Fyziologie rostlin 16 GENETICKÁ PODMÍNĚNOST FYZIOLOGICKÝCH PROCESŮ Boris Výskot Rostliny představuji velmi různorodé skupiny organizmu, které mají řadu jedinečných fyziologických, vývojových a reprodukčních procesů. I kdy?, se jedná z morfologického hlediska o organizmy poměrné jednoduché, jejich molckulárnčgenetíťké procesy jsou podobné komplexní jako u živočichů. Rada obecných zákonitostí genetiky eukaryotických organizmu byla poprvé popsána praví ti rosil in. Z mnoha příkladů lze jmenovat základní zákony klasické genetiky objevené J. G. Mendelem u hrachu nebo objev mobilních genetických elementů popsaný B. McCIintockovou u kukuřice. Vzhledem k vysoké schopnosii regenerace a relativní snadnosti experimentální manipulace sc rostliny staly v průběhu posledního desetiletí vyhledávaným modelovým objektem bunečných a molekulárních biologů. Genetická informace je u rostlin, podobně jako u jiných eukaryotických organizmů, lokalizována především v chromatinu buněčného jádra, Rostliny jsou však výjimečné mezi ostatními skupinami vyŠSích organizmů skutečností, že jejich genom je tripartitní: genetická informace je přítomna nejen v jádře a v mi-tochondriích (jako u jiných eukaryotických organizmů), ale i v plastidech. Nositeli genetické informace jsou nukleové kyseliny: informace spořívá v tripleto-vém uspořádání Ctyf základních nukleotidů v molekulách DNA, které určují pořadí aminokyselin v bílkovinných řetězcích. Tento tzv, tripletový genetický kód je tétnéř univerzální pro všechny známé organizmy a je tak výchozím předpokladem pro aplikace technik genového inženýrství. Sled základních reakcí genetického aparátu (replikace, transkripce a translace) lze dnes provádět též in vitro s použitím příslušných komponent z bakteriálních, rostlinných nebo živočišných buněk. Klíčový význam pro rozvoj genového inženýrství míly zejména objevy bakteriálních restrikčních endonukleáz (štěpících DNA podle její specifické nukleotidovč sekvence), DNA-polymeráz (které kata! y zují syntézu ■ komplementárního druhého vlákna podle jednořetěz-cové matrice DNA) a iigáz (schopných spojovat řetězce DNA nebo jejich fragmenty) a virové reverzní transkriptázy (která může zpětně přepisovat jedno-vláknovou mRNA od 3'-konce a vytvořit komplementární vlákno cDNA). Mezi techniky, které nej výraznejším způsobem rozšířily možnosti manipulací s rekombiriantní DNA, patří především hybridizacc nukleových kyselin na membránách nebo na fixovaných chromozomech in situ, sekvenování (tj. stanovení pořadí nukleotidů v DNA nebo aminokyselin v polypeptidových řetízcích), imunologické metody stanovení specifických proteinů a amplifikace sekvencí DNA pomocí polymcrizové řetězové reakce [ľCR, potymera&e chain reacíitm). 16.1 Struktura rostlinného genomu Většina jaderných genomů vyšších rostlin obsahuje 10* až 10'" párů bází (pb), což jsou hodnoty srovnatelné s jinými cukaryolickými organizmy (tab. ló.I), Nej vyšší zjištěná hodnota činí u některých druhů až 10" pb (např, u jmelí, Viscutn album), nejmenší genom má pravděpodobně huseníěek {Arabidopsis tha-licmct), a to 7, ÍO7 pb. Většina rostlinných genomů obsahuje vysoký podíl opakujících se (tzv. repelilivtiích) sekvencí DNA (viz odd. 16.2.2). U včtších rostlinných genomů (nad 2 pg DNA na haploidní jádro) bývá až 80 % unikátních sekvencí DNA uspořádáno ve formě krátkých délek (obvykle menších než 2000 pb) vme-zcícných mezi krátké bloky repetit i vních sekvencí podobné délky. Krátké jedinečné kódující sekvence jsou obklopeny repetítivními sekvencemi, čímž každému segmentu DNA poskytují unikátní identitu, což může ovlivňovat transkripční aktivitu příslušných genů. Čím je genom menší (pod 2 pg), tím menší je podíl 4.12 unikátních sekvencí íakto organizovaných; v těchto malých genomech bývají unikátní sekvence organizovány ve shlucích (Flavell 1980). Tab. 16.] Srúvťiártf velikosti genomú a priblif.nc' frakce repetitiv-nith sekvenci (v procentech z celkového obsahu jaderného ge-nomul u zástupců růíjiých fylogcnciiekych skupin organizmů -bakterii [E. CstQ, kvasinek (S. itrevlsiae}, rostlin nuhD5cmcn.njeti (borovice. Pintm sp,), dvoudiloíňých (husetifcek, A. ihaliami; tahák. V. fťifrífítíj)i; jmelí, V. album) a jednodt-ioinych (cibule, Ailium sp.. týle. O. sativa; pšenice, T. MSlivum), hmyzu (octomilka, D. mflanogaster) a savců. 0,965. 10* párii hází odpovídíí přibližní jednomu pikogrartui DNA. t>nih. resp. skupina organizmů Množství DNA na 11. ■. i -1 - il'i jádro (pb> Obsah repctilivnich sekvencí DNA (v 1) Mimujadtrrnj DNA (velikost v pb> pla/midy Escherichia OO'-IOY mI 4. 10* 0,1 bakterioťágy (IC-IO-1) pla/midy SSKcAarenjKtt mmwUm 1.6 . I07 ' mitochondrk- finta sp. 4.10"1 >90 Arabidopsif 7.10' 10 tJřnniatw mitochortdric labutím i,s. i90 jil.-Ktuly [14. M?) ÄMiím sp. 2.1010 >65 Otytá wi\« o.v 10» 65 Trilicum aextivtim >75 Druinphila meUuwgailer 1,2. 10" 2(1 mitochondrie 0.6. IQ1) savci 3.10* 60 Jaderný genom vyšších rostlin obsahuje asi 1O4 až 10* sirukturníeh genů, / toho v dospělé rostlině jejich exprimováno jen 5-10%. V různých rostlinných pletivech a buňkách bylo detekováno asi K transkrihované RNA-polyniera-/ou I a transferové geny (tRNA) transknbované s po- mocf RNA-polymerázy III patfí mezi evolučně vysoce konzervativnich geny, které nekódují žádné proteiny, nýbrž RNA tvořící součást genetického aparátu, Podle počtu kopií patří geny pni rRNA mezi vysoce repetitivnf (počet tandemových opakování genů pm rRNA je 1 200-32 000 kopií, tvoří asi 1 % celkové jaderné DNA), i když jejich značná frakce bývá inak-tivnť (Flavell 1986). Nicméně rRNA tvoří více než 90% z celkového množství RNA, neboť rostlinná buňka potřebuje ke své proteosyntéze asi 10 milionů cytoplazmatických rihoz-omů. Vzhledem k tomu, že potřebná kvantita molekul rRNA úzce souvisí s celkovou proteosyntetickou aktivitou buňky, podíl aktivních jícnů pro rRNA se v průběhu onlogcneze mění a variabilní může být dokonce i počet kopií genů pru rRNA (diferenciální amplifikace). 16.1,1.5 Geny kódující proteiny I když rostlinné organizmy jsou podstatně strukturně i funkčně jednnduííí neř živočichové, jejich genomy jsou podobné velké a komplexní a obdobné jsou i mechanizmy jejich funkční regulace. Také obecná struktura rostlinných genů je shodná s živočišnými geny a /.ahrnuje tri základní úseky: vlastní gen kódující Polypeptid a dva oblasti, které jej obklopují, na 5J-konci iniciační (vi/odd. 16.1.1.1) una3r-konci terminační. Temiinační sekvence na 3'-koncích kódujících sekvencí obsahují potyadenylaČní signály, které slouží k posttranskripční modifikaci související sc stabilitou inRNA. V aminoterminální oblasti některých trans-lačních produktů se nacházejí aminokyselinové sekvence, které nemají bezprostřední v/iah k funkci po-lypcpiidů a jsou z nich finální odstraněny, Tyio izv. tranzitní peptidy umožňují membránový transport proteinu do plastidň ticho mitochondrií. Nejlépe prostudovanými geny u rostlin jsou geny kódující zásobní proteiny v semenech, neboť jejich trarskripční a translační produkty lu jsou velmi Četné a navíc mají často rozhodující agronomický význam. Zásobní proteiny bývají klasifikovány na bázi jejich rozpustnosti v rQ/ných rozpouštědlech: u obilovin jsou hlavními zásobními proteiny prolaminy (rozpustné ve vodném roztoku alkoholu), které obsahují až 30 molámích procent prolinu a 40 molárních procent glu-taminu, mají však nízký obsah né který c h esenciálních aminokyselin (např. lyzinu). Určitá imunologická křížová reaktivita u prolaminů kukuřice (zein), ječmene (hordeinj a pšenice (gliadin) naznačuje značnou ho- mologii příslušných genů. Dalšími důležitými skupinami semenných proteinů jsou albuminy (rozpustné ve vode), globulíny (rozpustné v roztocích solí) a glu-teliny (rozpustné v roztocích kyselin nebo al kalií)- Zásobní semenné proteiny jsou kódovány genovými rodinami. Jednotlivé geny v počtu nčkoiika až několika desítek kopií na haploidní genom jsou lokalizovány ve shlucích nebo jednotlivě na různých chromozomech. Obvykle obsahuji.' introny a jejich produkty představují heierolognf skupiny proteinů různé velikosti. 16.1.1.6 Reverzně se replikující sekvence DNA Reverzní transkripce, tj. zpětný přepis genetické informace z RNA do DNA, je současí i rcphkačního cyklu savčích retrovirů a rostlinných kau limo virů; u eukaryoliekých organizmů jde o proces výjimečný. Některé sekvence DNA jaderného genomu se replikují reverzní transkripcí prostřednictvím RNA jako meziproduktu: patří sem koncové úseky chromozomů (telomery) a retroelementy. Telomery jsou specializovanými strukturami na koncích chromozomů, které netvoří nukleozomovou strukturu. Obsahují jednoduchou re petit i vn í sekvenci DNA hohatou na guaninová rezidua. Telomery se replikují pomocí enzymu telo-merázy, ribonuklcoproteinu, který syntetizuje vlákno telomerické DNA podle templátu uvnitř sekvence své RNA-sloíky (Blackburn I991). Druhou skupinou reverzne se replikujících sekvencí DNA jsou retroelementy, u kterých dochází ke transpoziei dceřiných kopií tvořených reverzní transkripcí intermediální RNA. Byly prokázány, podobne jako mobilní genetické elementy replikující se DNA-DNA-cestou, ve vysokém počtu kopií na genom u mnoha druhů vyšších rostlin (Grandbaslicn 1992). Jejich struktura je podobná retrovirům, retroelementy vsak nejsou infekční a nekódují plášťový protein. Je zřejmé, že retroelementy jsou fylogenetický velmi starými strukturami a mohou hrát roli v evoluční adaptaci rostlin. 16.1.2 Mitochondriální genom Mitochondriální genom je u vy&ších rostlin (ve srovnání s mitochondriálním genomem živočichů) extrémně velký a složitý (2.10* až 2,5. 10* pb). Skládá se obvykle z jednoho hlavního {master) chromozomu, 435 který obsahuje veškerou milochondriální genetickou informaĽi a četné repetitivní sekvence, Rekombinuu mezi těmito repetilivními sekvencemi vznikají subgo-iiomové cirkulární (popř. i lineární) chromozomy a plazmidy, v důsledku čehož je mitochondrial™ gc-nom variabilnější než plastidový. Mitochondriální gc-nom je spolu se špecifickými proteiny lokalizován v mítoehondriálním jádře a obvykle obsahuje více kopií chromozomů {Kuroiwa 1982). Milochondrie mají svůj vlastní replikační, transkripění a translační aparát. Jejich geny obsahují introny a po jejich vystřižení dochází ke spojování exonň rozptýlených v mitochon-driálním genomu {trans-splicing). M hoc hond riál ní geny řady druhů rostlin se často podrobují zvláštním posttranskripčním úpravám, které modifikují kódující schopnost mRNA. Mechanizmem, který jcStě není /cela objasněn (jde pravdepodobné o dea trn naci v polici C-6 pyrimídmnvého kruhu). dochází v mRNA ke tvorbé uracil u v místě, kde se původně nacházel cytozin. Tato modifikace mitochondriálních molekul RNA (RNA editing) vede ke zmenám leipletovčho kódu. a tím i k aminokyselinovým zámenám nebo výskytu iniciačních a termtnacních kodonů. Biologický význam procesu editovaní zjevné spočívá v regulaci množství transla-tovatelných mRNA bez de novo syntézy primárních transkriptú. 16.1.3 Plastidový genom Plastidový genom obsahuje obvykle několik desítek až stovek shodných cirkulačních dvouvláknových molekul DNA o velikostí 1,2. 