny
Proteiny POLYCOMB a TRITHORAX – klíčové regulátory
struktury chromatinu a exprese (homeotických) genů
Genetická asimilace homeotického fenotypu
Bithorax – specifita normy reakce
Conrad Waddington (1953)
reakce embrya na éter – „křídlovité“ haltery - fenokopie
dlouhodobá fenotypová selekce vede ke stabilizaci změny
Model buněčné paměti: zárodečné terčky
larva metamorfóza dospělec
proximal
distal
jednotlivé vrstvy terčku
mají odlišný vývojový
i regenerační potenciál
coxa
femur
tibia
tarsal
Vývojová mapa nožního terčku drosofily
regenerace
duplikace
rovina řezu
regenerace duplikace
Imaginální terčky obsahují gradient
vývojových schopností
klesající od centra A směrem
k periferii B
Sériové transplantace (přenosy) buněk imaginálního
terčku jako testovací systém ke studiu vývojového
osudu a determinace
larva
extirpace a rozdělení
genitálního terčku
test determinace
test determinace
testy determinace
sériové extirpace,
rozdělení terčku a přenosy
do dospělců
Determinace demonstrována kultivací zárodečných terčků
larva terček metamorfóza
část terčku
přenesena do
abdominální
dutiny
zbytek terčku
přenesen do
jiné larvy
struktury těla
dospělce se vyvíjejí
z terčků
buňky terčku
proliferují uvnitř
těla, sériové
transplantace vzorek terčku
implantován do
jiné larvy
stejné struktury
těla jako z
původního terčku
TRANSDETERMINACE
je unikátním případem ztráty buněčné (vývojové) paměti vlivem
mnohočetného (ektopického) přenosu zárodečného terčku
možné případy
změn :
křídla
genitál
tykadla
oči
kyvadélkahruď
ústní ústroje
nohy
Gen eyeless
• Mutantní mušky
nevytvářejí oči.
• Wild-type gen eyeless
kóduje
homeodoménový
transcripční faktor, který
aktivuje dráhu
zahrnující tisíce genů.
HOMOLOGNÍ GENY PRO ANALOGICKÉ ZNAKY ?!
myší gen Pax 6 dává signál mouše ke tvorbě složeného oka na
tykadle
Eyeless : homolog myšího genu Pax je odpovědný
za tvorbu oka – monofyletický původ složených očí
hmyzu a jednoduchého oka savců
tvorba ektopických očí u transgenní mouchy
Savčí homology genu eyeless
• Myší homolog genu eyeless, Pax6, pokud je
přenesen do octomilky, vytváří přídatné oči.
• U myši vedou mutace homologa genu
eyeless k reduci velikosti očí.
• Mutace homologního genu u člověka
způsobují aniridii (chybění duhovky).
Buněčná diferenciace oka drozofily
- složené oko se tvoří z imaginálního disku, celkem 800 facet,
každá sestává z 20 buněk
- 8 fotoreceptorových neuronů (R1-R8)
Determinace fotoreceptoru R7 facety složeného oka octomilky.
(a) Uspořádání osmi fotoreceptorů (R1 - R8) a čtyř čípkových buněk (C)
ve facetě. (b) Signalizace mezi diferencovanou buňkou R8 a
předpokládanou buňkou R7. Protein BOSS (kódovaný bride of sevenless)
buňky R8 je ligandem pro receptorový protein sevenless (SEV) na
povrchu buňky R7. Aktivace tohoto receptoru zahajuje
signální kaskádu uvnitř buňky R7,
čímž ji indukuje k diferenciaci.
Determinace fotoreceptoru R7
• Buňka R7 syntetizuje membránový receptor,
zvaný sevenless (SEV).
• Buňka R8 exprimuje ligand pro receptor sevenless,
zvaný bride of sevenless (BOSS).
• Kontakt mezi buňkami R7 and R8 je nutný k tomu, aby protein
bride of sevenless interagoval (a aktivoval) receptor sevenless.
To aktivuje kaskádu změn v buňce R7.
• Taková determinace osudu nediferencované buňky signálem z
diferencované buňky se nazývá indukce.
Drosofila nemá pohlavní hormony:
bilaterální gyandromorfie
samčí XO část:
bílé oko,
miniaturní křídlo
samičí XX část:
heterozygotní
pro oba markery
(ztráta jednoho chromosomu X-wt při prvním mitotickém dělení)
Zjišťování poměru X:A pomocí numerátorových a denominátorových elementů u octomilky.
Tento poměr je určován interakcemi mezi proteinovými produkty těchto genů.
