mořská ježovka: při gastrulaci vznikají invaginací prvoústa, která posléze prolomí otvor k „druhým“ ústům druhoústa střevo anus GASTRULACE klíčové stádium diferenciace invaginace introgrese involuce prvoústa zárodečné listy orgány : endoderm střevo, játra, plíce střevo mesoderm skelet, svaly, ledviny, srdce, krev svaly, srdce, krev ektoderm pokožka, nervový systém kutikula, nervový systém dorsal dorsal ventral ventral zárodečné listy OBRATLOVCI HMYZ ježovka Mořská ježovka : historický model fertilizace, embryologie a buněčného klonování Oscar Hertwig (1849-1922) dauerlarva larvy : pluteus Rouxovy experimenty na žabích vajíčkách měly vést k ověření Weismannovy teorie mozaikového vývoje vývoj žáby je založen na mozaikovém mechanismu: buňky mají svůj charakter a osud je derminován při každém rýhování … … ale Hans Driesch zatím dělá obdobné pokusy na ježovkách a dochází k jiným závěrům … zygota dvojbuněčné stádium stádium blastuly stádium neuruly horká jehla blastocoel zabitá buňka polovina zůstává embrya nervová trubice Wilhelm Roux (1850-1924) Hans Driesch (1876-1941) Popření teorie mozaikového vývoje i mechanicismu : … organismy nejsou stroje, tyto nemohou samy doplňovat své chybějící části … … organismy (embrya) mají schopnost regulace … normální vývoj larvy ježovky ze stádia dvou blastomer jedna ze separovaných blastomer obvykle umírá jedna ze dvou separovaných blastomer dává vznik normální (menší) larvě … v hlavní roli : zebřička Danio rerio ryba zebřička dospělec 30 minut po (vnějším) oplození rýhování gastrulace a epibolie organogeneze vylíhnutí hodiny po oplození dny po oplození 0,5 mm 0,5 mm 1 cm 1 cm Reaktivně – difúzní mechanismy vývoje aktivátor inhibitor spontánní samouspořádání 2 měs. 6 měsíců 12 měsíců modelování pruhů u ryby Pomocanthus Uspořádání pigmentu v pruzích zebřičky neurální hřeben (gastrulace, ektoderm, migrace) 3 typy pigmentových buněk = chromatoforů (savci mají jen melanocyty) černé - MELANOFORY (melanin) žluto-oranžové - XANTOFORY (pteridiny a karotenoidy) stříbrné - IRIDOFORY (guanin-bohaté reflexní destičky) černé pruhy světlé pruhy 1 cm Tvorba uspořádání zbarvení zebřičky v ontogenezi LARVA DOSPĚLEC jen nevýrazné 2 tmavé změny v pruzích, dva pruhy melanoforů primární + 3-4 sekundární, vznikajících z neurulálních + xantofory a iridofory buněk gastruly, migrace metamorfóza migrace i apoptóza chromatoforů, vznik nových z kmenových buněk 1 cm 1 cm MELANOPHORES XANTHOPHORES - tři typy chromatoforů (buněk) - pobyh buněk - programovaná buněčná smrt 1 cm transgenní ryba „green fluorescence protein“ Danio rerio zebřička Zebřička – model vývojové genetiky a ekotoxikologie mutagen P F1 F2 F3 vše fenotypově wt mutant … v hlavní roli : žáby a ocasatí obojživelníci Základní stádia ontogeneze obojživelníků oplozené 2-buněčné stádium midblastula časná gastrula pozdní gastrula vajíčko (90 min) (4tis. buněk, 7 h) (20tis. buněk, 9h) (12h) animální pól blastocoel vegetální pól blastopor blastopor ektoderm mesoderm endoderm časná neurula časná neurula pozdní neurula vylíhnutý pulec dospělá žába (150tis. buněk, 20h) (500tis. buněk, 3d) (12 měsíců) střevo střevo neurální neurální uzavírající se destička destička neurální destička Xenopus laevis – africká drápatka – model molekulární