Epigenetické mechanismy u rostlin
Úvod – srovnání rostlin a živočichů
Klasické epigenetické systémy:
transpozony, paramutace, nikleolární dominance
Transgeny a viry zprostředkované umlčování genů
Epigenetika ve vývojových procesech
Epigenetické monitorovací markery u rostlin
Exprese genu dihydroflavonol reduktázy (DFR) je požadována ke tvorbě
tmavočervených květů, zatímco umlčování jeho promotoru dává vznik
variegovanému světlému zbarvení – Petunia hybrida
umlčení
expresní
chiméra
Epigenetické monitorovací markery u rostlin
Arabidopsis thaliana
sója
Exprese genu chalkon syntázy (CHS)
vede ke tvorbě tmavých semen,
umlčení promoru CHS
způsobuje světlé zbarvení semen.
V kultivovaných varietách sóje je
barva semen obvykle světlá díky
přirozenému post-transkripčnímu
umlčování CHS genu.
Částečná reverze nastává po infekci
rodičovské rostliny virem nesoucím
PTGS supresor.
umlčení
Epigenetické monitorovací markery u rostlin
Klasický model Zea mays,
kukuřice:
Gen B1 odpovídá za červenou
pigmentaci, rostliny s paramutovaným
B‘ jsou zelené.
Klasy se segregující inzercí
transpozonu Spm v genu B-Peru
požadovaném pro antokyanový
pigment. Červená zrna jsou
revertanty, ve kterých je Spm
z genu excizován.
Epigenetické
monitorovací
markery u rostlin
Klasický model tabák,
Nicotiana tabacum:
NPTII
Epigenetické mechanismy u rostlin
Úvod – srovnání rostlin a živočichů
Klasické epigenetické systémy:
transpozony, paramutace, nukleolární
dominance
Transgeny a viry zprostředkované
umlčování genů
Epigenetika ve vývojových procesech
Cyklická aktivita transpozonů
Barbara McClintock Nina Fedoroff Rob Martienssen Tim Bestor
(1902–1992) (Pennsylvania 1993) (Cold Spring 2001) (NY 1998)
DNA metyltransferázy zajišťují stabilitu genomu
inaktivací parazitických mobilních elementů
Ektopická inaktivace dihydroflavonol-reduktázového genu (šíření metylačního umlčování)
z transpozonu MuLE (bílé sektory v koruně Ipomea purpurea, povojník, svlačcovité)
Ektopická aktivace metastabilních epialel pro světlé skvrny (hcf109) a nekrotické leze (les28)
způsobená aktivním Mutátorovým transpozonem
Vliv transpozonů na genovou expresi (přilehlých oblastí chromozomů)
metylace
Jurek Paszkowski
U of Geneva
Paramutace
PARAMUTACE
(ne) stabilně dědičné alelické interakce
Vicki Chandler
(Arizona)
Alex Brink
(Madison 1956)
Mary Alleman
(Duquesne U)
epigeneticky pozměněná alela R-r!
paramutace
Interalelické komunikace
v lokusu b1 u kukuřice
paramutagenní alela B´ paramutovatelná alela B-I
slabá exprese silná exprese
B´* = paramutovaná alela B´
metylovaná
repetice
nemetylovaná repetice
Mop1,
RNA-dependentní
RNA polymeráza
inzerční mutageneze s reportérem
beta-galaktosidázy
Paramutace fungují i u myší ?
standardní alela Kit (tyrosin kinázový receptor)
Nukleolární dominace
Prof. Michail Navašin (1928)
Crepis capillaris
(differential amphiplasty)
Jadérková dominance
Arabidopsis thaliana x A. arenosa = A. suecica
A. thaliana A. arenosa
aktivní rDNA
jen A. arenosa
hybrid
A. suecica
Nukleolární dominance je způsobována mechanizmy metylace DNA a modifikací histonů
Epigenetické mechanismy u rostlin
Úvod – srovnání rostlin a živočichů
Klasické epigenetické systémy:
transpozony, paramutace, nikleolární
dominance
Transgeny a viry zprostředkované
umlčování genů
Epigenetika ve vývojových procesech
Umlčování genů (kosuprese) transgenem
• Transgeny mohou umlčovat endogenní geny
• Více kopií transgenů, více umlčování
• Zvlášť účinné jsou obrácené repetice
• Umlčené geny jsou často metylovány
• Umlčování může být dědičné
• Umlčené geny mohou být paramutagenní
Transkripční a post-transkripční umlčování
(TGS and PTGS)
• Umlčování může být transkripční, post-transkripční či obojí
• Transkripční umlčování souvisí s metylací promotoru
• PTGS souvisí s metylací kódující sekvence
• Pro počátek umlčování není nezbytná metylace promotoru
• Metylace je nezbytná pro udržování umlčení
PostTranskripční genové umlčování
a RNA interference - spojitost ?
David Marjori
Baulcombe Matzke
(Norwich) (Vienna)
„PostTranskripční genové umlčování se vyskytuje u
rostlin a hub transformovaných cizí nebo
endogenní DNA a má následek v redukované
akumulaci RNA molekul se sekvenční podobností k
introdukované molekule nukleové kyseliny.”