10* ti 1,9.10s pb. Každá tato molekula DNA obsahuje rozsáhlou oblast přítomnou ve dvou kopiích v obrácené orientaci, která nesc operon kódující plastidové geny pro rRNA, Fyzikální mapování plastidového genomu prokázalo jeho vysokou konzervativnost mezi vzdálenými skupinami kry-tosemenných rostlin a řasami, u vyslích rostlin jc téz značná konzervativnost v pořadí genů. Na základč se-kvenování plastidového genomu bylo zjiStČno, že existuje vysoký stupeň homologie mezi plastidový mi a prokaryotickými geny. Tento výsledek potvrzuje hypotézu o cndosymhiotickém původu cukaryolie-kých buněk: plastidy (i mitochondrie) v/.nikly z volně žijících prokaryot, která vstoupila do předchůdců eu-karyolických buněk. Esprese plastidových genů je řízena na úrovni transkripce a translace a je závislá i na posttranskrípčních a posttranslačnícb modifikacích, mezi které patří i editování mRNA podobně jako u mitochoridrií. Plastidové geny obsahují nekódující introny, avšak jejich mRNA nemají ěepičkovou strukturu na 5-konci ani pnlyadcnylaíní signál na T'»konct (Weil 1987). Plastidy sice mají svůj vlastní genom i replikační, transkripění a translační aparát, avšak většina proteinů funkčních v plastidech je kódována jadernými geny, které jsou jako p re kurzorové molekuly translatovány na cyioplazmatických ribozomech a poté importovány do plaslidů. Tylo prekurzory jsou poněkud větší než odpovídající zralé proteiny, neboť obsahují v ami-noterminální části tranzitní peptid, který umožňuje jejich vslup do plaslidů. 16.1.4 Metody izolace genů a mapování genomu Nové metody molekulární genetiky umožňují aplikovat celou řadu strategií při izolaci a identifikaci rostlinných genů. Patří mezi ně předevSfm konstrukce knihoven cDNA z populací izolovaných mRNA (obr. 16.2). Jejich sublrakční hybridizace. kdy jsou srovnávány cDNA-klony připravené z. rů/.ných genotypů nebo orgánů, umožňují izolovat geny, které jsou známé pouze svým ťenotypovým projevem. Cenným nástrojem ke srovnávání příbuznosti genotypů i ke konstrukci vazebných map je polymorfic délky res-trikčních fragmentů DNA (RFLP, restriction frag* ment length polymorphism), detekovaná pomocí hybridizace na membránách se značenými sondami DNA. Polymeráz.má řetězová reakce (PCR) pak umožňuje izolovat a sekvenovat úseky DNA lokalizované mezi dvěma známými otigonukleotidovými sekvencemi. S pomocí oligonukleotidů s náhodnou sekvencí je také možné analyzovat genomovou potvmtirfli a pro vádél mapování genomu (například technikou RAPO, random amplified polymorphic DNA). Identifikaci genů odpovídajících za změněný fenotyp nebo studium specifické genové exprese v různých pletivech a orgánech umožňuje technika srovnáváni radioaktivně značených produktů polymerázovč řetězové reakce (tzv. differential display), tvořených z templářů cDNA připravených reverzní transkripcí /. populace izolovaných polyadenylovaných mRNA (RT-PCR, reverse Transcription PĽR). Při lokalizaci genu v genomu se obvykle vychází z genomových knihoven (obsahujících velké úseky 436 potyA-mftť/A AAAfAj 3' *t=.-i» reverzní Iranskriptázů + dNTP i'---------------------t 5' 5'-----------AAÍfJíJ 3T cDHkmRm-tybrid alkalická hydrolýza mRNA C: s 3 '-vUsankavitým kOfíCB/tt DNA-polyrrwíáza + dNTP restriKCni ond-L-r-Lk CÁ.Ti C: -----------------T Sl-nukleáza 5" V1 L: klcrč jsou iclcklovány na rezistenci k příslušnému antibiotiku. Symboly: mRNA t- cDNA (---), [iki/niid í iwiii, dNTP, dCTP, dňTP - deojtynuklMrtidtrifo&fity, dT - deoxytymidin. 4.57 genomové DNA k lemované v bakteriofágách nebo umelých kvasinkových chromozomech) a z možnosti zjištění chromozomální pozice neznámého genu ve vazbě k ji?, klnnnvané sekvenci DNA, DalsT analýza potom probíhá pomocí hybridizace DNA/DNA a případně i sekvenováním DNA od tohoto nejbližšího známého fragmentu DNA v překrývajících se klonech genomové DNA {t/v. procházení chromozomem, chromozome walking). Proces je ukončen buď identifikací hledaného genu, nebo alespoň, po dosažení nej-bli/sihti niiirkcMi na op.n ne slnuič genu. vymezením genomového úseku, kde je hledaný gen lokalizován. Vypracování postupů pro rutinní vnášení genů do rostlin (transgenoze, viz odd. 16.4) pak poskytuje možnost inzerční transpozonovc mutageneze (gene tagging)'. pomocí agrobakteriálriíeh vektorů a ná-hininc integrace cizorodých sekvencí DNA (například T-DNA nebo mobilních genetických elementů) do rostlinného genomu je možné detekovat jeho strukturní a funkční změny a nakonec prostřednictvím cizorodé DNA jako hybridizační sondy izolovat odpovídající geny. Izolace genu z genomové banky připravené z takto modifikované rostliny je obvykle usnadněna začleněním plazmidového počátku replikace a bakteriálního selekčního genu d n transponované sekvence DNA flzv. metoda píasmid rescue). Pomocí inzerční mutageneze je možné izolovat i rostlinné promotory. V tomto případe je do rostlin vnášen signální gen postrádající promotorovou sekvenci a k jeho expresi tedy může dojít pouze v případě, kdy je integrován za jakýkoli funkční promotor, Prostřednictvím konstrukce chimérických genů vzniklých fúzí izolovaných promotorů se strukturními signálními geny je možné po jejich vnesení do rostlin analyzovat orgánovou a pletivovou specifitu jejich exprese. Detailní metodiky izolace genů a práce s re-kombinantnf DNA lze nalézt v řadů speciálních monografií (například Shaw 1988. Sambrook et al. 1989, Negrotiu a Oharti-Chhetri 1991). 16.2 Strukturní stabilita rostlinného genomu Původní představy naznačovaly, že struktura eukaryo-tického genomu je velmi stabilní a podrobuje se pouze výjimečným stochastickým zmenám, které se v závislosti na selekční výhodnosti mohou fixoval v evoluč- ním procesu. Současné studie víak dokazují, že zejména rostlinné genomy jsou ve stavu dynamické promén li vos t i a podléhají celným přestavbám, někdy i v závislosti na mínícím se vnějším prostředí, 16.2.1 Mobilní genetické elementy Pravděpodobně nejznámejSím zdrojem nestability rostlinného genomu jsou mobilní genetické elementy, objevené v 50. leleeh B, McCIintockovou při studiu chromozomu n ich aberací u kukuřice. Tylo elementy DNA jsou svou strukturou podobné bakteriálním trans-pozonům a způsobují inzerční mutace podle místa své iranslokace (obr. I6.3). Pokud obsahují gen nezbytný pro svůj replikaiivní přenos, transpozázu. jedná se 0 autonomní genetické elementy. Autonomní elementy mají velikost až několika tisíc pb a jsou ohraničeny krátkými repe ti t i vnfmi sekvencemi v obrácené orientaci. Delcccmi v autonomních elementech vznikají ncautonomní elementy, jejichž mobilita musí být zajišťována enzymem produkovaným autonomními elementy. Jedinou podmínkou mobilizace těchto elementů je tak přítomnost terminál n ich obrácených opakování. Mobilní genetické elementy jsou hlavní příčinou dynamicky proměnlivého stavu rostlinného genomu a způsobují spontánní nestabilní mutace 1 chromozómové přestavby (Döring a Starlinger 1986). V kryptickém stavu jsou mobilní elementy fe-notypovč neidentifikovatelné, Mutarilní fenotyp je výsledkem jejich inzerce do strukturních oblastí genů (inaktivace) nebo do regulačních sekvencí (reaktivace inaktlvních, resp. suprese aktivních genů). Mobilní elementy bývají např, vysoce aktivní v buněčných kulturách in vitro z důvodu slresových podmínek kultivace a mohou být odpovědné za četné nestabilní změny v populacích rosllin-regencrantů (jako jedna z příčin tzv. somaklonální variability). 16.2.2 Repetitivní sekvence DNA Repetitivní (tj. opakující se) sekvence lze podle frekvence výskytu rozdělit na skupiny s nízkou četností tlO až I00 kopií v genomu), středně se opakující sekvence (100- až I OOOkrát) a frakci vysoce repetitiv-ních sekvencí DNA (více než 10000 kopií na genom). V některých genomech tyto vysoce repetitivní sekvence reprezentuji až 21)'i- jaderného genomu a tvoří rozsáhlé heterochromatinové oblasti. 438 Podle způsobu uspořádání v genomu delíme repe-titivtií sekvence DNA do dvou hlavních typu. Prvním lypem jsou tandemové sekvence, složené z identických nebo podobných jednotek uspořádaných za sebou v mnoha opakováních, např. satelitní DNA. Délky jejich jednotek se pohybují od nčkolika pb ař po nČkolik tisíc pb a počet kopií dosahuje až milion nagenom. Jsou obvykle lokalizovány ve specifických oblastech genomu. Druhým typem opakujících se sekvencí jsou takové repetice, které jsou v genomu rozptýleny mezi jinými repeticemi a jedinečnými sekvencemi (Flavcll I9H0) Repetitivnf sekvence DNA (jaderné a mitochondriální) představují další významný zdroj strukturní nestability rostlinného genomu, neboť se v průbíhu ontogeneze a fylogeneze podrobují různým typům změn (viz odd. 16.2.3). 16.2.3 Ontogenetická a fylogenetická nestabilita rostlinného genomu Na základě studia reasociační kinetiky DNA bylo zjištěno, že rychlost evoluce repetitivních sekvencí je enormné vysoká, Protože tyto sekvence nebývají ex-primovány a nejsou proto vystaveny selekčnímu tlaku, dochází v nich ke kumulaci bodových mutací. Často jsou pak velké repelitivnť sekvence složeny z podrodin s různou četností opakování. Důkazem značné mobility rostlinného genomu je prokázaný přenos řady plastidových a mitochondriál-ních sekvencí DNA do jádra (tzv. promiskuitní DNA'Lcwin I983). Dnešní organelové genomy nyní naplňují pouze malý podíl svých genetických potřeb, ostatní jsou poskytovány jadernými geny. U vyšších rostlin a kvasinek bylo prokázáno, že fada organelo-vých sekvencí DNA byla po duplikaci stabilně transponována do jádra. Mobilita mezi jádrem a mitochon-driemi, jádrem a plastidy a plastidy a mitoebondriemi není omezena jen na prckambriální dobu, ale jc konstantním a kontinuálním procesem po celou evoluei. U vttšiny eukaryotických organizmů někdy dochází k vícečetné replikaci některých sekvencí DNA ■ amplifíkace genů). Nestabilní (dočasné) amplifíkace DNA provázejí diferenciaci i dediľcrenciaci a mohou být vyžadovány ke specifickým bunečným funkcím (Nagl I990). Původní formulovaná zákonitost konstantního množství DNA na buněčné jádro tak byla objevy somatické polyploidic, transponovatelných elementů a diferenciální replikace DNA nahrazena novou zákonitostí potenciální genomové variability. Tn3-element [Escrtsrichia coU\. transpozázfl promotor - resolváza -> — /J-iaktamáza -> ylc-etement (Zea mays): TAGGGATGAAA-ATCCCTACTTT- transpozáza promotor gen 2 -> -TTTCATCCCTG -AAAGTAGGGAC Ds-element {Zea mays): TAGGGATGAAA-ATCCCTACTTT- mutovaný transpozázový gen promotor gen 2 -TTTCATCCCTG -AAAGTAGGGAC Obr. 16.3 Srovnám struktury mobilních genetických eleincmů u haktcrtí a rostlin. Tni je jedním z ncjlčpe prostudovaných imns pílení; y Eschtrkhiti citti. Obsahuje ifi geny, které r>d povídají m synléiu enzymů, intnspozázy, rcsolvizy (katalyďeují ptenos transpozrinii r. jednoho místa cirkulárnfho chromozomu nu jiní) 3 /Makiamdzy. která odpovídá za rezistenci bakterie vůči antibiotiku amptcilinu. Ac a l>s jsou zástupci rostlinných mobilních elementů izolovaných z kukurice (Zrcr jJioy.Tj, Ai je Uv. autonomním elementem, neboť nc-sc gen pro transpi>rjzu umožňující jeho mobilitu v rostlinném jaderném genomu. Dclctí, popf. jinou mutací v trun-spuz-ázorcni genu vznikají ncau-tonomni elementy typu />.v, jejichž mobilita múze byl zprostředkována enzymem transpozázou, produkovanou v tčže buňce autonomním elementem Ac. Nutným předpokladem mobilizace vícch bakteriálních i rostlinných elementů je přítomnost (nc vidy zcela shodných j ohráccnyth opakováni nukleotidových sekvencí na jejich koncích íu Tni jc tvořeno 38 nukleotidy, ľ uvedených rostlinných elementů obvykle JI nukleotidy), bělky mobilních elementů Titi a Ať jsjhj podobné íasi 5CXXJ pb), elementy ÍH mohou hýl podstatne kralätí. Nčkterč gcnomové změny vznikají následkem vnějších stresových vlivůř jiné jsou součásti normálního ontogenetického programu nebo k nim muže docházel i náhodné. Replikace DNA začíná v eukaryo-tickýeh buňkách na velmi mnoha počátcích (asi několika desítkách tisíc), tento poČĽl je u odlišných druhů rostlin i pletiv a orgánů různý. Jsou sd ražen y v rodinách a každá rodina přitom obsahuje místa, která jsou aktivována ve stejnou dobu. Konstitutivní heterochromatin se replikuje v pozdní fázi S bunečného cyklu a nepodrobuje se procesu crossing-over pfi mció/c WjilhiH a Cul lis (I9HÍ) vyslovili teorii, že genomová flexibilita rostlin je odrazem jejich mimořádné adaptivní schopnosti na měnící se životní prostredí. Příkladem léto flexibility jsou polyploidie, přestavby chromozomů, změny v chromozomálním imprintingu, genové amplifikace a redukce i aktivita transponovatelných elementů. Mechanizmy způsobu-jťcí