VÝVOJOVÉ PROCESY U ROSTLIN
(1) rigidní buněčná stěna (celulóza) brání migraci buněk i lokomočnímu pohybu
(2) vývoj ovlivněn environmentálními faktory, vznikají fyziologické i genomové adaptace
(3) formy těla vznikají na základě rozdílů v rychlostech buněčného dělení a buněčným dělením
v odlišných rovinách
(4) veškerý postembryonální růst (včetně tvorby orgánů) pochází z meristémů (kmenové buňky)
(5) nemají pravou zárodečnou dráhu, tranzice vývoje vegetativního na generativní
(6) výrazný regulativní vývoj, mezibuněčnými signály jsou mj. nízkomolekulární hormony
(7) cytoplazmatické kanálky (plasmodesmata) spojují sousední buňky skrze stěny
(8) jedním z mechanismů diferenciace je i asymetrické buněčné dělení
(9) jakákoli buňka dává vznik novému jedinci – totipotence: únik z determinovaného stavu?
(10) dvě nezávislé skupiny strukturně odlišných homeotických genů odpovídají za specifikaci
květních částí (MADS-boxové) a stonku i listů (homeoboxové), kolinearita genů neplatí
Cyanobacteria – pradávní předchůdci řas a rostlin ?
Gen pat5 Anabaena (Nostoc) řídí vývoj
N2-fixující heterocysty
nitrát-bohaté médium nitrát-chudé médium
zvýšená exprese
(inhibitoru) pat5
delece
(inhibitoru)
pat5
… jednobuněčná
zelená eukaryota :
Chlamydomonas
a Volvox
trepky
Chlamydomonas
reinhardtii
• eukaryotická, ale jde s ní manipulovat mikrobiologickými
technikami
• snadná kultivace – fotosyntetická či heterotrofní
• mobilní, vykazuje rysy jednoduchého chování
• lze pěstovat v synchronní či asynchronní kultuře
• má rychlý mitotický cyklus, podrobuje se pohlavnímu
rozmnožování
• propracovaná genetika – jaderné, plastidové i
mitochondriální genomy mají vhodné markery
• všechny tři genomy mohou být transformovány
• dostupné knihovny mutantů a klonů DNA
• možné skladování v tekutém dusíku
Evoluce
mnohobuněčných
organizmů
Chlamydomonas
Gonium
Pandorina
Eudorina
Pleodorina
Volvox
Pandorina
 studium ontogeneze a fylogeneze mnohobuněčnosti a buněčné diferenciace
 základní tělní plán: asi 2000 biflagelátních somatických buněk a 16
asexuálních reprodukčních buněk ( gonidia )
 diferenciace je buněčně autonomní
 centrálním rysem diferenciace je asymetrická mitóza ( cell size determines
cell fate, large vs. small )
 buněčná stěna Chlamydomonas se vyvinula ve strukturovanou extra-celulární
glykoproteinovou matrix, která spojuje buňky do kolonie ( spheroid )
 bičíkaté somatické buňky ( specializované k pohybu, fototaxi a chemotaxi )
se podrobují programované smrti
 neobvyklá kombinace rostlinných ( fotoautotrofie ) a živočišných ( pohyb a
časná diferenciace zárodečné dráhy ) znaků
 pozorování Antoni van Leeuwenhoeka (1700), kultivace in vitro a životní
cyklus - Bill Darden (1966), identifikovány odlišné sexuální formy
 asexuální životní cyklus řízen světlem, trvá 2 dny a vzniká 16 nových jedinců
 izogenní linie
 nepohlavní embryo tvořené na konci rýhování má už své vlastní somatické
a zárodečné buňky
 pohlavní reprodukce je iniciována teplem, které vyvolá syntézu glykoproteinového
feromonu v somatických buňkách: dormantní diploidní zygota
 vrchol „volvocinní“ větve zelených řas, jednobuněčná bičíkatá Chlamydomonas,
koloniální Eudorina a Pleodorina, buněčně diferencovaný Volvox
Vlastnosti modelu váleče
David L. Kirk
St. Louis
Antoni van Leewenhoek
(1632-1723)
asexuální životní cyklus váleče ( Volvox carteri )
- asymetrická mitóza definuje zárodečnou dráhu
- 16 gonidií a asi 2 000 bičíkovců, programovaná smrt
velké buňky malé buňky
gonidia somatické buňky
somatické reprodukční
funkce funkce
regA lag
vypnut vypnut
asymetrická
buněčná dělení
zralé gonidium
symetrická buněčná dělení
32-buněčné embryo
Model řízení diferenciace zárodečné dráhy u Volvox
geny gls způsobují asymetrické dělení vedoucí ke tvorbě velkých (geny lag
zapnuty, regA vypnuty) a malých buněk (regA zapnuty, lag vypnuty)
Acetabularia :
