MECHANIZMY EPIGENETICKÝCH PROCESŮ METYLACE DNA Metylace DNA Adice metylové skupiny (CH3) na 5. uhlík cytosinu • Obvykle probíhá pouze na cytosinech 5' vůči guanosinu (CpG) 5-Metylcytosin NH, I DNA metyltransferáza ^ \ N C-CH °~C\N/C H S-adenosylmethionin °^C\N/C H I I H H Epigenetické umlčování nemetylovaný promotor 5' transcnpcni faktor hypermetylovaný promotor CH, CH, CHi 5' hypermetylovaný promotor (kondenzovaný) transcnpcni faktor gen transkripce m RNA gen gen translace 3' protein kondenzace promotoru chromatin 3' umlčení genu DNA metylace cytosine 5-methylcytosine NH2 1 NH2 -► methylation HC N HC6^ i 0 HC ,C=-0 N _1 N _L_ - DNA metylace se vyskytuje na 5-C v CpG dinukleotidech. 5mC obvykle tvoří <1% nukleotidů. - Frekvence CpG je ~5x nižší než očekávaná, což je způsobeno zvýšenou mutací v CpG dinukleotidech. - Tranzice (C-T) se vyskytují 10-40x častěji než v jiných dinukleotidech. - Až 50% bodových mutací v genu p53 v lidských nádorech se vyskytuje v CpG dinukleotidech. - CpG ostrovy nejsou v genomech distribuovány rovnoměrně. - CpG jsou obvykle metylovány v repeticích a 3' oblastech genů a nikoli v CpG ostrovech. - V genomu savců je asi 35 tisíc CpG ostrovů, které bývají umístěny v promotorových oblastech housekeeping genů a tkáňově specifických genů. CpG dinukleotidy jsou palindromatické 5'CpG 3' 3'GpC5' Mutace 5'-metylcytozinu nemohou být identifikovány a reparovány N DEAMINATIQN N^Q cytosine uracil H3C 5 4>^N DEAMINATION 6 , 2 N H3C N N^O 5-methylcytosine thymine Udržovací metylace TCCTAGTCXTTTAOCT T ? T ? . t ? t ? ,. t f t ? ^ 1 1 ' ' ^ Repllcatíon TTTT 3' d^i^..i^ Maintenanc© Mothylasa v? i í iľ t ? r ? 3 TTTT ~"3TTTT DNA metyltransferáza 1 Změny metylace DNA v průběhu vývoje buněk zárodečné dráhy *co o CO CD O H—• CD s(0 a; N primordiální zárodečné buňky doba vývoje V průběhu ontogeneze dochází u savců k rozsáhlým změnám ve stupni metylace cytosinu. V primordiálních pohlavních buňkách dochází k výrazné demetylaci, ve vlastních gametách je metylace opět výrazná (včetně imprintů), v průběhu embryogenéze (in uteró) zase vznikají nové metylační záznamy. Změny metylace DNA v průběhu vývoje savců oocyty blastocysta embryonální linie extra-embryonální linie doba vývoje MODIFIKACE NUKLEOZOMÁLNÍCH HISTONŮ T 7 Ub phosphorylation acetylation methylation (arginine) methylation (active lysine) methylation (repressive lysine) ubiquitylation .if. Me) ART K Q T A RKSTG G K A P R KQ L AT K A A RKS A P AT G G V K K P H H histone H3 T A VKKPH-|hi 79 Ac> Ac> Ac SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLAR - histone H4 1 3 20 i L . Ub GRGKQGGKARAKAKSRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNY - histone H2A 129 aa 119 r. p PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDSKKRKRSRKESYSV - histone H2B yUb 120 Sites of Histone Tail Modifications 135 aa 102 aa 125 aa The amino-terminal tails of histones account for a quarter of the nucleosome mass. They host the vast majority of known covalent modification sites as illustrated. Modifications do also occur in the globular domain (boxed), some of which are indicated. In general, active marks include acetylation (turquoise Ac flag), arginine methylation (yellow Me hexagon), and some lysine methylation such as H3K4 and H3K36 (green Me hexagon). H3K79 in the globular domain has anti-silencing function. Repressive marks include H3K9, H3K27, and H4K20 (red Me hexagon), Green = active mark, red = repressive mark. HISTONOVE KÖDOVÄNI Nejcasteji modifikovane aminokyseliny: R = arginin, K = lyzin, S = serin, Cílem modifikací lyzinu je e-aminoskupina - vede to k neutralizaci jejího pozitivního náboje acefyl-CoA CoA I H M O trkooiUtm aretát V jednom nukleozomu může být acetylováno až 26 lyzinových reziduí lokalizovaných v N-distálních ramenech histonového oktameru - H4 (4), H3 (4), H2A (1) a H2B (4). Nejčastejším cílem modifikací histonů jsou silně bázické aminokyseliny lysin a arginin a-amino □ H-jN-CH-C-OH CH- CH- CH- CH- 