změny genomu mohou být různé, některé mají programový charakter (např, amplifikace genů s cílem zvýšení kvantity jejich produktu), jiné jsou náhodné (obvykle transpozice mobilních elementů). Snad nejvéiším rozdílem mezi rostlinami a živočichy je neschopnost lokomočního pohybu, u rostlin. Zvířata se mohou přizpůsobovat měnícímu se životnímu prostředí svým chováním, zatímco rostliny lak mohou činit pouze krátkodobými fyziologickými regulacemi nebo dlouhodobí /miniími svého vývoji;. U živočichů je zárodečná linie založena v časném stadiu vývoje, zatímco u rostlin je reproduktivní vývoj zahájen iú. premenou vegetativního prýtového vrcholu v kvetní v reakci na prostředí nebo stárnutí. Tento způsob reprodukce znamená, že u rostlin v podstatě není přítomna zárodečná linie sírictu sťiiso a že gamety jsou tvořeny z mnoha odlišných bunečných linií přítomných v různých květech rostliny. Rostliny jsou podstatní více ml c ran tni vůči chromozomá-lním abnormalitám než živočichové. Příkladem flexibility rostlinného genomu je i obrovská rozdílnost ve velikosti genomu u různých druhů krytosemenných rostli r. Krytosemenné rostliny jsou staré pouze asi 150 milionů let, avšak mají pritom velmi široké rozpětí množství DNA nu jádro, od 0,1 pg až do 100 pg u různých druhů (Bennel a Smith 1976). Savci jsou fylogenetický starí ŕ skupinou organizmů (asi 300 milionů let), ale množství DNA v jádře je u většiny druhů téměř shodné. Rostliny jsou tak výrazným příkladem t z v. paradoxu hodnoty C tedy ztráty korelace mezi množstvím DNA v jádře a komplexitou pří- slušného organizmu, Amplifikace genů indukovaná stresem je považován;* za jeden z nej významnějších faktorů evoluce genomu a tedy i vytváření nových znaků. Názorným příkladem íl e x! bili ty rostlinného genomu jsou rychle, vnějším stresem indukované genetické i epigenelické změny morfologických a fyziologických znaků u Inu, které jsou děděny v řadě pohlavních generací (tzv, genotrofy), 16.3 Řízení procesů diferenciace Procesy pletivové a orgánové diferenciace jsou řízeny kombinatorickou aktivací promotorových sekvencí mnoha genů, která je přísnč regulována časově a místné (Lyndon a Franc i s I992J, Klíčovou roli při (Slíi']vik-::lu mcnsLi-iTL-ik-kých buněk \ orgánové sys té my hraji zejména honu-otiekii gcitv, k [crč kódují transkripční faktory aktivující specifické geny. Proteinové transkripční faktory jako produkty regulačních genii mají d v ú vý/.rtaitiné ohlásit: konzurvativní DNA-vazehnou doménu, která zajišťuje specifuu vazby na regulární sekvenci DNA, a aktivační doménu, která je schopna interagovat s jinými faktory. Dosud známé mutace v homeotických genech mají za nasiali1 k /měnu identity vegetativních nebo květních orgánů. Tvorba květních ítrjjiinu reprezentuje časově poslnupný proces; homeotické geny jsou aktivovány (pravděpodobně prostřednictvím rostlinných hor-mnnů Či jiných efektorů) pouze v určitých pletivech a v určitém období vývoje rostliny a jejich prodá k ty, transkripční faktory, řídí procesy diferenciace aktivací jiných, morfogenelických genů. 16,3,1 Homeotické květní geny Na základě íenotypového projevu jejich mutací jsou homeotické kvílní geny klasifikovány do tří skupin (Schwarz-Sommcr et al. 1990): První .skupina zahrnuje mulace ovlivňující vývoj nebo iniciaci květního primordia. Takové mutantní rostliny netvoří vlastní reprodukční orgány, ba ani k ví mí obaly. Patří sem typy, u kterých mu tamní genové1 produkty interferují s hormonální řízenou tvorbou kvčtního primordia (mutanty steriíis ísteriioides) nebo narušují vývoj primordia po květní indukci (mutace squamata a xquamosa). 440 I) ľ ii h n 11 skupinu humcolických mu t ani ú ivoŕí mutace, klené způsobují zmenu kvetní symetrie. Tak například ľ hledíku, který má květy souměrné pudle jediné osy (zygomoďní). způsobuje mutace c.yc.ioidea tvorbu květů a k vrt n ich orgánů paprsěitĚ souměrných ÍLiktuiomoi hl i'lIi l. Třetí k kup j nu homcolických genů determinuje identitu jednotlivých květních OTgariů a jejich architekturu. Květy mají typické uspořádání svých orgánu ve čtyřech kruzícrr v prvním a druhém vnějším kruhu se vytvářejí kvílní obaly, ij. kališní lístky (sepaly), resp. korunní plátky (peialy). ve třetím a čtvrtém vlastní pohlavní orgány, tj. tyčinky, resp. pestťky (kar-pely). VScchny dosud známé homeolické mutanty této třetí skupiny se vyznačují tím, že jediná mutace ho-meotického genu zasahuje vždy dva sousední květní kruhy a že existuje řada nezávislých lokusú. jejichž mutace se projevují shodným homeotickým fetioty-pem (obr. 16.4). Tak například byly identifikovány geny, které způsobují výskyt pcslíkovitýeh sepal a ty-čmkovttýeh peta! (geny ovulam, mneha, gpetaiáZ), c Obr. 16.4 Kvilní diagramy (příčné řezy) husenföku iAtabidopsii limitám) - ntmtiilnť rostlinu * dva homcotiťkč mulanty. (a) Normální lyp (oboupohlavný kvtlh [t>> mutant inslUista, u nítioč do-.In.-: k muniční korunních plátků v kalií ni lístky a tyčinek v pes-líky (kvil je Iníy jcdnopítfitovný, samicí), (c) mulanl agaiutms. jchoí lyčinky jsou iransfonnovjiny v dsAM kruh korunních pLdlkú a peslíky v kuhšní iísiky (kvil ber. rcpnxlukčníuti orginú). pĽtyloidních tyčinek a sepal oi dníc h pestíků (geny plena, petuiaidea, agamous) nebo sepaloidních peta! a pestíkovitých tyčinek (geny deficizns, ghbosa, pis~ iiliara aj.)- Analýza k Ion ováných rostlinných homeotických genů deftcie.ns a tijtnmnus n jimi kódovaných proteinů odhalila oblast s vysokým stupněm homologic k DNA-vazebný m doménám dvou známých tran-skripčních faktorů u fylogenetický velmi v/d dlených, organizmů, savců {SRF, Strum reapansefactor) a kvasinek (MCMf, mmichromosome mďinteitattce gene). Tato konzervativní oblast je proto nazývána MADS-doménou [MCMi, Agamoux, Deficiens, Stý) a byla později nalezena i u řady jiných rostlinných homeotických genu. Tato srovnání naznačují, že molekulární mechanizmy řízení omogeneze u rostlin a jiných eu-karyot mohou být obdobné. 16.3.2 Duální systém dědičnosti u eukaryotických organizmů U eukaryotických organizmů existují dva systémy dč-d i čnosti, z nichž jeden odpovídá za přenos genetické informace mezi pohlavními generacemi a druhý za přenos informace o expresi genů v průběhu ontoge-neze (Maynard Smith I9TO). První systém je založen výlučně na genetické informaci dané sekvencemi nukleotidů v DN A a řídí se principy mendelovské dědičnosti. Druhý systém, nazývaný cpígcnctickú dř-rliriniM vychází íčř /je základní genetické informace uložené v sekvencích DNA. je v Sak odpovčdný za přenos informace o aktivitě genů v buněčných liniích. Je regulován různými vnitřními a vnějšími faktory a je obvykle doprovázen specifickou modifikací příslušných oblastí chromát i nu. Tyto modifikace mohou byt v určitých případech, zákonitých nebo stochastických, přenášeny i do pohlavního potomstva. Dědičnost epi-gc n etických zmčn neodpovídá mendelovským zákonům klasické genetiky. Například pnramutace(tj. dědičné změny v expresi genů způsobené interakcí a lei), popsané zejména u kukuřice, odporují mendelovské m u principu t> nezávislé slučující a lei. Mendelovy pokusy s hrachem vyústily ve vyslovení principu identity reciprokých křížení. Toto pravidlo neplatí u některých mezidruhových křížení í p uren tál n Ľ dominance) a taktéž u genů, které jsou odlišně exprimo-vány v závislosti na pohlaví rodiče, od klcrého byla příslušná ale la zděděna (pareniaIn i neboli gennmnvý 44 I Tub. Ifi.2 Srovnání a příklady niklcrých cpigenctickych procesů u krytosemenných rusilin a savců. Kryti-Mctnenné rostliny Savci Hpigcnetické procesy narenlální imprinting puu/.c v raeuihíyi >náln íľ h pletivech - Iriploidnf endosperm Q matemální -i- 1 pitrernalui génom) fada genů v . n :■ .. ii.il:. ■ i (krmích, karcinomy di/omickčho původu, projev nuinhj ncrvovýLb chorob v i^lihr: na rodičovském původu kontrola výživy embrya citracmtiryonalni palemjlní iraktivacc X-chromozomu mn/iinM aiulrngrnivc. paneiwgeneze a polyploidic vysoká (pfirnzcnŕ i experimentálni) nemají afclick(í interakce parajnutacc, trarcgcny (fansvekce kuinpenzacc dávky genů nesených pohlavními : In nimmimj lyonizacc X-chromozomu u některých d voudnmých msilin'' lyomzace jednoho samiciho X-ehromozwnu ■ 1 ...k ■ 1 \ .11 1 I.H|\;'i TH.I velmi iaslý jev íustý jev lunkOni 1 popř. geinílicka) huploidie l lin:-|.-l ■. 1 . k.l vývinu, ;■■ ihla* 1 chrnmoznniy u niklerých dvoudornýuh rostlin pohlavní - 11 -1 ■ r 11. i -.. alclická enktuze v huňkikb produkujících imunoglobuliny, tvorbu hupl,minu h jtamci f-.iiinl Mm : 1- -n 111- ;i.ri u meíidruhnvýeh hybridů berný jcv časiý jcv specifická zírala (sad) chromozomu. mcľ/idruhovŕ hybridy ujeämenc hybridní buňky v kulturách rn ritro Mechanizmy mccylacc DNA mctylaec promote v nukleolnlový CC, CNC i nesymetrických >ru intikuT. r.ifii pcirj cli sckvcncich-cg (vzaenřji i CNCi) íasna/pozdni doba replikace DNA časuj replikace aktivních a po/dni I..-J111 k.: l - :.' Iľukliv nich- UiJIli.ilr'.H ý.h diilľjn acetybee nuk leozomových historii! dencetylace nelrjn c hran pf fakuliaiivni heicroctwwwilin v end os permu skribovaných míst ■Um pt. inaktivní X-chromo/uin vtisk, imprinting). Genomový imprinting je tedy definován jako proces, kdy specifická modifikace chro-mulinu game* rodičů v závislosti na jejich pohlaví vede k funkčním rozdílům mezi samčím a samicím genomem v diploidních buňkách potomstva. Zatímco u živočichů (zejména u savců) je genomový imprinting zákonitým jevem, u krylusemenných rostlin byl dosud prokázán pouze v mimoembryonálních pletivech semene, endospermu (tab. 16.2). Tento rozdíl X t- Obr. 16 5 Melafíze {In = 24, XY) v kořenovém menšiemu saimíí rostliny dvoudomŕhti druhu knoLovky bfíi {Mclnncinum nlfnutú U knotovky je s-iímcí pohlaví hctcrogamchckč íi|. v [Jiaíniiícli jmiu tvořeny gamety s Y-chromozomem nebo s X-chromozomcm), za-ifmcti samici rostliny jsou Iwmogameiickc {2a = 24, XX). můře být způsoben zejména skutečností, ze velká vět-äina druhú kryloscmenných rostlin jsou hennafrodiié: vytvářejí oba typy gamet, samčí i samicí, na stejných jedincích. Pouze asi 5 % druhů krytosemennýeh rostlin jsou druhy dvoudomč, které, tvoří oddelené jedince samčího a samíčího pohlaví (Grant et al. 1994). NČ-kieré dvoudomé druhy mají i heteromorfní pohlavní chromozomy (např. knolovka bílá, Meiandrium album, obr. 16,5). 16.3.3 Genomový imprinting u rostlin U krytosemennýeh rostlin dochází po vniknutí pylové láčky do sam i Čího zárodcčnčhrj vaku k procesu Uv. dvojího oplození. Jedna ze dvou samčích gamet oplodní vaječnou buňku, zatímco druhá samčí gameta splývá s centrálním jádrem zárodečného vaku, který u většiny druhů rostlin vzniká fúzí dvou haploidních jader ve slřcdu zárodečného vaku. Na procesu di-ploidní embryogenéze se však podílí jen oplozená buňka vaječná; oplozené dvoujaderné centrální jádro tvoří iriploidní extraembryonální pletivo (endo-sperm), které vyzivuje embryo během jeho vývoje. Genom embrya je ledy tvořen jednou materskou ajed-nou otcovskou sadou chromozomů, zatímco v endo-spermu jsou kombinovány dva mateřské a pouze jediný otcovský genom. Rozsáhlé studie na kukuřici prokázaly, že jestliže je tento poměr genomu v endo-spermu odlišný, embryo abortuje (Kermicle a Allenům 1990), Tyto analýzy též dokládají, že nepřítomnost Otcovských zástupci! osmi z 1° /.koumaných chromozómových ramen způsobuje podstatnou redukci velikosti semene. Tento specifický rodičovský efekt je omezen pouze na endosperm: ve vlastní embryonální linii dosud u rostlin nebyl prokázán. Oddelene oplození tedy zakládá zárodečnou dráhu embrya relativné prostou imprintovaných genů, zatímco geno-mový imprinting je významný pro vyživovací funkci mimocmbryonální buněčné linie, vzniklé druhým oplozením. 