jednobuněčný model
regenerace a
posttranskripční regulace
Acetabularia
acetabulum
reprodukční
čepička
cysty
klidová cysta
klíčící cysta
jádro
konjugace
zygota
2 dny
8 dnů
60
dnů
jádro
rhizoid
verticilie
čepička
Řízení diferenciace na úrovni translace
rozříznutí stonku
RNáza aktinomycin Ddegradace inhibice
mRNA transkripce
odstranění RNázy (neodstranění aktinomycinu)
regenerace regenerace
z fragmentu pouze z
s jádrem enukleované části
Vliv stávající cytoplasmy a syntézy nových
mRNA na morfologii regenerované čepičky
Acetabularia
mediterranea
Acetabularia crenulata
dekapitace
transplantace
rhizoidů s jádry
„vegetativní
hybridy“
chaluha
chaluhy
mnohobuněčné nižší rostliny :
stélka
budoucí
stélka
stěna
vajíčko
bazální buňka
apikální buňka
budoucí
rhizoid
rhizoid
receptákule
(plodnice)
konceptákule
(s gametami)
vzduchové měchýřky
Životní cyklus modelové mnohobuněčné řasy: Fucus spiralis
Fucus :
model
studia
polarity
zygoty
světlo stélka
rhizoid
polarizace
zygoty
A
B
odstranění bazální buňky vede k deleci rhizoidu
zbytky bazální buňky umožňují vznik pseudorhizoidu
gravitace
… vývojové
modely :
jatrovka
Y
n = 8A + X
n = 8A + Y
Marchantia polymorpha
porostnice mnohotvará (dvoudomá)
Mechy – zkrutek ( jednodomý )
Physcomitrella patens
n = 27 chrs, C = 0,46 pg DNA
haploidní „tělo“
cílená integrace genů
zelený model 21. st.
Izolace mutací s fenotypovým projevem
Životní cyklus jednodomého mechu Physcomitrella patens
Didier G. Schaefer
U de Lausanne
2n
n
meiósa
fúze
Ceratopteris richardii
„C-fern“
kapradina rohatec
n = 39 chrs, C = 10 pg
model hormonální sex-determinace (feromon ceratopterin)
homospóry
gametofyt, prokel
(autotrofní, jednodomý)antheridium, pelatky
(samčí pohlavní orgán)
archegonium, zárodečníky
(samičí pohlavní orgán)
obrvená spermie
OPLOZENÍ
oocyt
kanál
GAMETOFYT ( n )
SPOROFYT ( 2n )
zygota
embryo
starý gametofyt
mladý sporofyt list
výtrus-
nice
výtrus-
nice
MEIÓSA
DIPLOIDNÍ SVĚTDIPLOIDNÍ SVĚT
řasy houby mechy kapradiny kvetoucí rostliny
HAPLOIDNÍ SVĚT
krytosemenné rostliny
dvojděložné
Střídání
generací u
krytosemen-
ných
rostlin
ZYGOTA
embryo
(uvnitř semene
a plodu)
rostlina
(stonek, kořen, listy)
květ
samčí tyčinky
samičí pestíky
MEIOSA
mega- mikro-
sporogeneze
haploidní spory
spermie
SPOROFYT ( 2n )
maternální
integumenty
DVOJÍ
OPLOZENÍ
SAMIČÍ GAMETOFYT SAMČÍ GAMETOFYT
buňka
vaječná
( zygota)
centrální jádro
( endosperm)
GAMETOFYT ( n )
Rostliny mají
segmentované
tělo:
FYTOMERY
kořenový
meristem
primární
kořen
boční
PRÝT
KOŘEN
základní pletivo
cévní svazky
semena,
plody
uzlina
internodium
uzlina
úžlabní
pupen
epidermis květ
apikální
meristem
list
Pyl a semena – klidová a dispersní stádia
života rostlin
modulace chromatinu: histon-Ac a cytosin-metyl
(pohádka o Šípkové Růžence)
Hlavní skupiny rostlinných hormonů
pleiotropní účinky, tvořeny v jednom
pletivu a transportovány do jiného
nízká koncentrace, velké účinky
- 6 mg auxinu / 1 kg ananasu
- jehla na 20 metrů krychlových sena
Růstové faktory rostlin či fytohormony
funkce jako stimulátor
- pozitivní či negativní účinek
stejné hormony mohou vyvolávat odlišné
reakce – rozdíly v citlivosti
Řízená organogeneze
ve tkáňové kultuře
tabáku
explantát
živný
agar
žádný růst kalus kořeny prýty
auxin 0 vysoká vysoká nízká
cytokinin 0 vysoká nízká vysokáFolke Skoog
(1908-2001)
ROSTLINNÉ BUŇKY JSOU TOTIPOTENTNÍ
Reprodukce bez sexu - klonování
vegetativní množení in vitro provázeno somaklonální variabilitou
Schopnost haploidie a dihaploidie vylučuje
parentální imprinting ve sporofytu
Apikální dominance řízená auxinem
auxin tvořený v apikálu se
šíří stonkem dolů,
inhibujíce vývin úžlabních
pupenů
koncentrace auxinu klesá
směrem dolů, kde axilární
pupeny se uvolňují z
inhibice a vytvářejí
laterální prýty
apikální meristém dekapitace
inhibice
vývin
vývin
Agrobacterium
Ti-plazmid
bakterie
rostlinná
buňka
T-DNA
bakt. chr.