Hamilton and Baulcombe, Science 286: 952, 1999
aktivní
chalkon
syntáza
umlčená
chalkon
syntáza
Metoda VIGS (= virus-induced gene silencing)
jako nástroj ke studiu funkce rostlinných genů
cDNA knihovna
kandidátní gen
klonování genu
do virového vektoru
transformace do agrobakteria,
binární systém
infekce rostlin
poranění
vakuum
injekce
šíření viru,
indukce umlčování
změna fenotypu způsobená
umlčením homologní mRNA
umlčení GFP
primární transformace
agrobakteriálním vektorem
původní trans- rostlina po posttranskripčním
genní rostlina umlčení transgenu GFP
exprimující
zeleně
fluoreskující
protein
injekce agrobakteria obranná reakce rostliny (RNAi),
s virovou a GFP posttranskripční umlčování
sekvencí DNA transgenu
systémové šíření
virové sekvence
UMLČOVÁNÍ TRANSGENU SEKUNDÁRNÍ AGROINFEKCÍ S VIROVÝM VEKTOREM
Nicotiana benthamiana
MECHANISMY RNA
INTERFERENCE
U ROSTLIN
(hlavně posttranskripční
umlčování, ale též transkripční):
miRNA jsou ssRNA obvykle
endogenního původu, závislé
na RDRP a fungují jako přirozené
supresory translace na bázi částečné
homologie s mRNA.
siRNA jsou dsRNA, u rostlin odpovídají
za obranu vůči virům,
štěpí perfektně homologní
mRNA sekvence.
DNA metylace a suprese transkripce
pozorovány
u transgenů
obrácené DNA
repetice
aberantní RNA,
vlásenková struktura
(vnitřní homologie),
exogenní dsRNA
virová ssRNA
RNA-dependentní RNA
polymeráza tvoří dsRNA
Dicer štěpí dsRNA na
kratší fragmenty (si-dsRNA)
small interfering ssRNA
mRNA substrát
RNA-induced silencing
complex (RISC; Argonaut)
potlačuje translaci
nebo štěpí mRNA
Epigenetické mechanismy u rostlin
Úvod – srovnání rostlin a živočichů
Klasické epigenetické systémy:
transpozony, paramutace, nikleolární
dominance
Transgeny a viry zprostředkované
umlčování genů
Epigenetika ve vývojových procesech
Meiotický přenos epigenetického stavu (fenotypu)
aneb environmentální indukce dědičných změn
- genotrofy u lnu (vliv podnebí a hnojení na větvení)
bez hnojení bez hnojení
F1, F2, …
hnojení bez hnojení
F1, F2, …wt
F0
F0
LIN specific sequence
Gagea lutea (Liliaceae)
křivatec žlutý
model studia tetrasporického
zárodečného vaku (Fritillaria),
endospermu a fakultativního
heterochromatinu
5n = 180
Vernalizace
Meioticky NEpřenášený epigenetický
stav ovlivněný prostředím - vernalizace
Metylace DNA a řízení květních procesů
Katastrální gen SUPERMAN
CTATG …… T…….T…….CTTA
CTATG …… C…….C…….CTTA
genomové (siřičitanové) sekvenování
clark kent hypermetylovaná
alela genu SUP
standardní alela genu SUP
(nemetylovaná)
Proteiny POLYCOMB
Úlohy komplexů
POLYCOMB
v životním cyklu
rostlin
Proteiny skupiny POLYCOMB
- jsou antagonisty (represory) homeotických
genů s homeoboxem či MADS doménou
- specifikují místo účinku homeotických
transkripčních faktorů
Arabidopsis CURLY LEAF versus AGAMOUS
Justin Goodrich
(Edinburgh)
listy
wild-typu
listy mutace clf :
ektopická
exprese květního
genu AG
Parentální imprinting u rostlin : maternální efekt genu
MEDEA
maternální wt-alela: kontrola
(redukce) embryonální proliferace
Ueli Grossniklaus
(Zurich 1998)
wt
mutace medea
MM / mm
/ ...
pohádka o Otesánkovi,
aneb infanticida
Irreversibilní demetylace genu MEDEA
v samičím gametofytu Arabidopsis
(konvergentní evoluce se savčím imprintingem)
udržovací metylace DNA
umlčený gen MEDEA
vegetativní fáze
vývoje
embryo
dvojí oplození
spermie
vaječná buňka centrální buňka
samičí
gamety
demetyláza
založení exprese MEDEA v endospermu
DEMETER řídí maternální expresi genu MEDEA
Steve Jacobsen
(UCLA 2002)
DME / DME dme / DME dme / dme
abort
viabilní
GUS GFP
exprese
DME
v centrální
buňce
samičího
gametofytu
(DNA glykosyláza?)
Imprintované geny u rostlin
Gen druh exprese mechanismus funkce
MEDEA Arabidopsis maternální Polycomb remodelování chromatinu
PHERES1 Arabidopsis paternální Polycomb transkripční faktor
FWA Arabidopsis maternální DNA-metyltransferáza transkripční faktor
FIS2 Arabidopsis maternální DNA-metyltransferáza remodelování chromatinu
FIE Arabidopsis maternální ? remodelování chromatinu
AGL80 Arabidopsis maternální ? transkripční faktor
AtFH5 Arabidopsis maternální ? regulace aktinu
FIE1 kukuřice maternální DNA-metyltransferáza remodelování chromatinu
FIE2 kukuřice maternální DNA-metyltransferáza remodelování chromatinu
R kukuřice maternální ? syntéza pigmentu
… Oidipovský komplex