16.3.4 Mechanizmy epigenetických procesů Ačkoli mechanizmy nejsou dosud zcela vysvětleny, je zřejmé, že v epigenetických procesech, které odpoví-dají za funkční plasticitu genomu, hrají rozhodující úlohu metylace DNA, kínefikn replikace DNA a struktura chromatínu. Je dokázáno, že metylaec DNA (zejména cytozinu, obr. 16.6) negativně ovlivňuje expresi genů u většiny eukaryotických organizmů (Jost a Saluz 1993). Zatímco v jaderných ge-nomech savčích druhů je metylováno asi jen 8 % N .c C ti + S-adenoz^-L-melionin i DNA-m«tyitran«i»ráiá ^ Ľ\ H cytozin 5-metylcytozin Óhr lft.Ci Modifikace cyto/inij mdylací v polový C-S pyrimidino-vchu kruhu. Reákct jŕ VAlíAyia-vú&ä. DNA-nu.-IyllrjnsfťiiŕLju a di>-Hftn mctyluví skupiny je S-adenn/yl-i.-mciionin. cylozinových bází, u rostlin dosahuje tato hodnota až 30 %. Vysoký stupeň metylace rostlinných genomu jc zpusolien především značným nh^ahettl hypmiiety lovaných repetit i vních sekvencí (až 90 % genomu). Navíc jc rostlinná DNA metylována v sekvencích CG, CNG (kde N je jakákoli báze) i v nesymetrických sekvencích DNA, zatímco v genomech obratlovců se metylace cytozinu vyskytuje téměř výhradně v duble-tech CG. Genomy obsahují výrazné hypermetylované i hy-pometylované oblasti: hypermetylované domény zahrnuli rcpclilivní sekvence DNA (heterochromatin), které se nepodrobují procesu crossing-over při meió-ze, zatímco hypomelylované domény (tzv. hypomcly-lované ostrůvky) jsou rekombinačně aktivní a představují především konstitutivně exprimované geny. V některých výjimečných případech, jako je inakti-vace (lyonizace) jednoho ze dvou pohlavních X-chromozomů v samicích buňkách savců (kompenzace dávky genů nesených tímto chromozomem), dochází k hypermetylaci celého chromozomu (Grant a Chap-man 1988. Výskot et al 1993). Metylace cytozinu se pří mitotiekém dělení buňky dědí pomocí udržovacích DNA-metyltransferáz. Znamená to, že tyto metylázy rozpoznávají hemimelylovanou DNA, vznikající se-mikonzervativní replikací, a metylují nová, dceřiná vlákna DNA. Tento mechanizmus tak poskytuje molekulární základ pro buněčnou dědičnost specifických genových aktivit v průběhu individuálního vývoje, /měna metylace může vést k dědičným abnormalitám v expresi genů, které nazýváme epimutacemi (Holli-day 1990), Nejčastěji užívaným činidlem k cjipcri-mcntální indukci změn metylačního stavu DNA je 5-azacytidin, který může být do DNA včleňován na místo cytozinu nebo metylcytozinu a blokuje meiy-laci DNA kovalentní vazbou do aktivního centra DNA-metyltransferáz. Metylace promotorových úseků genů jsou často spojeny s jejich inaktivací a jsou orgánově specifické. Bylo též prokázáno, že metylace DNA jsou zodpovedné za aktivaci a inaktivací rostlinných mobilních genetických elementů a vnesených cizorodých genů (viz, odd. 16.4.4). Metylace může inhibovat genovou expresi tím, že brání vazbě specifických proteinových transkripčních faktorů, například vazbou mclyleytozin-spccifických proteinů. Ačkoli role metylace cytozinu v inaktivaci genů je evidentní, je pravděpodobné, že metylace DNA není příčinným, ale spise sekundárním procesem, který zajiSfujc přenos iníormacc o aktivitě genů (epigene- 443 lieké informace) v průbčhu buněčných delení (Lnek et al. 1987), U msti i ti dochází k přeměně apikálního meristému / vegetativního stavu na generativní (indukce kvetení) v závislosti na faktorech vnějšího prostředí, zejména na svetle a teploté. Některé rostliny vyžadují k indukci kvetení chladoví působení, tzvr jarovizaci, Ja-rovfzMe je typickým epigenctiekým procesem, který je omezen na jedinou pohlavní generaci; nepřenáší sc do pohlavního potomstva. Burn et al, (1993) prokázali, re chladové působení navozuje rozsáhlé snížení hladiny metylcytozinu v rostlinném genomu a současné demonstroval i, že předčasné kvetení lze navodil i pomocí hypometylaíní látky, 5-azacytidinu. Homco tieké geny, které řídí tvorbu květních orgánů (v 17. odd, 16.3.1), jsou zvláště citlivé na regulaci exprese prostřednictvím metyl Líce cyto/.inu. H\pcrimentální hy-pometylace rostlinného genomu (navozená aplikací 5-azacytidinu nebo prostřednictvím protismyslného genu k DNA-metyltransferáze) vede především ke zménám identity květních kruhů a kc snížen( samčí 1 samicí fertility (Výskot et al. 1995, Finnegan et al. 1996). Klíčová úloha metylace DNA v procesu determinace pohlaví byla prokázána u dvoudomé rostliny knotovky bílé, kde aplikace 5-azacytídinu vedla u samčích rostlin k pohlavnímu zvratu: byly zde aktivovány geny odpovědné za tvorbu pestťků, a lak navozen vznik oboupohlavných květů. V tomto případe Slo o epigenetiekou změnu jednosměrně dědičnou: byla přenášena do pohlavního potomstva pouze tehdy, kdy oboupohlavná rostlina byla v křížení použita jako pylový donor (JanouSek et al. 1996). Během dlouhodobé kultivace rostlinných pletiv in vilro, které ke svému růstu vyžadují aplikaci exogen-ních auxinů acytokininň, občas dochází ke spontánní Ztrátě potřeby uvedených rostlinných hormonů. Tento klasický epigenelický jev se nazývá hab i tunu a je způsoben aktivací rostlinných genů účastnících se bio-syntézy hormonři (Moins 1994). Habiluace na rostlinné hormony fauxiriy nebo cytokininy), i když je potenciálni reverz ibilní, je ve vysokě Inek venci mitolicky udržována v kultivovaných buněčných liniích. Habilitované buňky svou schopností autonomní proI iterace připomínají rostlinné buňky nádorové, kieré mohou být iniciovány růdnými patogenními organizmy (napr. bakteriemi, hmyzem nebo houbami) nebo se objevují u některých hybridů „spontánní" jako důsledek určitě kombinace alel (tzv. genetické nádory). 444 16.4 Genové inženýrství rostlin a jeho uplatnění v základním výzkumu a šlechtění V průběhu posledních dvou desetiletí byl repertoár metod genetiky a šlechtění rostlin rozšířen o techniky genetických manipulací. Jako genetické manipulace s rostlinnou buňkou označujeme všechny nekonvenční techniky prováděné in vitrn. kterými lze modifikoval rostlinný gcrtOm. Genetickí- manipulace u rosí -lin lze z hlediska používaných metod rozdělit do dvou hlavních směrů: - buněčné inženýrství, zahmající modifikaci genetické informace recipientního organizmu prostřednictvím přenosu celých buněk (parasexuální hybridizace) nebo izolovaných organcl, - vlastní genové inženýrství, reprezentující vnášení klonovLíných genů (genetická transformace, trans-genoze). KuiiMi-LKcr tr.jnslorstiovaných 1 h;m\iym)iLh.i bu nčk a rostlin nemá význam pouze vc šlechtění, ale je cenným nástrojem v základním výzkumu pfi studiu struktury a stability genomu, regulace genové exprese, izolaci genu i při analýze molekulárních mechanizmů vývoje a metabolizmu rostlin. Obr. Iť.7 Nldor cruH-n-galt vyvolaný průsífedriiavíin onluigen-afívi kmene Agritbaclerřuni liifHcfitL-iens tiú fhjJ'jiHlhŕ rasů ini taháku INicatíůim tabnctim) pastované v kultuře in vilro. Nadprodukce jbuninu a ťvii)kimnu ivofcnťhn v nfetorovýt t> buňkách vede i k indiikťi růstu kisÍL-nú a prýlových výhonků v okolí nádoru. 16.4.1 Metody vnášení klonovaných genů do rostlin Vnášení genů, obvykle klonovaných v bakteriálních plazmidech, do rostlin je většinou zprostředkováno pomocí přenaseču, tzv. vektorů (zejména bakterií nebo virů). Vhodné vektory by mčly mít snadný vstup do rostlinné buňky, široký okruh hostitelských rostlinných druhů, schopnost včlenění do rostlinných chromozomů (zaručující stabilitu při mitóze), schopnost přenosu do semenného potomstva a neměly by negativně ovlivňoval fcnolyp rostliny. Ne všechny vektory tyto parametry splňují. Cizorodá DNA je po vstupu do rostlinné buňky obvykle integrována do rostlin-riých chromozomů v náhodných pozicích. Cílenou integraci klonované sekvence DNA {podrobené například definované bodové mutagenezi) do určitého lo-kusu rostlinného genomu lze realizovat vhodnou konstrukcí vektorové molekuly DNA, obsahující alespoň částečně shodnou sekvenci k cílové genomové DNA, a dosáhnout tak homologní rekombinace. Cílená integrace genů je běřnc prováděna u kvasinek i živočichů, u rostlin však dosud bylo dosaženo jen sporadických úspěchů. Tato technika by umožňovala nejen studium genové funkce a regulace, ale i cílené šlechtění rostlin eliminací nežádoucích genů (gene replacement). Nejrozšířenějším vektorem k přenosu DNA do rostlin jsou agrobaktertální plazmidy. 16.4.1.1 Agrobakteriální vektory Rostliny se staly středem zájmu molekulárních genetiků teprve v 70. letech v souvislosti s objevem plaz-midů 71 (tumor inducing) půdní patogenní bakterie Agmhacterium tumefaciens, která je schopna infikovat většinu druhů dvouděloí.ných a nahosemenných rostlin. Tato bakterie funguje jako „přirozený genový inženýr1", neboť po infekci rostlinné buňky stabilně včleňuje ěást svého onkogenního plazmídu do rostlinných chromozomů. Tohoto procesu lze využít k přenosu žádaných genů po jejich předchozí integraci do transponované sekvence DNA. Agrobacterium lumefaciem je půdní gramnegativní bakterie z čeledi Rhizobiaceae, která vyvolává tvorbu nádorů typu crown-gatt na poraněných místech rostlin (obr. 16.7). Její infekčnost je podmínčna přítomností velkého pla/rnidu 77. na kterém se nachází mj. i oblast T-DNA {trwuferredDNA) a geny odpovědné za virulenci. Vlastní morfologii a fyziologii rostlinných ná- dorů ovlivňují geny ze segmentu T-DNA s promotory eukaryotického typu, které jsou v nádorových buňkách konstitutivné exprimovány. Jde o geny, jejichž produkty katalyzují syntézu auxinu (tryptofan-2-mo-nooxygenáza, šanM. a indol yl-3-acetam id hydro láza, iaaH) a cytokinino (izopentenyltransferáza, řpí) a kondenzaci organických kyselin s bazickými aminokyselinami za vzniku látek opinového typu (například oktopinsyntázy nebo nopalinsyntázy). Mimo T-DNA nese 77-plazmid i geny zodpovědné za virulenci, ka-tabolizmus opinů bakteriální buňkou a konjugativní přenos 7i-pia/midu mezi agrobakteriálními buňkami (obr. 16.8). Přenos genetické informace z bakterie A. tumefa-cienx do rostlinného genomu je ojedinělým příkladem genetické výměny mezi organizmy z různých říší. Procesy, které přitom probíhají, však nejsou nijak výjimečné. Jedná se v podstatě o adaptace dvou proka-ryotických procesů: aktivace genové exprese v reakci na vnější stimul prostřednictvím dvoukomponcnlního pozitivního regulačního systému v bakterii a konjuga-tivní přenos T-DNA z donorové bakterie do reciptent- ori Obr. 16.8 Schematická mapa standardního onkngenního pla/midu 77 oktopinovrho kmene AgrotniiUnum lumcfaciens, T-DNA, ob' klopená pravým }. geny umocňující konjuejiLvnt pfcno.