crown-gall
či
hairy-roots
KONJUGACE MEZI BAKTÉRIÍ A ROSTLINOU ?
rostl. chr.
T-DNA
T-DNA
Koevoluce agrobakterií a rostlin :
genetická kolonizace vs. inženýrství
Mary-Dell
Chilton (1977)
fenolické látky
z poraněné rostliny
Růstové regulátory rostlin s pleiotropními účinky:
cytokininy – hormony dělení buněk a mladosti
Ric Amasino
(Wisconsin 1995)
promotor SAG isopentenyl transferáza
senescence cytokininy
Podivný model – „Ice Plant“
Mesembryanthemum crystallinum
( kosmatec krystalový, 2děložné, ř. Caryophyllales )
- studium abiotického stresu, odolnosti vůči soli, fotosyntézy
- v různých fázích života a za odlišných vnějších okolností mění morfotyp
i fyziologii
- model flexibility
- C = 0,39 pg DNA,
n = 9 chrs
semenáček, fotosyntéza C3,
sukulentní kotyledony,
nízká tolerance k NaCl,
jádra 2C
juvenilní, fotosyntéza C3,
vyšší tolerance k NaCl,
velké primární listy,
jádra 2C-16C
dospělá, přechod fotosyntézy
z C3 na CAM, vysoká tolerance
k NaCl, měchýřkové buňky,
velké primární listy,
jádra 2C-32C
kvetoucí, fotosyntéza CAM,
měchýřkové buňky, vysoká
tolerance k NaCl, malé sekundární
listy, jádra 2C-64C
semena-plodící, fotosyntéza CAM,
jen měchýřkové buňky, vysoká
tolerance k NaCl, žádné listy,
jádra 2C-256C
epidermální měchýřkové buňky
(epidermal bladder cells)
jádra 256C
dospělá rostlina
po 2týdenním solném stresu,
dosud velké primární listy
John Cushman, Nevada
dospělá rostlina
po 5týdenním solném stresu,
tvoří úzké sekundární listy
Craterostigma
plantagineum
(Scrophulariaceae,
dvojděložné)
- studium tolerance
k desikaci
(znovuvzkřížení)
květ gametogeneze
a oplození
K
C
A
G
pylové zrno
pylová láčka
vajíčko
embryo
embryogeneze
semeno
klíčení
semenáček
hypokotyl
kořen
lístky
děložní
růst a
zrání
týdny
Arabidopsis
thaliana
Vývoj zygoty a časná embryogeneze
krytosemenných rostlin …
zygota bazální
buňka
terminální
buňka
základ
embrya
suspenzor
časné
embryo
suspenzor
globulární stádium stádium
stádium srdce torpéda
hypofýza
děložní
kořenový prýtový lístky
meristém meristém
… embryogeneze
Uspořádání rostlinného embrya
radiální symetrie vznik osy a bilaterální symetrie
globulární stádium
stádium srdce
protoderm
základní meristém
prokambium
osa
prýt - kořen
kotyledon
prýtový
meristém
prokambium
kořenový meristém
Signální systémy
v časné embryogenezi
rostlin
signály
z (vlastního)
embrya
potlačují
embryonální
vývoj
v buňkách
suspenzoru
signály
ze suspenzoru
podporují
embryonální
vývoj
oktant globular srdce torpédo
semenáček
prýtový meristém
kotyledony
kořenový meristém
hypokotyl
kořen
„ Osudové mapování “ embrya: již od globulárního stádia
je možné rozlišit tři hlavní oblasti podél A – B osy
1
2
3
mutace ovlivňující tvorbu základní osy embrya
Geny embryonálního
vývoje rostlin :
mutace způsobují
deleční vývojové typy
podél apikálně-bazální
osy embrya
(analogie s geny
velkých mezer
u drozofily ?)