8-amino lysin (K) ô-triamino hn ™h 9^ H coo a-amino arginin (R) RNA INTERFERENCE A HETEROCHROMATIN (a) bidirectional (b) inverted repeat (c) aberrant transcription transcription transcription siRNAs Zdroje dsRNA, které funguji jako substrát ke tvorbě siRNA (small interfering) ribonukleázou Dicerajsou spouštěcí umlčování RNA: (a) Obousměrná transkripce popsaná v centromerických repeticích S. pombe (b) Transkripce obrácených repeticí (rostliny, živočichové) (c) Transkripce aberantních RNA, bez sestřihu, s pomocí RNAdependentní RNA polymerázy (RdRP) A.thaliana centromere 180-bp repeats -► ► ►►►»►►►►► LTR » WWWWWVWw 180-bp repeats r v WW WWWW t L1 n *WW 1 \ dsRNA Organizace heterochromatinových oblastí chromozomů - centromera Arabidopsis Centromery jsou složeny ze 180 pb repeticí s vloženými retroelementy. Přímé transkripty jsou počaty z LTR (long terminal repeats) retroelementu, obrácené transkripty počínají přímo v repeticích. acetylované histony active chromatin histon deacetylázy histon- vazebný protein siient chromatin metylace H3K9 Uspořádání heterochromatinu zahrnuje koordinovaný účinek histon-modifikujících enzymů (HDAC, Clr4), histon-vazebných proteinů (Swi6) a je řízen RNAi mechanismem. Deacetylace je následována vazbou Clr4 a metylací H3K9, na ten se váže Swi6. CMT3 AG04 Model úlohy RNA polymerázy IV v RNAi procesu a histon H3 metylaci: RNA pol IV transkribuje metylovanou DNA, RNAdependentní RNA polymeráza z ní dělá dsRNA, siRNA potom směruje celý metyltransferázový komplex k chromozomu. PAMĚŤOVÉ PROTEINY: POLYCOM B a reprimovaného stavu genové exprese (a tím i buněčné diferenciace) po mnoho buněčných dělení. I Cb\\u\'df Mbinory Proteins j PDLYCDJVJB cl TÄJ7J-J ORAX - skupiny klíčových regulátorů vývoje, sktruktury a exprese homeotických genů, vazba na DNA-Polycomb Response Elements H H V* xc 0 H O i N' "c-N c C f H C c N c O H Ö group represory homeotických genů, mutace způsobují „více anteriorní či posteriorní" fenotyp anterior posterior G-mutant dtazofily / St sex comb štandard 3. pár nohou Imunolokalizace paměťových proteinů Polycomb na polytenních chromozomech ze slinných žláz drozofily teorie chromatinové paměti ... Remembering silence ... Proteiny skupiny POLYCOMB - jsou t\mt\í}un\ďíy (r^pra^ory) homšďúckýďn - áj)áoíílJsíJJl ssúďío Úblsúííi hon)BOí\c]Á]/ďn Arabidopsis CURLY LEAF versus AGAMOUS Justin Goodrich (Edinburgh) listy wild-typu listy mutace elf: ektopická exprese květního genu AG 5fc ? VR N2 c I vernalizace CLF Úlohy komplexu POLYCOMB v životním cyklu rostlin oplozením FIE "FIS2Í AG | klíčeni FIE " FIS2 \ 777 ] po oploz Pcifasňíilsi'} j/jjpľjjrjujjrjxj u /ds'íJjj-j : ismiarimlní srtekl íjsnu -M ^ pľJD^/J Ueli Grossniklaus (Zurich 1998) maternální wt-alela: kontrola (redukce) embryonální proliferace endosperm mm/-. mutace medea anteriorní transformace osmého hrudního obratle v žebro mutantu RinglA-/- u myši mutant clf-2 u Arabidopsis má absenci korunních plátků m Homeotické transformace v Polycomb mutantech Polycomb proteiny jsou antagonisty homeoboxových genů (myš) i MADS-boxových genů (Arabidopsis) PAMĚŤOVÉ PROTEINY: TRITHORAX reprimovaného stavu genové exprese (a tím i buněčné diferenciace) po mnoho buněčných dělení TľJ'ihofsĽi group - nkiíyůwfy hoii\zu'ů^Áýzh cjs/jď standard mutace trithorax- ■ „více anteriorní fenotyp" (trupu) ATX-1, homolog genu Trithorax drosoiWy, aktivuje květní homeotické geny (typu MADS) U-.iť Buds Flower Wt atx Wt au Wt au wt atx atx-mutant květ wt-květ SET doména arabisčího genu Tríthorax má metylázovou aktivitu k lysinu 4 histonu H3 genová aktivace založení (segmentační geny) ► udržování ► trxG časné embryo vývoj embrya, larvy, kukly dospélec Regulace transkripce homeoboxových genů Hranice transkripce homeotického genu AbdominalA a ostatních Hox genů jsou založeny účinkem segmentačních genů (velkých mezer, párového pravidla a orientace článků), které rozdělí embryo na 14 identických článků. Stavy exprese a vypnutí Hox genů