embryologie HISTORICKÉ KOŘENY VÝVOJOVÉ BIOLOGIE : slavné experimenty Hanse Spemanna s čolky OBJEV ORGANIZÁTORU (Freiburg 1923) HANS SPEMANN (1869-1941) HILDE MANGOLD (1898-1924) Indukce nové tělní osy přenosem oblasti organizátoru časné gastruly čolků (Spemann a Mangoldová 1924) dorzální ret blastoporu nepigmentovaného druhu přenesen do obalu blastocoelu pigmentovaného druhu dorzální ret blastoporu blastocoel indukce sekundárního embrya sekundární (indukované) embryo neurální PRIMÁRNÍ trubice STRUKTURY : notochord SEKUNDÁRNÍ STRUKTURY : notochord neurální trubice Determinace oblasti oka v průběhu embryogeneze obojživelníků budoucí epidermis oblast budoucího oka budoucí endoderm budoucí neurální destička budoucí mesoderm blastopor stádium pulce normální oko „osudové mapování“ normální gastruly lokalizuje oblast budoucího oka transplantát z pozdějšího stádia embrya se vyvine jako oko neurula hostitelská neurula transplantace z transplantované tkáně se vytvoří struktura oka transplantace gastrula hostitelská neurula transplantát z časné gastruly se vyvine podle své nové polohy tkáně hostitele tkáň transplantátu somity XENOTRANSPLANTACE ústa ústa žáby čolka čelist s přísavkami žábry zuby blastula žáby (donor) „budoucí“ epidermis oblast „budoucích“ úst gastrula čolka (recipient) čolek s žabími ústy čelist s přísavkami základní schéma : transplantace : ČOLEK - MODEL REGENERACE zápěstí loket paže kotník koleno stehno regenerace transplantace regenerující pahýl přední nohy regenerující pahýl zadní nohy blastema blastema blastema zápěstí lokte paže Transplantace regenerujících končetin mloka demonstrují vývojovou hypotézu „roztřídění buněk na bázi jejich odlišné adhezivity“ John Gurdon (Oxford, 1962) příjemce dárce Poruchy vývoje končetin jako indikátor teratogenních faktorů (ekotoxikologie) dospělec vejce vývoj v oviduktu rýhování gastrulace kladení hodin po oplození hodin po kladení kur organogeneze vylíhnutí kuře dnů po kladení 10 mm 1 mm 1 mm Polarizační oblast pupene specifikuje končetinu podél antero-posteriorní osy exprese genu Sonic hedgehog na posteriorním konci pupene poskytuje poziční signál podél A-P osy 0,1 mm pupen kuřecí končetiny polydaktylie u člověka Buňky v růstové zóně vyžadují poziční informaci polarizační oblast (Sonic hedgehog) zóna růstu - růstová zóna je specifikována apikální ektodermální rýhou na distálním konci a polarizační oblastí na posterioru, buňky od nich posléze získávají poziční hodnotu chrupavka apikální ektodermální rýha Pleiotropní funkce jednotlivých signálů přenos tkáně z anteriorní oblasti iniciace vývoje končetiny kuřete vyžaduje fibroblastový hlavy mloka na bok vede ke růstový faktor, který aktivuje expresi genu hedgehog, tvorbě nové končetiny aplikace FGF do boku embrya vede ke tvorbě ( Balinsky 1933 ) extra – končetiny ( Arias 2003 ) anterior anterior posterior posterior exprese genu hedgehog exprese genu hedgehog indukce končetiny Exprese homeotických genů v pupenu křídla kuřete Hox-a geny jsou exprimovány podél proximo-distální osy : Hox-a 13 je nejdistálnější Hox-d geny jsou exprimovány podél antero-posteriorní osy : Hox-d 13 je nezadnější RŮSTOVÉ FAKTORY (GF) ŽIVOČICHŮ - PROTEINY produkované určitými buňkami do okolí - řídí RŮST a DIFERENCIACI (morfogeny, onkogeny) - vážou se na TRANSMEMBRÁNOVÉ RECEPTORY, což vyvolává biochemické změny (časté fosforylace, tj. kinázy) vedoucí k aktivaci či supresi specifických genů - tyto metabolické kroky mezi receptorem a cílovými geny se označují jako SIGNÁLNÍ DRÁHA (kaskáda) - známo asi 200 GF: cytokiny, hedgehog, interleukiny, interferony, nervový, epidermální, krevních destiček, hematopoetické, kostní morfogenetický protein (BMP), Wnt (wingless-integrin) S S S S S S O dělení a diferenciaci buněk i tkání rozhodují proteinové morfogeny - RŮSTOVÉ FAKTORY Rita Levi-Montalcini (Itálie 1909) … nervový NGF Nobelova cena ve fyziologii (1986) … za objevy růstových faktorů Stanley Cohen (USA 1922) … epidermální EGF Savci: kompenzace dávky X-vázaných genů Úlohy pohlavnosti v životě eukaryot :  diferenciace zárodečné dráhy a příslušných gamet (včetně tvorby pohlavních orgánů)  pohlavně specifický vývin somatických buněk (pohlavní dimorfismus)  řízení transkripčních hladin chromosomů X (umlčování či zesilování exprese vázaných genů)  metylační nastavení gametického imprintingu záznamu o expresi genů v příští filiální generaci  meiosa a kombinace gamet zajišťují evolučně výhodnou heterozygotnost a variabilitu Evoluce pohlavního chromozomu Y Časně v evoluci se pohlaví lišila pouze v jediném autozomálním lokusu – heterozygotní proto-male a homozygotní proto-female. K zabránění vzniku intersexů dochází k supresi cross-overu a akumulaci mutací kolem male-determinující alely. Nerekominující oblast degeneruje (ztrácí geny), pseudoautosomální oblast zůstává aktivní. KOMPENZACE DÁVKY GENŮ (hermafrodit) V průběhu samičího vývoje se chromozom X podrobuje inaktivaci (R nebo I) a reaktivaci (A). Inaktivace se nejdříve odehrává v časném preimplantovaném embryu (imprinting) a následně v buňkách epiblastu v době gastrulace (náhodná inaktivace). Inaktivní X je reaktivován především v zárodečné dráze. (vlastní embryo) Savci: metylace DNA Adice metylové skupiny do 5-pozice pyrimidinového kruhu cytozinu prostorově nebrání párování bazí (GC). DNA metyltransferázy se v průběhu metylace kovalentně vážou na C-6-pyrimidinu. De novo a udržovací metylace DNA Nemetylovaná DNA se stává de novo metylovanou aktivitou DNA metyltransferáz Dnmt3a a Dnmt3b za vzniku symetrické metylace CpG párů. Po semikonzervativní replikaci DNA je metylováno pouze parentální vlákno a symetrické metylace je dosaženo účinkem udržovací DNA metyltransferázy (Dnmt1). mCpG GpmC Dysfunkce de novo DNA metyltransferázy vede k I(munodeficience)-C(entromerická nestabilita)-F(aciální abnormality) syndromu aktivní umlčený CpG ostrovy jsou oblasti s vysokou denzitou dinukleotidu CpG, které postrádají metylaci. Nacházejí se v promotorech většiny lidských genů. Dlouhodobé umlčení genu může být zajištěno metylací této oblasti: některé imprintované geny, geny na inaktivním chromozomu X, aberantní umlčování genů v nádorových buňkách. Proteiny specificky se vážící na metylovanou DNA (CpG) Pět členů rodiny MBD (methylbinding-domain DNA) proteinů jsou seřazeny podle své konzervativní MBD domény. Jiné domény zahrnují například TRD (transkripční represní doménu) aj. Rettův syndrom je způsoben mutací X-vázaného genu kódujícího 5-mCvazebný protein (transkripční represor)