Apikální
meristém (M)
a základy
listů (L)
Arabidopsis :
meristém má
trojvrstevnou
strukturu,
vrstva L1 a L2 (tunica)
mají rovinu dělení
antiklinální,
corpus L3 má
roviny různé
listové primordium
tunica
corpus
kolmé ekvatoriální
roviny dělení
buněk pláště
L1 a L2
Charakter (kmenových) buněk prýtového meristému je
určován antagonistickými účinky genů :
- Shootmeristemless a Wuchsel potlačují diferenciaci
a zajišťují proliferaci meristému
- Clavata3 naopak stimuluje diferenciaci
WT mutace STM
kmenové buňky
centrálního meristému
list list
diferenciace
diferenciace
(Kathy Barton,
Stanford)
Rostlinné
meristémy
jsou
schopny
regulace
odstranění špičky meristému vede k regeneraci
původního meristému
listové primordium
nový meristém
odstranění celého meristému vede ke tvorbě
nového meristému na novém místě
Regenerace u rostlin je POLARIZOVANÁ :
izolované části stonku regenerují vždy
- kořeny z bazální části řezu a
- stonek z nejbližšího pupene k apikální části
vrstva
meristemu
L 2
( i )
květen-
ství
1
2
34
5
6
7
8
„Osudová mapa“
embryonálního prýtového
meristému Arabidopsis
- vývoj meristému je závislý
na signálech z rostliny
- rostliny se vyznačují výrazným
regulativním typem vývoje
gene FWA = suppressor of flowering
Gen LEAFY řídí tranzici vegetativního růstu v kvetení
Detlef Weigel
(La Jolla 1995)
Genetické řízení procesů vývinu květů
vegetativní meristém
krok 1
květní geny
př. Embryonic flower
meristém květenství
krok 2
geny meristémové identity
př. Leafy
květní meristém
krok 3
katastrální geny
př. Superman
tvorba květních
orgánových primordií krok 4
homeotické geny
př. Apetala 3
determinace květních
orgánových primordií
KVĚT: komplex reprodukčních orgánů krytosemenných rostlin
pylová zrna
blizna (G) – W4
prašník (A) – W3
nitka
koruna (C) – W2
čnělka
pylová láčka
semeník
vajíčka
kalich (K) – W1
květní lůžko
stopka
1 2 3 4
pestík
tyčinka
koruna
kalich
1
2
3
4
Johann Wolfgang von Goethe
(1747-1832)
The Metamorphosis of Plants (1790)
… From first to last,
the plant is nothing but leaf …
( … rostlina je složena pouze z listů, které se vyskytují
v různých tvarech … )
MADS-boxové geny :
alternativní regulátory segmentace a vývoje
M … MCM1 gen kvasinky
A … agamous květní gen Arabidopsis
D … deficiens květní gen Antirrhinum
S … serum response faktor člověka
N … amino-terminální oblast (extenze)
MADS - box … konzervativní 5’-oblast
I … slabě konzervativní vmezeřená oblast
K … kóduje proteinovou doménu podobnou
cívkové struktuře keratinu
C … karboxy-terminální oblast (aktivátor)
Model ABC (1990) květního vývoje … už neplatí,
KVARTETOVÝ model (2000) :wild-typ
kalich koruna prašník pestík
mutant skupiny B
kalich kalich pestík pestík
mutant skupiny A
pestík prašník prašník pestík
mutant skupiny C
kalich koruna koruna kalich
objev dalších MADS-boxových
genů třídy D ( OVULA ) a
E ( SEPALLATA ) … nezbytné
ke tvorbě kruhů 2-4
kalich
koruna
prašník
pestík
Homeotické geny s MADS-boxem řídí
specifitu květních orgánů:
model ABC u Arabidopsis thaliana
 tři skupiny transkripčních faktorů ABC
určují specifitu čtyř květních kruhů K
(kalichu), C (koruny), A (tyčinek) a G (pestíku)
WT mutace A: apetala 2 mutace B: pistillata mutace C: agamous
KCAG (bisexuální) GAAG (hypersexuální) KKGG (samičí) KCCK (asexuální)
Domény účinku homeotických genů ABC
studované s pomocí GUS
Rostliny mají homeotické geny dvojího typu
- MADS-boxové … řídí identitu květních kruhů
- homeoboxové … určují architekturu vegetativních částí
složený list složený list vyššího řádu transgenní rajče
wild-typu u transgenního rajčete bushy
rajčete s chimérickým genem knotted1
fenotyp ( Petroselinum )
Samčí a samičí sporogeneze, gametogeneze a dvojí oplození
u Arabidopsis
MIKROSPOROGENEZE
A MIKROGAMETOGENEZE
- gametofyt je haploidní, vyžaduje specifickou genovou expresi
- představuje střídání životních cyklů, rodozměnu
- model buněčné biologie, asymetrická první pylová mitóza
- generativní buňka je uvnitř buňky vegetativní (Bacillus subtilis!)