í ÍJ-pla2-midu fírw}, ťcny kiUujíd kot.ibtilizmus oklopirui Ukc) a replikjĚní pocalek |>la/midu (,f'ri) 443 ní rostlinné buňky. Přenosové funkce jsou v A. titme-facierss kódovány plazmidovými i chromiizoniúl-ními virulentními Reny. V priibčhu procesu hojení dochází v poraněných rostlinných buňkách k syntéze ligninu z ťenolických prekurzorů, které slouží jako chemoatraktant pro bakterie A. htmefaciens a následnou indukci 7í-plazmidových virulentních (vir) genů. Bakteriální chromozomální virulentní geny {chvA u chvB) jsou exprimovány konstitutivně a zprostředkují zejména přichycení bakterií k rostlinné buňce prostřednictvím celulózových vláken. Virulentní geny lokalizované na ľí-pla/midu potom řídí a zprostředkují speciální reakce rozpoznávání rostlinné buňky a následné procesy vedoucí k přenosu T-DNA. Tylo geny jsou lokalizovány v jednom velkém regulonu v osmi operonech {virA až virtf). Geny virA a virG svými produkty pozitivně řídí transkripci ostatních v/r-genů: aminnterminální ěást virA-proteinu slouží jako senzorová doména interagující přímo s rostlin- nými signálními molekulami n předává signál virG-proteinu, který aktivuje ostatní vjr-geny. V transfor-maěním procesu hrají rozhodující úlohu hranice segmentu T-DNA, kicrč jsou tvořeny přímým opakováním ne zcela shodných 25pb úseků DNA. Jakákoli DNA lokalizovaná mezi těmito hranicemi může být transponována a integrována do rostlinných chromozomů, přičemž rozhodující úlohu hraje pravá hraniční sekvence (8^, right boundary), od které přenos T-DNA začíná. Produkt virDi-genu působí jako specifická nukleáza, která vyStépí pravděpodobně jediné vlákno T-DNA, jež je potom s pomocí ví>D2-proteinu transponováno do rosllinnč buňky Finálne je T-DNA integrována do rostlinného chromozomu procesem náhodné (ilegitimníl rekomhinuĽu. což zajišťuje její mitotickou i ineiotickou stabilitu. Detailní popis procesu přenosu T-DNA do rostlinných buněk lze nalézt v řadě specializovaných prací (napr. Ti n I and \99b). selQkCO vhodo&hc dono/ovehc druhu nebo rmitarau exprirmj-jiciho zadaný znak ctiaf akterlstika Funkce pfistLižnrhn ganu < 'jiOľ hamickä dráha) uoiac-e kMíi|i'ci sekvonca genu, jeho klonováVii •i placnrudu f. eofř kůrtÉtrukce chimérického genu s rostlinnými kontrol-nimi oblastmi 5' a 3-' klomváni chiméric*éha gaiiu do plazmidu s hraničními oblasi-mi T-DNA z Ti-plazmidu A tume" facŕens a signálními geny pro se lekci v bakieriích a rostlinách prenos plazmidu do bakterii A kitnttia&ens rwsoucleľl vxizhrofoný' ri-pWBtiild 1 infekce roaliŕiriýeh explamtátú bakteriemi A íiirrw/acřertí, následná eliminace bakterií antibiotikem r regenerace rostlin i iranslor rnovanych buněk v kulturách m viti a 2a prllúmnosti selekčního antimetabůlitu Základní Charakteristika primárních transgonnícn rostlin; a) bnchemlcký průkaz expresu signálního (selekčního) genu b) fyzikální důkaz priomnosli ■ntaklníTio iransgenu (DflA/D^-fivtifldltace, PCR) ti průkiLT transkripčniio produktu (RNA/DNA-hybrioYzace. RT-PCR) o) hirslocheflrilcl(áv'cytocliernická lokalizace trarret ripU. m sitii e) fcinkco enzymu kódovaného uam genem (průkaz enzymu nebo jim kataryzované reakce) t) fenotypový projev transejenu r sledováni slruktuml afunkini stabilfcy (segregace) iransgenu v Mnwihém potomstvu Obe. 16.9 Schéma cipciimeniälního postupu pro přenos cizorod^cli genů do rosil in pnjsířcdnjttvirn binárního systému Agrobncieťium liimcfncienx á rostlinných cxpbntátnvých kultur in viiro. 446 Původně vypracované postupy přenosu klonova-ných genů du Ti-plazmidů byly poměrně složité; zahrnovaly několikanásobné konstrukce plazmidových vektorů obsahujících žádaný gen, signální geny pro selekci příslušných plazmidů v Escheňchici voli a fragmenty T-DNA v promiskuitních plazmidech, které byly vnášeny do A. tumtfaciens, kde dvojitou homologní rekombinací docházelo k integraci do Ti-pla/midu. T-DNA však obsahuje onkogeny {iuaM, úuiH a ipí), které odpovídají za nadprodukci auxinu a cytokininu a brání v regeneraci rostlin z transformovaných Kuněk. Proto bylo nutné tyto geny eliminovat h u ď mutací, nebo delecí. To vedlo ke konstrukcí vektorových 7í-plazmidů, kde velká část T-DNA je nahrazena úsekem malého plazmidu E. coíi, což též umožnilo snadnou introdukci žádaných genů klonovaných v tomto pomocném pla/midu jednoduchou rekombinací. Objasnění funkce jednotlivých úseků 27-plazmidu dále vedlo kc konstrukci tzv. binárních vektoru, kde žádaný gen je klonován v malém plazmido-vém vektoru spolu s pravou hraniční sekvencí T-DNA a nezbytné produkty agrobakteriálních virulentních genů jsou zajišťovány 77-plazmidem v pozici trans. Těmito metodami již bylo dosa/enn přenosu a exprese mnoha set prokaryotických a cukaryoliekých genů v rostlinách pod kun tru km konstitutivních i inducibil-ních promotoru, které mohou být rozpoznávány rostlinným transkripčním aparátem (obr. 16.9). Obr. 16.10 Stabilizovaní kultura nádorových kořenů ihairy roim\ in Hbv izolovaná jx> infekci rostliny tabáku iNicoiimui tahúcam) onkogennfm kmenem Agrobatlerium rhizogritrs. Blízkým příbuzným A. ntmefaciens je Agrobacrc-rimn rhizogenes, které na místě poranění rostlin vyvolává tvorbu větvených kořenových struktur [hairy roots, obr. 16.10). Schopnost infekce A. rhizogmes je opět závislá na přítomnosti velkého onkogenního plazmidu (/Jí, root indncin%) a schopnosti jeho segmentu (T-DNA) včleňoval se do rostlinného genomů. Tento segment nese dva geny odpovědné za syntézu auxinu a dále čtyři geny (roiA, rotB, rolC a rolD), jejichž produkty působí synergicky a determinují morfologii kořenových nádorů. Kořenové nádorové kultury je možné pčstovat na syntetických médiích in vitro a mají potenciální využití v biotechnologiích C produkce kořenových sekundárních metabolitů.). Na rozdíl od nádorů crown-gall jsou kultury hairy roots schopny regenerace v rostliny, které se vsak vyznačují charakteristickým změněným fenotypem (svraštělé listy, redukovaná apikální dominance, zkrácená inter-nodia; silné kořenění a snížená fertilita). 16.4,1,2 Rostlinné viry jako vektory Jinými prokaryotickými patogeny, které snadno pronikají do rostlinné buňky a jsou schopny se v ní replikovat jsou rostlinné DNA- a RNA-viry, Výhodou použití virů jako vektorů pro přenos genetické informace je schopnost systemického šíření v rostlinách po infekci jejich částí a velký výběr virů s vhodným hostitelským rozmezím. Velkou nevýhodou virových vektorů je však jejich omezená kUmovact schopnost, autonomní replikace (nedochází kc kovalentnímu včlenění do rostlinných chromozomů) a skutečnost, že sc obvykle nepfenášejí do semenného potomstva. Prvním virem, kterého bylo použito k přenosu cizího (bakteriálního) genu do rostlin, byl jeden z několika známých rostlinných dvouvláknovýeh DNA-virů, virus mozaiky kvciáku, CttMV (Brisson et al. 19K4). S RNA-viry jako vektory jsou manipulace složitější, neboť nejsou k dispozici techniky přímé konstrukce rekombinantních molekul RNA m vitro. Při integraci genů do RNA-virových genomů je proto nutné připravit zpětnou transkripcí cDNA kopii viru. Transformaci rostlin lze potom provést buď infekcí rekombi-naniní clWA nebo jejími t ran skripty syntetizovanými in vitro. Tento postup byl poprvé experimentálně mě fen u jednodčložných rostlin pomocí RNA-viru mozaiky sveřepu, 8MV (French et al. 1986). Zvláštní metodou, která umožňuje vnášení virových genomů do rostlin ve fytopatologickém výzku- 44^ mu, je agroinfukcĽ. Virový gcnom (DNA u kaulirrm-viríi nebo cDNA u RNA-virů) je přilom klonován v několika tandemových opakováních do T-DNA Ag-robacterium tumefaciens a vnesen do rostlin, kde re-kombinací me/.i kopiemi virové DNA dochází k jejich uvolnění a následnému v/ni ku infekčních virových částic. 16.4,1.3 Mechanický přenos klonované DNA Protože ruda krytosniientmh rosil in (zejména jedno-déložných druhu, včetně hospodářsky významných obilovin) není citlivá vůči agrobakteriální infekci, bylo vypracováno několik alternativních přístupů k vnášení klonovaných genů do rostlin nebo rostlinných explantátů. Pokud je možné u těchto druhů regenerovat izolované proioplasty zpět v celé rostliny, jsou používány techniky permeabilizacc jejich cyto-plazmatické membrány elektrickým šokem (elektro-poracc), kapilární mikroinjekce nebo indukovaného příjmu DNA s pomocí polyetylenglykolu (Potrykus I99f>). Tyto techniky jsou využívány i k testování tranzienmí exprese vnášených chimérických genů, neboř k jejich expresi může docházet i před integrací do chromozomu. Nejnovější metodou je izv. mikroprn-jektilový přenos DNA (parúcle bombardmení) do jader nebo organel kultivovaných buněk a případně i do intaktních rostlinných orgánů vslřelovánťm mikroskopických částic netoxických kovů (například wolframu nebo zlata), které povrchově adsorbovaly klonuvanc molekuly DNA z roztoku. 16.4.2 Sete kto vate Iné a reportérové geny Velkým zdokonalením vektorů je vyžití dominantních signálních genů, které umožňují selekci trans-gcnníeh bunčk i rostlin na základě získané rezistence vůči antimetabolitům (např. kanamycinu, hygromyei-nu, bleomycinu nebo mctotrexátu) nebo monitorováním transgcnoze biochemickou detekcí reportérového enzymu (např, chloramfenikolacetyltransferázy, /í-glu-kuronidázy. Iuciferázy); jejich přehled je uveden v tah. 16.3. Dominantní signální geny jsou připravovány m vitro juko chimérické konstrukty fúzí promotoru eukaryolickčho typu a vhodných terminátorů transkripce se strukturními geny kódujícími signální Tab. 16.3 Přehled dominantních seli-kiovLiielnvtii a nrponomvvdi genu (možnost snadného biochemického testu) v genovém in/enýr--i--, i i. .- li.i i ■ \ r tnutí navozeni rezistence k dané láiec. Cen Fnzym (protein) Donor 1 "ti III II MTlľkťC Test als acelolaki ái syniáui (dilurvutfurorťj Artihitliipfis ihiiliittui nMMM k chlonuilŕuronu - tirrtA 5-eoolpyruvy liiki-míl-3-fosfiliyniíza Saimtmttlo typhitnurium rezistence ke itlyfo/Jiu bar fosfinotncifl-.iCL-lyltijnstVríir.i Strtptmnyces rezistence k. bialapliosu + ble Escherichia coli (Tn5) rezistence k olcomyeinu - lnu buHiionynilnilriliza Klctnitlla i .... '..if rezistence k broinvxymlu - ilhfl diliydrorblirredok. [ifj (nctotraiť) E. coli (Tn7, pr67). Afíí.v musculia rezistence k mertrfíi udiv cat cbkmum fenikel-wQrtriflifaiu E. coli (XtÜ) - sfp zelcnř fluoreskuj íci pfiHein Attfuorta viaariii - + ÍJ(.i iitulAí /fplukuncmidäza - + hph hygromycin-Ibvfotnufafn E. c€tti (p]R225) 11. /ľ-lLT . c k hygrnmycimi It + lat/. ß-plakiozidiza E. coli + toc. /nr ......... FIH'I\IIU.\ pyralis, Vibritt tiantyi + Irpl 1. i\pt tt '■■Míli fosfoUarisferiii I, II E. c/iti (TnfiOI. Tn5) reiisienee ke kanamycinu + slreptomyc i n-:• =^:..ii .m —1«.- -.i a. F. cli (Tirí) Teti štence k itrrptomycinu — suli cbhydropteri>íksyn-lila (íU-lfortaitiid1) L coli i pH ■:(■■ i rezistence k iulfťUliHlidu - itlc trypinfíin-dekarboxyllu Calharanlhus roseus rezistence k 4-metyl-i:|"i'.-i..n.i .■/i rif,:. iff 'glukuíidiii /ju iihivs - + OCt, ntts okiopinsynciza. nripalinsynl;iza Afirrtluicleriam iiimľjut leas _ + + iciííM iaaH tryrrtofan-iiuinooxygcnilt/a. indoly laoei-apmdhydrolíia A. imnrjafitns ríist bez auxinú •l" izopcnlenyl-lr:nM.'i:i.-: A. mmefatiem rúM bez cyiokininů - 448 L-n/yrny. Nejčastěji používanými konstitutivními pro-motory v genových manipulacích u rostlin jsou 5'-se-kvence opinsyntázových genů / 77-plazmidu A. tume-faciertxa 35S RNA-promotor z viru mozaiky kvčtáku {CuMV). Z rostlin byla izolována i řada promotorů, které umožňují specifickou expresi genů v určitých orgánech nebo pletivech; například promotor genu kódu-jícího semenný protein fazeolin je funkční pouze v dé-lořníeh lístcích, gluteninový promotor vendospermu, patatinový promotor v hlízách nebo promotor Rubtsco-genu v listech při světelné indukci. Nejrychlej5í technikou užívanou k testování funkce těchto promotorových sekvencí je sledování tranzientní exprese klonova-ných chimérických genů po jejich indukovaném příjmu (např. elektroporací) v rostlinných protoplastech. 16.4.3 Strategie využití protismyslných genů Strategie využití tzv. protismyslných Umtisense) sekvencí nukleových kyselin je založena na blokování informačního loku z mRNA do proteinu aplikací vlákna RNA komplementárního k sekvenci cílové mRNA. Experimentálně je toho obvykle dosaženo „obráceným" nakloňováním příslušného genu pod vhodný promotor, začleněním tohoto konstruktu do J-DNA v agrobakteriálním vektorovém systému a jeho přenosem do rostlin. V transgenních rostlinách se pak syntetizuje protismyslné vlákno RNA, které na základe párování bází tvoří s „normální" mRNA duplexy, jež jsou rychle degradovány, nebo je mRNA poškozena pfi post t ran skřípění úpravě, případně je jinak blokována translace (obr. 16.11). Tento proces je v některých případech součástí přirozeného regulačního systému u prokaryot i cukaryot, kdy se ivoří krátká komplementární vlákna RNA, inhibující Funkční transkripty v určitém stadiu ontoge-neze. První pokusy se syntetickými protismyslnými geny byly prováděny pomocí tranzientní exprese v izolovaných protoplastech: introdukované protismyslné geny svými transkripty inhibovaly expresi příslušných signálních genů, Protismyslné geny jsou schopny i blokovat nebo redukovat funkci přirozených rostlinných genů v transgenních rostlinách, jak to bylo prokázáno například u syntézy flavonoidů v květech nebo polygalakturonáz.y a eiylenu ve zrajících plodech. transkripce "normálního" genu v rostlině transkripce obrácené nakloňovaného {protismyslného) genu v rostlině 3" ( + ) vlákno DMA pfomwor pclyW 5' (-)vlMinoOMA 3' transkrifKO I' í«rti« mRNA 3' ( -) vlákno DMA promwor 5 ■ (+) vlákno DNA transkripce srMŕsertsp HNA nefunkční duplo* HNA-RNA Obr. Iťs.l I Schrma Mraicgic využili prolismyslnc {aniuenxe) RNA k inhibiĽi exprese endogenních rostlinných genů. V normálních rostlinách (jakož i v ostatních pfukaryotických a cukaryot ickych organizmech) v/nikaji' príslušne mRNA přepisem jediného vlákna dvou-iroubovicc DNA (izv. minus-vlákno neboli tense ítmnd, znaCeno Čárkovaní). Pokud je gen nakloňován pod proinoror ohráccnt. je přepisováno plus-vlákno t>N A {anúsrnsc stranei. značeno tečkovaní), Po vnesení (ukové-ho chimérického genu do rostliny (naprfklud pomoci .igrobaklcTĽÍInfhu vtk(oni) vzniká v rosllmnýcli huňLidi pioiiMriyilriii RNA (antisenseRNA\ kteří můJeSpříslušnou normální rostlinnou mRNA na základe párování há/í vytvářel duplexy, a lim znejnoíilovat proces translace. 