Krok 1: Numerátorové proteiny
jsou tvořeny X-vázanými geny;
denominátorové proteiny
jsou produktem autozomálních genů.
Krok 2: Denominátorové proteiny
antagonizují s numerátorovými proteiny.
V embryích XX jsou numerátorové
proteiny v přebytku a tudíž schopné
aktivity. V embryích XY nejsou
numerátorové proteiny v přebytku
a tudíž nemohou být aktivní.
Krok 3: V embryích XX je přebytek
numerátorových proteinů, které se kombinují
s maternálně poskytnutými proteiny,
k aktivaci transkripce genu Sex-lethal (Sxl).
V embryích XY je nedostatek
numerátorových proteinů,
což brání v aktivaci genu Sxl.
čitatel numerator
--------------- = ---------------
jmenovatel denominator
POHLAVNÍ DETERMINACE U OCTOMILKY
Pohlavně specifická exprese genu Sex-lethal (Sxl) u octomilky. Ačkoli je tento gen transkribován jak
v embryích XX tak i v embryích XY, alternativní sestřih této RNA omezuje syntézu proteinu SXL pouze na
embrya XX, ze kterých se vyvinou samičky. Nepřítomnost proteinu SXL v embryích XY vede
k vývoji samečka.
Krok 1: Transkripce:
V embryích XX molekulární
signál založený na poměru
X:A iniciuje transkripci genu Sxl
z promotoru PE. Později je transkripce
započata z promotoru PM
v embryích XX i XY.
Krok 2: Sestřih:
V embryích XX jsou
transkripty Sxl sestřihovány
tak, aby obsahovaly všechny exony
s výjimkou exonu 3. V embryích XY
jsou Sxl transkripty
sestřihovány, aby zahrnovaly
všechny exony včetně exonu 3.
Krok 3: Translace:
V embryích XX je Sxl mRNA translatována
v polypeptid (SXL), který reguluje sestřih,
včetně sestřihu transkriptů Sxl.
V embryích XY brání stop
kodon v exonu 3 řádné
translaci Sxl RNA ve funkční polypeptid.
Regulace pohlavní determinace u octomilky řízená genem Sex-lethal (Sxl). Gen Sxl reguluje expresi genu
transformer (tra), který dále reguluje expresi genu doublesex (dsx). Gen transformer2 (tra2) se také podílí
na regulaci dsx. Značky + a – naznačují přítomnosti či absenci různých proteinů.
Krok 1: Alternativní sestřih Sxl
RNA tvoří protein SXL
v embryiích XX,
nikoli v embryích XY.
Krok 2: Protein SXL reguluje
sestřih Sxl a tra RNA.
Krok 3: Alternativní sestřih
tra RNA vede ke tvorbě
proteinu TRA v embryích XX,
nikoli v embryích XY.
Krok 4: Proteiny TRA a
TRA2 regulují sestřih dsx RNA.
Krok 5: Alternativní sestřih dsx RNA vede ke tvorbě dvou odlišných proteinů
– u každého pohlaví jiného.
Krok 6: Proteiny DSX řídí somatický pohlavní vývoj.
Fruitless (fru)
• Samečci homozygotní
pro mutaci fru jsou
přitahování jinými
samečky.
• Gen fru kóduje
transkripční faktor, který
reguluje geny samčího
pohlavního chování.
• Kandidátní gen pro
homosexualitu?
KOMPENZACE DÁVKY GENŮ
VÁZANÝCH NA CHROMOZOM X
- Caenorhabditis
- Drosophila
- savci
Drosophila melanogaster
Hermann Joseph “H.J.” Muller (1930): paradox funkce genů vázaných na chromozom
X u drosophily, hladina X-produktů je stejná u samiček XX jako u samečků XY –
KOMPENZACE DÁVKY GENŮ zdvojením intenzity X u samečků, odpovědná skupina
genů MSL – male specific lethal complex, váže se na X u samečka, koreluje se
specifickou acetylací H4K16.
samička XX
sameček XY
Analýza funkce hypomorfní
X-mutace white odpovídající
za tvorbu červeného
pigmentu oka:
Intenzita barvy je úměrná
genové expresi,
samičky se dvěma X
však mají stejnou barvu
oka jako samečci XY.
Experimentální kontrolní
konstrukt
(bez vazby
na X):
MSL – male specific lethal complex, váže se na X u samečka, koreluje se
specifickou acetylací H4K16: vede k neutralizaci pozitivního náboje H4 a tedy
k oslabení represivní internukleosomální struktury
Komponenty MSL vedou k acetylaci histonu H4 a rozvolnění nukleosomů
(včetně fosforylace H3) - funkce zesilovače transkripce X-genů u samečka
Regulace kompenzace genové dávky začíná – stejně jako pohlavní determinace u
měření poměru počtu X-chromozomů a sad autozomů
Sex lethal Sxl
kóduje female
specific RNAvazebný
protein,
který reguluje
sestřih mRNA.