jsou udržovány trxG aktivátory a PcG represory. HEAT-SHOCK PROTEINY vývojová změna (kanalizace)! Exposing cryptic genetic variation Normal level of Hsp90 (a) Wild-type Drosophila Deformed fore-leg Deformed eye Deformed wing Lowered level of Hsp90 Normal level of Hsp90 restored (b) Wild-type Drosophila Deformed Deformed Deformed fore-leg eye wing Deformed fore-leg Wild-type Drosophila Deformed Deformed eye wing (a) When heat-shock protein Hsp90 is expressed at the normal level, wild-type Drosophila with a normal phenotype develop (indicated by only the wild-type fly being in the white area]. Numerous cryptic variations are suppressed by the buffering action of Hsp90 (grey area), (b) When the level of Hsp90 is reduced by gene targeting, or by drug treatment, or by heat treatment, cryptic variations are no longer suppressed, and mutant flies develop (white area). These mutants can be subject to selection, (c) After several generations of selection (in this case, for flies with deformed legs), mutant flies develop even when Hsp90 is restored to its normal level (white area). Many cryptic variations are again suppressed. Development has been shifted into a new pathway, that is, a change of canalization, in Waddington's terminology. Tobacco Hsp90 as a capacitor of phenotypic variation Christine Queitsch , Todd A. Sangsterf & Susan Lindquist * Department of Molecular Genetics and Cell Biology* and * Committee on Genetics, Howard Hughes Medical Institute, University of Chicago, Chicago, Illinois 60637, Heat-shock protein 90 (Hsp90) chaperones the maturation of many regulatory proteins and, in the Iruitfly Drosophila tnelanogaster, buffers genetic variation in morphogenetic pathways. Levels and patterns of genetic variation differ greatly between obligatorily outbreeding species such as fruitflies and self-fertilizing species such as the plant Arabidopsis thatiana. Also, plant development is more plastic, being coupled to environmental cues. Here we report that, in Arabidopsis accessions and recombinant inbred lines, reducing Hsp90 function produces an array of morphological phenotypes, which are dependent on underlying genetic variation. The strength and breadth of Hsp90's effects on the buffering and release of genetic variation suggests it may have an impact on evolutionary processes. We also show that Hsp90 influences morphogenetic responses to environmental cues and buffers normal development from destabilizing effects of stochastic processes. Manipulating Hsp90's buffering capacity offers a tool for harnessing cryptic genetic variation and for elucidating the interplay between genotypes, environments and stochastic events in the determination of phenotype. ■ ■ USA Hsp90 as a capacitor for morphological evolution Suzanne L. Rutherford*: & Susan Lindquist* * Howard Hughes Medical Institutes University of Chicago, 5 841 South Maryland Avenue MC102H, Chicago, Illinois 60637, USA The heat-shock protein Hsp90 supports diverse but specific signal transducers and lies at the interface of several developmental pathways. We report here that when Drosophila Hsp90 is mutant or pharmacologically impaired, nh(=rintv/nir uariatinn afterttina n^arlu anw adult ic nrnrlu<-^H iniith tnpHfir: variants H^npnrlinfi nnthf> ripnptir: Ler plánt on GDA Ler plánt no GDA Různorodé abnormální fenotypy způsobené kultivací na geldanamycinu 0 11 CH3o n 0 2 V ÍCH30 c CH3(X OH NH2 Queitsch etal (2002) Náture 417:618 Fenotypová variabilita specifická pro rekombinantní inbrední linie No GDA, 22 °C__GDA, 22 °C _27 °C extrémní kroucení hypokotylu, kořeny rostou do vzduchu zkroucené rozety, vertikálně orientované listové čepele akumulace fialového pigmentu četné kořenové vlásky zkroucené hypokotyly, rozety na ploše média malformované pravé listy Queitsch etal (2002) Nature 417:618 Vývojové abnormality drosofily způsobené deficiencí Hsp90 Reparační úlohy Heat Shock proteinů enzymatická renaturace random coil nativní forma