449 16.4.4 Strukturní a funkční stabilita transgenů Fyzická přítomnost transgenů a jejich počet kopií v rostlinném genomu jsou ověřovány Southemovuii (DNA/DNA) hybrid i zací nebo technikou PCR jejich exprese je zjišťována pomocí RNA/DNA-hybridizace a imunologických metod detekce příslušných poly-peplidů, připadnu jednoduššími enzymovými testy, při nich/ jsou in vitro nebo in siru detekovány finální produkty signálních enzymových reakcí (obr. 16.12). 3 if! w •< 1 1 1 Obr. 16.12 r/f) z Escheriihia cirli. navozující rezistenci ke kana-myemu. Semenáčky rostoucí na syntetickém médiu s kanamycinem segieguji nu kmtamycin-ie/LMentní a k ;in iinn t:« n-ven ŕ 11 i vní rostliny v mcnclclistickém statistickém pomeru 3:1. U senzitivních rostlin ve eľekl kjnnmyeinu projevuje retardovaným vývojem, blokováním symezy chlorofylu a pozdejíí letalitou na úrovni vývinu déloinich lístku (tyto rostlinky jsou označeny Šipkami), (b) Biochemické stanoveni enzymu neomyL-infosfotransícrá/y v iransgcnních rostlinách t.lbáku. Proteinové extrakty i. rostlin jmi eleklroforetieky separovány v akrylamidovém gelu a na nem jc in siiu provedena ..sendvičová" reakce /a, přítomnosti substrátu (kanamycinu) a donnru fosfátových skupin ("P-koncové značeného adenozinlrifosfáLu. ATP) Výsledný produkt, fosforylovaný kanamycin, o/.nuiený Šipkou, jc vi/uil i/ován auioradiograficky na rentgenovém filmu. Vzorek \ dlaze cisto I je negativní kontrola (normální lakik.i. iľansjícnni vzorky iíslo 2 a 5 mají vysokou hladinu enzymu, vzorek číslo 3 jc velmi slabě pozitivní a vzorek v dr&zc Číslo 4 enzym neobsahoval (zjevné došlo k „umlécní" iiansgenu> I když strukturní stabilita transgenů v rostlinách jc vzhledem k jejich integraci do chromozomů vysoká, dochází' často k jejich i n aktivaci zejména v případě přítomnosti více kopii transgenů. K této inaktivaci, která je obvykle provázena mety laď jejích promotorů, múre docházet, pokud jsou Iransgeny organizovány jako tandemová opakování (crí-inaktivace) nebo jeden metylovaný (ransgcn múze inaktivovat jiný v pozici trans mechanizmem analogickým u puramutaeí. případně může docházel ke koordinovanému „umlčování" dvou nebo více homolognfch transgenů (co-sup-pression, Matzke a Matzke 1995). Procesy inaktivace založené na úplné nebo částečné homologii úseků DNA transgenů probíhají'na úrovni transkripciu nebo posttranskripční. Předpokládá se, že párování homolognfch sekvencí může způsobovat inaktivní genetický stav de novo-metylací a heterochromatinizací UranskripČní inaktivace) nebo mRNA-produkty více transgenů se akumuluji, až dosáhnou kritické hladiny, při které dochází k jejich rychlé degradaci (posttranskripční inaktivace). „Umlčování" transgenů v rostlinách je dnes Široce využíváno jako modelový systém ke studiu interakcí homo lot; n ich sekvencí DNA, neboť by k němu mohlo docházet i u endogenních genů, zej men u v polyploidnfch rostlinách, Z praktického hlediska je vsak ..umlčování" transgenů určitou překážkou při aplikacích technik genového inženýrství v biotechnologiích a šlechtitelské praxi. 16.4.5 Transgenoze jako nástroj ke studiu fyziologických a morfologických procesů Pokroky v konstrukcích ugrobakieriálnich vektorů a regeneraci rostlin v explantátových kulturách in vitro vtrdly v průbčhu posledních několiku let k přenosu mnoha prokaryotických a eukaryotickýeh genů do rostlin. Níže popsané výsledky jsou současně příklady, jak metodami genového inženýrství lze studovat nebo modifikovat fyziologické a morfologické procesy v rostlinných organizmech. 16.4.5.1 Modifikace obsahu rostlinných hormonů Řada druhů mikroorganizmů {zejména fylopatogcnni bakterie) produkuje rostlinné hormony auxinovcho nebo cytokininovcho typu, i když metabolické dráhy. 450 které vedou k biosyntéze těchto látek, nemusejí být v rostlinách a bakteriích shodné. Syntéza rostlinných hormonů, auxinu a cytokininů, kódovaná T-DNA původem 7. onkogenních plazmidů Agrobacteriuin twne-faciens je podmínkou pro aktivitu těchto bakterii jako fytupatogenů- Agrobakteriálnf geny odpovídající za syntézu auxinu acytokininu nejsou homolognf s geny, které kódují enzymy katalyzující syntézu hormonů v normálních rostlinách. Jednou /. možností využití genového inženýrství ke studiu biologických funkcí rostlinných hormonů je vnášení genů odpovídajících za jednotlivé kroky v syntéze (popŕ, v degradaci nebo jiné chemické modifikaci) rostlinných hormonů z A. iiiinefariens á A. rhizogenťs, případné i z jiných druhů bakterií (Pseudamonas syringae subsp, savastanoi, Xanthomonas campestris, Rhizobium sp. aj.). Cytokininy Produkt jednoho z agrobakteriálních onkogenů, izo-penienyLtranslerázy iipt), která kondenzací izopente-nylpyrofosfátu a adcnozínmonofosfálu (AMP) dává vznik izopentenyl-AMP, jľ pravdepodobné klíčovým enzymem v biosyntéze cytokininů; izopentenyl-AMP je rostlinou rychle transformován v biologicky aktivní cytokininy, zejména deriváty zeatinu. Gen kódující izopentenyltransferázu z A. tumefaviens byl se silným promotorem z viru mozaiky kvčtáku vnesen do rostlin tabáku. Tylo transgenní rostliny mají až stonásobné vyšší hladinu cytokininů ve srovnání s normálními rostlinami a vykazují ztrátu apikální dominance, potlačování procesu stárnutí a zejména neschopnost tvorby kořenů. Gan a Amasino (1995) izolovali z Arabidopsis tha-tiana gen, který1 je cxpnmován výhradné při procesu stárnutí listů. Promotor tohoto genu pak nakloňovali ke strukturnímu a gro bakteriálnímu genu kódujícímu izopentenyltransferázu (ŕpí) a tento chimérický gen vnesli do rostlin tabáku. Jakmile v listech trans-genních rostlin nastal proces stárnutí (který normálne vede k jejich programované smrti), došlo k indukci syntézy cytokininů, tím bylo stárnutí potlačeno a listy dále vykazovaly fotosyntetickou aktivitu. Akiivita transgenu byla tedy řízena autoregulačním mechanizmem a rostliny nejevily žádné nežádoucí symptomy nadprodukce cytokininů ínapř, neschopnost tvorby kořenů). Tato práce je názorným příkladem, jak je možné pomocí transgenoze ovlivnit procesy stárnutí rostlin. Estruch et al. (I99h provedli transformaci rostlin genem ipít do nčhoř byl mezi promotor a kódující oblast genu vklonován mobilní genetický element Ac z kukuřice. Takto upravený gen je exprimován pouze v případe, kdy dojde k vyštěpení Ac-elementu. Pokud k vystúpení transponovatelného elementu došlo až v pozdější době vývoje rostliny a pouze v některých oblastech prýtu. rostliny byly schopny tvořil kořeny. Vysoká hladina cytokininů v listech odrážela vyšší četnost transpozice Aoelcmenlu a měla za následek tvorbu drobných výhonků prýtů na okrajích listů ívi-viparic). Květní pupeny dávaly vznik abnormálním květům s vysokým obsahem cytokininů, avíak s výrazně nižší hladinou transkriptů některých homeotic-kých květních genů. Tyto výsledky naznačují, že cytokininy mohou řídit aktivitu homeotických genů, a tedy i vývoj květních orgánů. Auxiny Binsyntéza auxinu v nádorech crown-gail probíhá poněkud odlišně než v normálních rostlinách. Produkt agrobakteriálního genu iaaM katalyzuje přeměnu tryptofanu v indolyl-3-acetamid, který je pak konvertován ve výsledný auxin (indolyl-3-octovou kyselinu, IAA) prostřednictvím enzymu indolyl-3-acetamid-hydrolázy, který je produktem genu iaaH. Jelikož indol yl-3-acetamtd není obvykle meziproduktem bio-syntézy auxinu v rostlinách (tím je u rostlin indolyl-3-acetaldehyd), musí být v nádorech crown-gall funkční oba agrobakieriální geny. iaaM a iaaH. V testovaných transgcnních rostlinách vede exprese genu iaaM s pomocí silnéhu promotoru k určitému zvýšení syntézy auxinu, zatímco exprese samotného genu iaaH nemá řádný účinek. Ke studiu biologických funkcí auxinu byl do rostlin mrkve vnesen agmbakteriální T-DNA-segment, který obsahoval gen iaaH se svým vlastním konstitutivním promotorem, zatímco gen iaaM byl nakloňován pod konlrotu tepelně in d u kováte! ného promotoru z mouchy octomilky (Drosophiia metáno-gaster). Vystavení transgenních rostlin zvýšené teplotě pak bezprostředně vedlo ke zvýšení hladiny auxinu a indukci ivorby kořenů Gen iaaL, izolovaný z bakterie Pseudomonas syringae subsp. savastanoi* kóduje enzym IAA-lyzinsynte-tázu, který katalyzuje konjugaci lyzinu a IAA. Kon-jugáty IAA s aminokyselinami se vyskytují i v rostlinách, avšak konkrétně konjugát IAA s lyzinem tu není obvyklý. Spěna et al. (1991) nakloňovali gen iaaL 451 pod vhodný promotor za ííOdem studia, zda konjugace IAA k Iv/inu ovlivňuje biologickou aktivitu au-x in u v rostlinách. Získané transgenní rostliny tabáku a bramboru vykazovaly ntkteré fenotypové odchylky charakteristické pro sníženou hladinu au xinu: částečné potlačený vývoj kořenů a ohyb řapilu a střední listové žilky (epinaslic), Etyfen Technika transgenoze umožnila potlačení syntézy endogenního rostlinného hormonu etylénu, který mj. urychluje /.Tání plodů. Etylén je chemicky nejjedno-duSSÍm známým hormonem a jeho metabolická dráha metionin (SAM-&yr"itĎta\za) S-adertozyl-L-maltonirt (SAM) mťíiyliKiaLlůnoiin + fKWnoswm <_ (SAM-hyťfOláza z ĚSCttůriChia Culí} ailSisense ACC-Synláza (ACC-syrti&a) arnlnocyWoprapan-T-irrírtoo>tylova kyselina (ACC) íj-ketortjselná kysi-L,: < ..... ffnfrssíiss ACC-ůxidáfa (ACC-oxictaal etyle n Obr. Ib. 13 Inhibicc synlč^y etylcnu v roHtltniLh pmslřcdnic[vÍTn technik genového mícnýr&tví. Sehenia repíc/iemuje iMmIuí biu-ivnRtickDU dráhu etyle nu («) mel ion tnu pře* SAM a ACC) ,i moí-nusii jejího narušení potlačením A C \ . připadne ACC-oxt- d-a/y. prostřednictvím pnotisrny&ínýcn genů nebo degradaci mezipriiiluktů hvnLĽ/v elytcnu po vnesení pi\im hak Lcri.il n flui původu (SAM-ltydnoli/a nebi) ACC-dcumindzal. v rostlinách je již zcela objasněna. Výchozí látkou je metionin, který spolu s ATP dává vznik S-adenozyl-i,-metioninu (SAMI, jenž je dále konvertován v aminn-cykloprnpan-1-karboxylovou kyselinu (ACC) s pomocí enzymu ACC-syntázy. Finální reakcí biosyntezy etylénu jc oxidace ACC na cly len (C:H4), katalyzo-vaná ACC-oxidázou (viz kap. S). Klíčovým meziproduktem je tedy SAM, který se uplatňuje i v jiných metabolických drahách (zejména jako univerzální donor metylových skupin), Good et a!. (1994) připravili transgenní rostliny rajčete, do kterých vnesli SAM-hydmlázový gen z bak-terioťágu 7'.í Esckerichia c.oii. Hn/ym SAM-hydmláza kata lyžuje rozklad SAM na metyltioadenozin a homo-ser in, což má za následek kritický nedostatek SAM pro řadu bunečných reakcí. Aby nedocházelo k některým nežádoucím poruchám metabolizmu rostliny, byl gen kódující SAM-hydrolázu nakloňován pod kontrolu tkáftuvč specifického promotoru, který jc aktivován pouze v průběhu zrání plodů rajčete. Výsledné Iransgcnní rostliny se vyznačovaly normálním fenoty-pem. avšak syntéza etylénu ve zrajících plodech byla silnč redukována, což mě In /a následek požadované brzdění přezrávání plodů. Inhihice syntézy etylénu by In dosaženo í jinými sirntegiemi genového inženýrství: konstrukcí trans-genních rostlin nesoucích proti smyslné geny, jež inhi-bují expresi rostlinných genů kódujících enzymy ACC-syntázu nebo ACC-oxidázu, případné přenosem bakteriálního genu ACC-dcaminázy (obr. 16.13). 