- protein SXL
brání expresi
genu male sex
lethal
Při X/A = 0,5 je správný
sestřih Sxl mRNA
znemožněn,
- gen msl je
aktivní a
vede
k nastartování
dávkové
kompenzace
Gen Sex lethal je kódován X-chromozomem a je pozitivně regulován transkripčními
faktory kódovanými X. Protein SXL pozitivně reguluje sestřih své vlastní mRNA.
Sxl počíná samičí diferenciaci specifickou regulací sestřihu genu transformer (tra).
Tra (plus Tra2) řídí
female-specific sestřih
primárního transkriptu
genu doublesex (dsx),
který potlačuje malespecific
realizer geny
numerátor/
denominátor
Gen roX je centrem aktivace jediného chromozomu X u samečků drosofily
(podobně jako X-vázaný gen Xist u savců – kde však jde o inaktivační centrum)
Gen roX prostřednictvím svých mRNA atrahuje MLS (male specific lethal) komplex,
ten se šíří po chromozomu X a více ho aktivuje.
Translokace roX lokusu na autozom
přitahuje MLS komplex (a aktivuje) jeho geny.
Drosophila: poziční efekt
(PEV)
PEV efekt : Lokus white je standardně umístěn v euchromatinu, po inverzi pouze 25kb
od pericentromerického heterochromatinu (Muller 1930), odtud se šíří restrukturace a
umlčování euchromatinu. Ztráta umlčení v některých buňkách oka v procesu diferenciace
vede k variegovanému fenotypu.
euchromatin heterochromatin
excize a inverze po X-ozáření
U much vykazujících PEV lze izolovat sekundární mutace, které buď suprimují fenotyp
(Su(var) = ztráta umlčení, či zesilují fenotyp (E(var) = zvyšují umlčování.
červené
oko (WT)
mozaikové
oko
mozaikové
oko
červené
oko (jako WT)
bílé
oko enhancer suppressor
Účinek modifikátorů na variegaci projevu mutace white je dávkově závislý
Modifikátory (~30) jsou strukturní proteiny heterochromatinu.
mozaikový fenotyp se projeví, pokud
jsou přítomny dvě kopie
wt-modifikátorového genu
přítomnost tří wt-kopií modifikátorového
genu vede k rozsáhlejší heterochromatinizaci
a zvýšení umlčovacího účinku (bílé oko)
přítomnost pouze jediné wt-kopie
modifikátorového genu vede ke
snížení tvorby heterochromatinu a
vyšší expresi white genu (červené oko)
euchromatin hetrochromatin
Přechod euchromatického stavu na heterochromatický
vyžaduje sérii změn v histonových modifikacích
Aktivní geny jsou značeny H3K4metyl2 a metyl3,
tato značka musí být odstraněna komplexem LSD1.
V euchromatinu je H3K9 acetylován, tato značka je odstraněna histon deacetylázou HDAC1.
Fosforylace H3S10 může interferovat s metylací
H3K9; defosforylace nastává účinkem fosfatázy
směrované interakcí C-konce JIL-kinázy
nukleosom
Lyzin v pozici H3K9 musí být deacetylován.
EPIGENETICKÁ DETERMINACE POHLAVÍ
Sciara coprophilia, moucha smutnice XX/XO
(specifická eliminace paternálního X, Metz 1938)
samičí gamety + samčí gamety
Am Xm Ap Xp Xp
všechny Am Ap Xm Xp Xp
zygoty
samičky (X / A) samečci
somatické buňky Am Ap Xm Xp Am Ap Xm
zárodečné buňky Am Ap Xm Xp Am Ap Xm Xp
(zde nastane nondisjunkce
X chromozomů!)
červec citroníkový Planococcus citri, Homoptera
fakultativni heterochromatinizace paternálních
chromosomů ( Uzi Nur 1990, Rochester )
PSEUDOARRHENOTOKIE
selektivní umlčování či eliminace paternálních
chromosomů
bee worker
Diploid queen
XX larva
queen
standard nutrition
royal jelly
inhibition of
DNA methylation
Konstrukce
transgenní
drosofily
dva plasmidy injikovány do oplozeného vajíčka
defektní element P
bez transpozázy
pomocný element P
s transpozázou,
neschopen inserce