- řízený růst a zánik buňky vegetativní (pylová láčka)
- vznik dvou funkčních „souřadných“ spermií (?)
mutant: kvartet zralé pylové zrno
mutant: symetrická
pylová mitóza
mutant :
sidecar
V S
Dvojí oplození u krytosemenných rostlin :
Sergej Gavrilovič Navašin 1898
1p : 2m
1p : 1m
Maternální či paternální exces vedou k narušení
exprese imprintovaných genů v endospermu
Rod Scott
(Bath 1998)
Robert Fisher
(Berkeley 1998)
Leafy cotyledon : klíčový regulátor embryogeneze
* odpovídá za maturaci embrya
( = hlídá spánek Šípkové Růženky ! )
* CCAAT vazebný faktor
wild – type
in vitro záchrana
mutace lec1 (leafy cotyledon)
ektopická konstitutivní exprese
vede k permanentním projevům
embryonálního růstu
Úlohy komplexů
POLYCOMB
v životním cyklu
rostlin
Proteiny skupiny POLYCOMB
- jsou antagonisty (represory) homeotických
genů s homeoboxem či MADS doménou
- specifikují místo účinku homeotických
transkripčních faktorů
Arabidopsis CURLY LEAF versus AGAMOUS
Justin Goodrich
(Edinburgh)
listy
wild-typu
listy mutace clf :
ektopická
exprese květního
genu AG
DŮKAZ TEORIE PARENTÁLNÍHO
KONFLIKTU U ROSTLIN
Řecká tragédie
MEDEA
(431 př. Kr.)
… Medea zabíjí
své děti za
Iásonovu zradu …
Euripides
(480–406 př. Kr.)
Parentální imprinting u rostlin : maternální efekt genu
MEDEA
maternální wt-alela: kontrola
(redukce) embryonální proliferace
Ueli Grossniklaus
(Zurich 1998)
wt
mutace medea
MM / mm
/ ...
pohádka o Otesánkovi,
aneb infanticida
Fenotyp mutace medea
• embryo odvozené z
vajíčka medea
nadměrně roste a
umírá v průběhu
desikace semene
• letalita embrya je
nezávislá na
paternálním
příspěvku a dávce
genu
• embryo vykazuje
zvýšenou buněčnou
proliferaci na úkor
endospermu
DEMETER řídí maternální expresi genu MEDEA
Steve Jacobsen
(UCLA 2002)
DME / DME dme / DME dme / dme
abort
viabilní
GUS GFP
exprese
DME
v centrální
buňce
samičího
gametofytu
(DNA glykosyláza?)
Imprintované geny u rostlin
Gen druh exprese mechanismus funkce
MEDEA Arabidopsis maternální Polycomb remodelování chromatinu
PHERES1 Arabidopsis paternální Polycomb transkripční faktor
FWA Arabidopsis maternální DNA-metyltransferáza transkripční faktor
FIS2 Arabidopsis maternální DNA-metyltransferáza remodelování chromatinu
FIE Arabidopsis maternální ? remodelování chromatinu
AGL80 Arabidopsis maternální ? transkripční faktor
AtFH5 Arabidopsis maternální ? regulace aktinu
FIE1 kukuřice maternální DNA-metyltransferáza remodelování chromatinu
FIE2 kukuřice maternální DNA-metyltransferáza remodelování chromatinu
R kukuřice maternální ? syntéza pigmentu
… Oidipovský komplex
APOMIXE
klonování rostlin semeny
z neoplozených vajíček
tvorba hybridů F1
(bez oplození)
(bez oplození)
(s oplozením)
APOMIXE