16.4.5.2 Regulace metabolizmu sacharidů Škrob je hlavním rostlinným zásobním polysachari-dem. který se ukládá ve IbrmČ zrn v amyloplastech a chloroplastech, kde probíhá i jeho biosymčza. Jedním t. prekurzoni škrobu je adeiioztndiťostátglukrtza (ADP-glukoza), jejíž tvorba z gl ukŕ> za-1-fosfátu a ATPjc katalyzována enzymem ADP-glukozapyro-fosforylázou (AGPáza). Dh'vfjSí studie potvrdily, že ADP-glukúza je výhradním pnekurzorem biosyntézy Škrobu, neboť mutanty se sníženou hladinou AGPázy izolované u kukuřice obsahovaly v endospermu obi-lek výrazní nižší obsah škrobu. Miillcr-Róbcr et ni. (1992) připravili transgenní rostliny bramboru, ve kterých byla exprese AGPá/,y inhibována vnesením chimérického protismyslného genu pod koni rolou silného konstitutivního promoto- 452 ru, Transgenní rostliny vykazovaly sníženou hladinu AGPázy v listech i hlízách. To m č to za následek potlačení syntézy škrobu v početných malých hlízách, kde docházelo k hromadení sacharózy a glukózy. In-hibice AGPázy neovlivnila hladiny jiných enzymů, které se účastní syntézy škrobu, došlo vsak k významné redukci exprese zásobních hlízových proteinů (zejména pa táli nu), což naznačuje souvislost mezi syntézou zásobních látek, škrobu a bílkovin, v bramborových hlízách. Do rosilin byl také vnesen gen glgC z Escherichia coli, který kóduje bakteriální enzym AGPázu (Stark et a). \992). Aktivita tohoto enzymu je regulována jinými ejektorovými látkami než aktivita obdobného enzymu v rostlinách. Transgenní rostliny bramboru obsahovaly vyíší množství škrobu ve svýeh hlízách, docházelo zde tedy ke zvýšenému přísunu organického uhlíku. Tyto výsledky naznačují. Že účinnost ťo-tosyntetické asimilace vzdušného oxidu uhličitého může být regulována i aktivitou enzymů podílejících se na syntéze škrobu, tedy schopností využívat foto-syntetické prodá kly formou tvorby zásobních polysacharidu. 16.4.5.3 Modifikace syntézy rostlinných lipidů Nejčastůjšími rostlinnými lipidy jsou eslcry glycerolu a mastných kyselin (triacylglyceroly neboli triglyce-ridy). které se akumulují jako zásobní látky v semenech a plodech některých druhů rostlin a představují významný komerční zdroj tuků a olejů. Fyzikální a chemické vlastnosti lipidů jsou závislé na složení mastných kyselin a jejich distribuci na skeletu glycerolu, Včtšina z více než 2(K) známých mastných kyselin je syntetizována pravé v rostlinách; nejhojnéj-Šími jsou kyseliny palmilová, stearová, olejová, linolová a tinolenová. Kyselina Imolova je napríklad esenciální složkou potravy savců, nebof savci nejsou schopni desaturovat olejovou kyselinu, která má ve svém uhlíkatém rclčzci jedinou dvojnou vazbu, na kyselinu linolovou, která mádvé dvojné vazby. Biochemie lipidového metabolizmu je velmi složitá, je v ní zahrnulo víee než tficet enzymů, které kata lyžují reakce od acetylkoenzymu A až k výsledným produktům. Klasickým šlechtěním rostlin jsou z řepky olejky odstraňovány nežádoucí mastné kyseliny s dlouhým uhlíkatým řctčzcem (např. kyselina eruková, která má ve své molekule 22 atomů uhlíku). Syntéza kyseliny erukové je řízena dvčma geny bez vzájemné dominance, které působí adilivnč a prodlužují uhlíkaté řetězce mastných kyselin, V posledních letech již byly izolovány některé geny, jejichž produkty sc účastní syntézy mastných kyselin a lipidů, a tyto geny byly pod kontrolou specifických promotorů, aktivních pouze v rostlinných zásobních orgánech, vneseny do rostlin (Topfer et al. 1995). Prvním úspéchem genového inženýrství bylo zvýšení obsahu nasycené mastné kyseliny stearové na úkor nenasycené kyseliny olejové prostřednictvím strategie exprese protismyslného desatúrazového genu u řepky. Stejného cíle. tj. zvýšení obsahu kyseliny stearové, bylo dosaženo nadprodukcí tioesterázového genu izolovaného ze sóji. Naopak zvýšený obsah kyseliny olejové je požadován u fepky i jiných olejnín pro průmyslové využití; toho bylo dosaženo v trans-genních rostlinách řepky po vnesení protismyslného genu oleátdesaturázy. Podobné výsledky byly demonstrovány u sóji, kde byla zvýšena hladina linolenové kyseliny v semenech inhibicí linolátdesaturá/y prostřednictvím protismyslného £enu. 16A5.4 Produkce proteinů v transgenních rostlinách Modifikace aminokyselinového složení zásobních proteinů Zásobní proteiny prol aminové ho typu u řady obilovin (např. pšenice, ječmene, kukuřice) mají nízký obsah lyzinu. zatímco zásobní proteiny leguminóz mají málo sirných aminokyselin. Ke zvýšení kvality /áviih nich proteinů u rostlin bylo navrženo nčkolik strategií. Jako nej perspektivnější je možné považovat přístupy proteinového inženýrství; cílená nuiu^cne/u si:i\;.i-i-cích genů in vitro a jejich zpčtný přenos do rostlin, prípadné i vnášení optimalizovaných syntetických genů by měly vést ke tvorbe proteinů se zvýšenou hladinou esenciálních aminokyselin (Jayneset al. I9R6). Problémem je však zajištční stability takto modifikovaných proteinů v rostlinných pletivech i jejich zmenené fyzikálně-chemické vlastnosti. Druhou alternativou je zvýšení syntézy jiných typů vlastních zásobních proteinů, které jsou bohatší na obsah limitních aminokyselin. Ke zvýšení obsahu esenciálních aminokyselin v zásobních proteinech semen u obilovin jc nutné též vypracovat metody regenerace a transformace in viiro. 453 Produkce protiiátek v transgenních rostlinách Byly zkonstruovány chimérické geny, které obsahují kódující sekvenci z a-amylázového signálního pep-tidu ječmene, fúzované s cDNA, jež kódují lehký a těžký řetězec savčí monoklonálnf protilátky. Do expresního vektoru byly kUmyvány yba geny současně a po vnesení Jo rostlin tabáku byla uvnitř jejich en-doplazmatického ret i kula prokázána funkční iigregace obou řetězců protilátky. V analogických studiích byly cDNA odvozené z myífch hybridomových mRNA vneseny do tabáku, transgenní rostliny exprimující jednotlivé y- nebo K-imunoglobulinové řetězce byly spolu kříženy a daly vznik potomstvu, ve kterém oba řetězce byly exprimovány současně (Hiatt et al. ]tiW\. Tylo pi>kusy naznačují širší možnosti využití protilátek v rostlinném výzkumu. Vazba protilátek k malým molekulám (např, toxiny, hormony, herbicidy), které prostupují buněčnou stěnou, by mohla vést k rete ne i těchto molekul v určitých částech rostlin a mohla by se uplatnit i při studiích interakcí rost-lina-patogen. Zlepšeni chuťových vlastnosti rostlinných potravin Některé tropické rostliny vytvářejí ve svých plodech specifické bílkoviny, které se vyznačují schopností vazby na chuťové receptory savců a vyvoláváním pocitu sladkosti; jsou až lOOOOOkrát „sladší"1 než sacharóza. Jedním z těchto sladkých proteinů je monelin, akumulující se v plodech africké rostliny Oioscoreo-phylUtrn cumminsii. Monelin je tvořen dvěma peptidy vázanými nekovalentními vazbami, které jsou za zvýšené teploty nebo v kyselém prostředí nestabilní. Pe-narrubia et al. (1992) vSak připravili syntetický gen, který kóduje oba peptidy v jediném peptidovém řetězci za sebou. Produkt tohoto genu je stabilnější než původní dvouřetězeový monelin a nemá žádné mutagenní nebo cytotoxické vlastností. Gen byl naklono-ván pud kontrolu konstitutivního promotoru a vnesen do rostlin salátu a dále pod promotorem, který je aktivován pouze ve zrajících plodech, byl vnesen do rajčete, V obou případech docházelo k očekávané akumulaci přišlusné mRNA a peptidu monelinu. Tvorba monelínu v transgenních rostlinách lak reprezentuje netradiční přístup ke zvyšování chuťových a jiných kvalitativních vlastností rostlinných potravin. Představuje též možnost vysoce efektivní bioprodukce alternativního sladidla expresí monclinového genu v transgenních rostlinách nebo mikroorganizmech. 16.4.5.5 Regulace kveteni a fertility květů prostřednictvím t ran sg e noze indukce samčí sterility chimérickým RNázovým genem Jedním /. důležitých šlechtitelských cílů je navození samčí sterility k usnadnění přípravy hybridního osiva. V samčích pohlavních orgánech, prasnicích, se tvoří až několik tisíc specifických mRNA. Klíčovou roli při tvorbě pylu hraje prašníkové výstelkové pletivo (tape-turn), kde se tvoK mnoho specifických proteinů a jiných látek, které vyživují vyvíjející se pylová zrna nebo se stávají složkami stěny pylových zrn. Klasickými Šlechtitelskými postupy již byla izolována řada různých cytoplazmatiekých a jaderných mutací bránících vývinu pylu a způsobujících luk samčí sterilitu. Pomocí technik genového inženýrství byla izolována promotorova oblast jednoho tabákového genu specificky funkčního pouze v prasníkovém tapetu a tato sekvence byla fúzována s RNázovými geny izolovanými z Aspergillus oryzae a Bacillus amyloliquefa-ciens. Tyto geny kódují RNázu, enzym, který nespecificky ätčpí molekuly RNA. Pomocí agrobaktcriál-ního vektoru byly tyto konstrukty vneseny do tabáku a řepky. Exprese chimérických RNázových genů selektivně deštruovala tapetum při vývinu prasnfku, bránila tvorbě pylu a vedla k rostlinám se samčí sterilitou (Mariáni et al. 1990). Inhibice tvorby květů protismyslným genem k mitochondriálnicitrátsyntáze Cyklus kyseliny tri karboxylové (ettrálový cyklus, viz kap. 5) je klíčovým procesem metabolizmu mituchon-drií u eukaryotických organizmů včetně rostlin. Ke studiu biologické funkce tohoto metabolického cyklu byl použit protismyslný gen k mitochondriálnímu enzymu eitrátsyntá/e, který katalyzujc první krok v cit-rátovém cyklu. Transgenní rostliny bramboru expri-movaly protismyslnou RNA a docházelo kc snížení hladiny enzymu citrátsyntázy. V průběhu vegetativního růstu byly tyto rostliny nerozlišitelné od kontrolních, avšak indukce kvetení byla u transgenních rostlin opožděna a květy abortovaly již v počátečních stadiích vývinu (Landschiltze et al. 1995). Mikroskopická analýza defektních poupat prokázala zejména abnormální struktury v semeníku. Mechanizmus 454 účinku snížené aktivity mitochondriálm' eiirátsyntázy na samici sterilitu tedy bude zásadne odlišný od jiných milochondriálních defektů (zejména od redukované schopnosti syntetizovat ATP v průběhu vývinu pylu nebo celých praSníků), ktcré vedou k samčí sterilite (i/v. ey t uplazm atická samčí sterilita). Modifikace kvetní morfologie prostřednictvím homeotických transgenů Homeotické geny kódují transkripční faktory, které se rozhodujícím způsobem podílejí na aktivaci genů řídících procesy diferenciace a morfogeneze (viz odd. 16.3.1). Řada homeotických genů ovlivňujících kvetní morfologii již byla izolována a některé z nich byly prostřednictvím agrobaklcriálních vektorů přeneseny do jiných druhů rostlin. Z řepky olejky (čeleď Brassi-caceae) byl například izolován gen agamous, jehož exprese je přísně regulována a který normálně odpovídá fi\ tvorbu orgánů třetího a čtvrtého květního kruhu (tyčinky a pestíky). Tento gen byl po nakloňování pod silný konstitutivní promotor vnesen do rostlin tabáku (čeleďSntanaceae). Transgenní rostliny vykazovaly předpokládané homeotickč květní transformace: přeměnu sepal v pestíky a petal v tyčinky (Mandel ei al. 1992), Transkripční faktor tvořený genem agamous, odpovídající za tvorbu pohlavních orgánů, byl tedy vlivem nespecifického (konstitutivního) promotoru tvořen i v „nepatřičných" pletivech základů kalichu a koruny, kde aktivoval geny determinující tvorbu tyčinek a pestíků. Tato práce demonstruje možnosti cílené modifikace struktury květních orgánů i vysokou fylogenetickou stabilitu rostlinných transkripěních faktorů 16.4.6 Další cíle transgenoze ve šlechtění rostlin Pokud se týká uplatnění transgenoze ve šlechtitelských programech, nej většího pokroku bylo dosaicno v navození rezistence vůči virovým chorobám a herbicidům; k dalším dílčím úspěchům patří přenos genů odpovědných z.