Metody studia epigenetických jevů
- analýza genové exprese:
Northern, in situ hybridizace,
RT-PCR, microarrays
- analýza metylace DNA:
restrikční enzymy, nukleázy, Southern,
genomové sekvenování
- analýza modifikací histonů:
Western, imunobarvení,
chromatinová imunoprecipitace
- aplikace inhibitorů modifikujících enzymů
Metody studia epigenetických jevů
- analýza genové exprese:
Northern, in situ hybridizace,
RT-PCR, microarrays
- analýza metylace DNA:
restrikční enzymy, nukleázy, Southern,
genomové sekvenování
- analýza modifikací histonů:
Western, imunobarvení,
chromatinová imunoprecipitace
- aplikace inhibitorů modifikujících enzymů
Dle WoS práce citována 1.771-krát
Originální práce o Northern-blottingu :
Duplikativní přenos MADS-boxového genu
z autozomu na chromozom Y
Detekce exprese (mRNA) genu na histologickém preparátu
autozomální kopie
exprimovaná v petalech
SlAP3
Y-vázaná kopie
exprimovaná v tyčinkách
žádný homolog genu SlAP3
se nevyskytuje na X-chromozomu
Imunodetekce morfogenů (proteinů) kódovaných larválními vývojovými geny
v embryogenezi drosofily (whole-mount approach)
1 cm
transgenní
ryba
(Danio rerio
zebřička)
Reportérový
gen z medúzy
- „green
fluorescence
protein“
Metody studia epigenetických jevů
- analýza genové exprese:
Northern, in situ hybridizace,
RT-PCR, microarrays, imunohistologie
- analýza metylace DNA:
restrikční endonukleázy, Southern, PCR,
genomové sekvenování
- analýza modifikací histonů:
Western, imunobarvení,
chromatinová imunoprecipitace
- aplikace inhibitorů modifikujících enzymů
METYLACE DNA lze studovat
na základě :
(a) metylačně sensitivních restrikčních
endonukleáz,
(b) siřičitanového působení na DNA, které
deaminuje cytosin na uracil,
(c) chromatinové imunoprecipitace s využitím
protilátky vůči metyl-cytosinu
METYLACE DNA lze studovat
na základě :
(a) metylačně sensitivních restrikčních
endonukleáz,
(b) siřičitanového působení na DNA, které
deaminuje cytosin na uracil,
(c) chromatinové imunoprecipitace s využitím
protilátky vůči metyl-cytosinu
C/mCGG CmCGG
štípe neštípe !
DNA izolovaná z hypometylované rostliny štěpená enzymem HpaII
citlivým na CmCGG metylaci (Southern blot)
kontrola
Restriktáza MspI
štěpí jadernou DNA
bez ohledu na metylaci
cytozinu na menší
fragmenty
Restriktáza HpaII
je metylací cytozinu
blokována,
výsledkem jsou jen
velké fragmenty DNA
CG mCG
(e.g., HpaII)
reference
(control)
(no CCGG)
(CCGG or CmCGG)
(HpaII)
Podle WoS práce citována 31.304-krát !
Technika značení DNA sondy multiprime primingem …
Dle WoS citováno 21.171-krát
Technika značení DNA sondy nick-translací …
Dle WoS citováno 11.668-krát
Nobelova cena 1980
(1) DNáza I udělá v DNA „zářezy“
(2) DNA Pol I (má 5‘-3‘ exonukleázovou
a 5‘-3‘ polymerázovou aktivitu, včleňuje
nové (značené dNTP) nukleotidy
(1) denaturace DNA
(2) vazba náhodných oligonukleotidů
(3) Klenow (DNA Pol) dosyntetizovává
druhé vlákno se značeným dNTP
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
METYLACE DNA lze studovat
na základě :
(a) metylačně sensitivních restrikčních
endonukleáz,
(b) siřičitanového působení na DNA, které
deaminuje cytosin na uracil,
(c) chromatinové imunoprecipitace s využitím
protilátky vůči metyl-cytosinu
NaHSO3 =
hydrogensiřičitan sodný
Aplikace hydrogensiřičitanu
sodného na vzorek DNA
při vysokém pH
NaHSO3 =
hydrogensiřičitan sodný
Kontrolní vzorek DNA indikuje pozice nukleotidů – sekvence bez siřičitanového působení
Stejná DNA po působení siřičitanu ukazuje tranzice všech cytosinů v uracil (tymin)
Nezbytná kontrola tranzice všech cytosinů po působení siřičitanu
Genomové sekvenování (po aplikaci siřičitanu) ukazuje tranzice
cytosinu v tymin, zatímco metylovaný cytosin je rezistentní
a projeví se jako cytosin
… původní sekvence DNA
... po genomovém sekvenování
Methylation-Specific Oligonucleotide
Microarray (MSO)
A new high-throughput methylation analysis method … využívá
techniky siřičitanové konverze C-T v analyzovaném vzorku DNA a
jeho následnou (chipovou) hybridizaci na komerčně připravené
oligonukleotidy markerových genových sekvencí
Alexander Olek, EPIGENOMICS AG
C T
mC C
Oligonucleotide-Based
Hybridization Microarray
Oligonucleotide microarray for detecting single nucleotide
polymorphisms and gene mutations
GATTCGGAATTCGTACGGCGTTC
GATTCGGAATTTGTACGGCGTTC
Methylation-Specific Oligonucleotide
Microarray (MSO)
Test DNA
m
CG
Reference DNA
m
CG CG CG
Bisulfite treatment
and PCR
CG CG TG CG
GC
CG
GC
AT
CG
AT
CG
c
3’ end-labeling with Cy3 or Cy5
and co-hybridized on the chip
TG
METYLACE DNA lze studovat
na základě :
(a) metylačně sensitivních restrikčních
endonukleáz,
(b) siřičitanového působení na DNA, které
deaminuje cytosin na uracil,
(c) chromatinové imunoprecipitace s využitím
protilátky vůči metyl-cytosinu … kvantifikace
metylace na DNA přímo izolované z genomu …
MeDIP (methylated DNA immunoprecipitation)
copuled with comparative genomic hybridization
(CGH) microarray
KOMPENZACE DÁVKY GENŮ VÁZANÝCH NA
CHROMOZOM X U ROSTLIN ?
DNA metylace
studovaná pomocí
imunochemického
barvení
Metody studia epigenetických jevů
- analýza genové exprese:
Northern, in situ hybridizace,
RT-PCR, microarrays
- analýza metylace DNA:
restrikční enzymy, nukleázy, Southern,
genomové sekvenování
- analýza modifikací histonů:
Western, imunobarvení,
chromatinová imunoprecipitace
- aplikace inhibitorů modifikujících enzymů
HISTON H4 ACETYLACE CHROMOZÓMŮ
Heterochromatické chromozomy Y Rumex acetosa
jsou H4 hypoacetylované
Podle WOS práce
citována 500-krát
Podle WOS práce
citována 7.186-krát
Dynamika H4 acetylace
v průběhu klíčení semen S. latifolia
Western-analýza na AUT gelu
Metody studia epigenetických jevů
- analýza genové exprese:
Northern, in situ hybridizace,
RT-PCR, microarrays
- analýza metylace DNA:
restrikční enzymy, nukleázy, Southern,
genomové sekvenování
- analýza modifikací histonů:
Western, imunobarvení,
chromatinová imunoprecipitace
- aplikace inhibitorů modifikujících enzymů
cytidin 5-azacytidin
(inhibitor DNA metyltransferáz)
1`
2`3`
4`
5` 1 2
34
5
6