íi odolnost vůči pozcľuvéinu luny/u, brzdění předčasného zrání plodů, produkce farmakologicky významných látek aj. Řada významných plodin (zejména kukuřice, tabák, brambor, bavlník, řepka a sója) s takto geneticky modifikovanými vlastnostmi již. byla uvedena do zemědělské praxe. 16.4.6.1 Zvýšení odolnosti rostlin vůči virům Jednou z klasických Šlechtitelských metod s cílem navození rezistence vůči virovému onemocnění jc tzv. krizová ochrana icross-proiecúan), spočívající v in-okulaci rostlin oslabeným virem, který pak potlačuje replikaci superinfikujícího patogenního viru. Podobného principu bylo využito i při konstrukci transgen-ních rostlin se sníženou citlivostí vůči viru mozaiky tabáku (TMV), Pomocí reverzní transkripce RNA genu TMV, kódujícího plášťový protein, byl připraven a přenesen do rostlin chimérický gen, který v trans-genních rostlinách produkoval virový plášťový pro-tein. Mechanizmem, který nebyl dosud zcela objasněn, dochází v transgenních rostlinách po virové infekci k inhibici virové replikace nebo alespoň k její redukci. Jiný směr genového inženýrství ve Šlechtění na rezistenci spočívá v inhibici genové exprese RNA-virů v transgenních rostlinách prostřednictvím vnesené protismyslné RNA. Další strategie je založena na existenci satelitních RNA jako virových parazitů. Tato satelitní RNA může u některých virů provázet jejich infekci, čímž alespoň částečně potlačuje virovou replikaci i expresi symptomů choroby. Tran&-kripee klonované cDNA virového satelitu v rostlinné buňce vede po infekci k enkapsulaci satelitní RNA do virových Částic a zpomalení replikace viru. Experimentálně jsou lestovány i další možné mechanizmy obrany vůči RNA-virům, zejména využití ribozymú, kLeré štěpí specifické sekvence ribonukleolidů virového genomu. 16.4.6.2 Transgenní rostliny toxické k hmyzím predátorům Bacilhss iluiringiensis je bakterie, jež v rané fázi spo-rulacc vytváří krystalická proteinová tělíska obsahující protoKin, který po rozštěpení v alkalickém obsahu střev je toxický pro larvy motýlů, případně jiného hmyzu {Aronson et al. lyHfi.í. Geny, které tento protoxin kódují, byly s pomocí agrobakteriálních vektorů vneseny do rostlin tabáku a rajčete s cílem intoxikace jejich hmyzích predátorů. Zatímco exprese celého protoxinového genu měla pro vlastní rostliny letá lni efekt, introdukce fragmentu tohoto genu byla rostlinami tolerována a hladina toxického proteinu tvořeného rostlinou byla dostatečné vysoká na larvy hmyzu. Z jiných typů B. thurin^iensis jsou izolovány 455 geny kódující specifické to x my vůči broukům a konstruovány chimérické geny k navození rezistence rostlin napr. k mandelince bramborové. Jako reakce na požer hmyzem nebo mechanické poranení dochází u některých druhů rostlin (například 7. čeledí Sf/iíiiiíitťae neho Viciaceae) k indukci syntézy seri nových protcinázových inhibitorů. které narušují trávit; í procesy předal ořů, a představují lak rostlinný obraňují mechanizmus proti nim. Napríklad gen kúdující try psi nový inhibitor jíž byl izolován a pomoc ľagrabakteriálního vektoru vnesen do jiného rostlinného druhu, kde po požeru způsoboval hynutí larev motýlů. 16.4.6.3 Transgeny jako indikátory aktivity induktorů rezistence Rostliny mají vyvinuty četné mechanizmy k obrané vůči biotickým i abiotickým stresům (kap. 15). Patří mezi ně například syntéza řady chemických látek nebi I k ovin né (inhibitory proteinů, antibiotika, lan i n y, fytoaleitiny, alelochemieké sloučeniny, nligogalaktu-ronidy) i bílkovinné povahy [lytické enzymy, proteiny indukované zvýSenou teplotou (heat-shock prateitts), proteiny indukované patogeny {ptíthogefíesis-retated proteins), melalolioneiny]. Syntéza těchto látek je obvykle vyvolána patogenem nebo jiným inducíbilním faktorem. Lze očekávat, že jejich zvýšená aktivita by mohla vést i ke zvýšené širokospektrální indukované rezistenci rostlin. Enzym chalkonsyntáza kaialy/,uje klíčovou regulační reakci při syntéze rostlinných antibiotik - fyto-alcxinii íodd, 15.3.3). Byly prolo zkonstruovány chimérické- geny obstihující c hal konsyn lazový inducibil-ní promotor a siruktumí gen kúdující reportérovy enzym /f-glukuronidázu (Doerner et al. 1990). Trans-gentií rostliny nesoucí tento chimérický gen jsou pak využívány k vyhledávání možných induktorů rezistence prostřednictvím snadné histochemické detekce /í-glukumnidázové aktivity. 16.4.6.4 Přenos genů navozujících rezistenci vůči herbicidům Půkud jo /.námo cílové místo účinku herbicidu na roMlinný metabolizmus (obvykle se jedná o specifické vazebné místo v molekule některého enzymu), je v principu možné prostřednictvím genového inženýrství modifikovat toto místo tak, aby sc herbicid stal pro kulturní transgetinť plodinu netoxickým. Prvního úspěchu bylo dosaženo u herbicidu glyfoz.átu. který blokuje funkci 5-enolpyruvylĚikimál-3-lbslálsyntázy (bPSP-symázy), klíčového enzym ľ bi osy n tézy aromatických sloučenin, což vede k „hladovění" na aromatické aminokyseliny, k hromadění Si k i mátu a k smrti rostliny. Z bakterie Saitnoneiia ryphimurhtm byla izolována mutanmí a tela tohoto genu kódující íiPSP-syn-lá/u. která díky jediné aminokyselinové substituci prokazuje výrazné sníženou afinitu ke gíyíozátu, aniž by tím byla ovlivněna funkce enzymu. Tento gen byl naklonovEin pod promotor cukaryotickcho typu a přenesen do rostlin, které pak vykazovaly vysokou toleranci ke glyfozálu. Jiný herbicid, chlorsuLfuroit, se vaře na enzym acetolaktátsyntázu, čímž blokuje bio-syntézu aminokyselin s rozvětvenou uhlíkovou kostrou. Mulantní alcla lohoto genu, necitlivá k chlorsul-I u runu, která byla izolovaná z Arabidopsis thaliatm, navodila rezistenci vůči herbicidu v transgenníeh rostlinách tabáku. Jako nej vhodnější se jeví využití strategií, které vedou k enzymatické detoxikaci herbicidu v rostlinách (Bollerman a Leemans 19BS). Herbicid bialaphos je tripeptidové antibiotikum produkované Streptomycín hygroHĽopicHb, které po rozštěpení peptidázami uvol-m n i ľ ľosľino'ľiciľi i aiiLtloĽon kyseliny i.-gliitamové). jcnžjc inhibitorem gluiaminsyntázy. Tento enzym má v rostlinách klíčovou roli v asimilaci amonných iontů a regulaci metabolizmu dusíku. Z mikroorganizmu 5. hygrvscopicus byl izolován gen, jehož produkt, fos-linotricinacctyltnmsfcráza, katalyzuje acelylaci toxického fosfinotricinu. Tento gen byl klon ován pod silným promotorem do ,,od zbrojeného'* Tr-plazmidu A. tumefaciens a navodil rezistenci transgenních rostlin tabáku, bramboru a rajčete vůči herbicidům biala-phosti a 1'osťinolricinu. 16.4.6.5 Regutovaná exprese chimérického metalotioneinu Genové inženýrství umožňuje řešit i problematiku některých toxických látek obsažených v rostlinné potravě. Patří sem zejména neesenctální těžké kovy (např. kadmium), které jsou přijímány rostlinami z půdy lí mohou se akumulovat v částech rostlin, které představují lidskou a živočišnou potravu. U myší byl identifikován a klonován gen kódující protein metalotío-ncin, který má schopnost vázat (chclatizovatj těžké kovy. Příslušná myíí c DNA byla klonována pod tran- 456 skřípení kontrolu promotoru regulovaného svěifcm z menší ptxljcdnotky genu Rubisco a byly zkonstruovány transgenní rostliny s metalotioneinovou aktivitou i vyšší hladinou kadmia. Chelatizací kadmia je možné navodit vyšší odolnost rostlin vůči tomuto kovu a navíc vyvázal kudminm v rŕch částech rostlin, které nejsou součástí potravních řetězců člověka. 16.4.6.6 Produkce farmakologicky významných látek Transgenní rostliny mají strategický význam i pro masovou výrobu ncj různějších biofarrňak- Tyto látky, ze-jména biologicky aktivní peptidyt mohou být produkovány jako Část chimérických rostlinných zásobních proteinů. Například část genu kódujícího albumin 2S u Artibitiopsi-n thatiarta byla nahrazena sekvencí kódující ne u rope pud leu-enkefatín se sousedním místem pro Štěpení peplidázou. Pomocí vektorového systému A. ninitfutŕťŕf.v byl tento konstrukt vnesen do rostlin A, ihaliana a albuminy 25 izolované ze semen byly tráveny trypsinem a izolován leu-enkefalin (Vande-kerckhove ei al. 1989), Touto relativní jednoduchou cestou je tedy možné dosáhnout masové produkce íur-makologicky důležitých látek ze semen transgenních rostlin. 16.5 Souhrn V průběhu posledních dvou desetiletí bylo dosaženo velkého pokroku v oblasti molekulární a bunččné genetiky rostlin. Stalo se lak díky objevu mužnosti vnášení klonovanýeh genů do rostlin pomocí bakterie Ag-robactcritfm tumefacieris a zejména pak díky využití nejmodernějíích technik molekulární genetiky. Rostliny jsou eukaryotickými organizmy s tripartitním ge-nomem (jádro, mitochendrte a plastidy). Jejich genetická informace je kódována sekvencemi nukleotidů v DNA. Vzhledem k tomu, že genetický kód je u rostlin a organizmů z jiných skupin eukaryot i prokaryot totožný, je možné rostlinný genom modifikovat přenosem cizorodých genů s vhodnými regulačními sekvencemi, S pomocí agrobukleriáľních vektoru již bylo připraveno mnoho transformovaných {transgen-ních) rosil in, které se uplatnily jak v základním výzkumu (studium struktury a funkce genů), lak i v zemědělské praxi. Struktura i počet genů v rostlinném jaderném genom u jsou v zásadě podobné jako u ji- ných cukaryotických organizmu. Jednotlivé druhy vyšších rostlin se často vyznačují velmi odlišnou velikostí jaderného genomu, přičemž lato velikost není v korelaci s komplexitou příslušných rostlinných organizmů. V ctí i n a druhu rostlin má vysoký obsah DNA v buněčných jádrech (az 10" párů bází], což souvisí se značně velkou frakcí opakujících se, obvykle inak-tivních a metylováných sekvencí DNA. Procesy diferenciace rostlin jsou řízeny kombinatorickým účinkem mnoha genů, které jsou exprimovány (v závislosti na vnéjíím prostřed0 přísně místně a časově. Podobně jako u jiných eukaryot byly i u rostlin identifikovány lzvr homeolické geny. které kódují transkripciu' faktory aktivující geny zodpovědné fit procesy tnorfogeneze. Současné výzkumy ukazují, Žc také mechanizmy ep i genetické dědičnosti odpovědné za milotický přenos informace o aktivitě genů (zejména metylace DNA, kinetiká replikace DNA a aee-tylace nukleozomálních histonů)jsou u rostlin obdobné, jako je tomu u ostatních eu kary etických organizmů, Vzhledem k neschopnosti lokomočního pohybu došlo u rostlin v průběhu evoluce k vytvoření mnoha mechanizmů, které zvyšují jejich schopnost adaptace vůči mčnícím sc životním podmínkám. Palří k nim i totipotence, tj. schopnost každé (somatické i gene rat i v ní) buňky dát vznik celému rostlinnému organizmu. Tato schopnost předšla v uje velkou výhodu pro využití rostlin jako experimentálních eu kary etických modelů. POUŽITA LITERATURA Aranson A. !„Bcckman W., Dunn P.(19Í6); Microtnol. Rev. 50: 1. Bonner M. D.. Smilh J. B. (.1476): Philos. Trans. R. Soc. Londc-n, B 274: 227. Rlackbum E H. (IWI); Trends Biochcm. Sei. 16; m. BtULcnman J., I jcmuns J. ( 19$$): Trends Geriet. 4; 219. Hriunn N.. Pimkowski J.. Penswkk J. R., Greenhorn B., Pntrykus I , Huhn T (19M) Náture 310: 511. Bum J E , BagnjH D. J.. Metzger L D , Dennis E. S., Peituck Vť J. (1993): Prot Mali. AĽad. Sei. USA 90: 2S7. Doerner P. W., Slermcr B.r Schmid J., Diion R. A.. Lnmb C. J- {1990): Bio/Technology S; «45. Dörinjj H P, Slůrlingcr P. (]S>Bú>: Annu. Rcv.Gtncl. 20: 175. Estrueh J. J.. PrinKen F.. van Onckclen U., Stliell J., Spěna A í 1991): Science 254: 1364 Finnegan E. J.r Pcacock W. J.. Dennis E. S. (199o>: Prot. Nml. Acad. Sei. USA 93: S449. Ravell R. B. (1980): Annu. Rev. Píam Phytiol. 31: 569. Ravdl R. B. 11*86); CWoíd Surv. PUnl Mol. Bioí. S: 251. Prent h R , Janda M., Ahlquisi P. (I9flft) Science 231: 1294. Gallie D. R. 11993): Annu. Rev. Plant Pliysiul. Plant Mol. Bio.1.44: 77. 4>7 Gin S , Amasimi R. M. < I995): Science 270: 1986 GoíxI X.. Kclldjii; J. A., Wuguner W., Langhoff D., MitSlflUO W.. Bcslwick R K (1994): Plant MdL Biol. 26: 781. Grandba*licn M.-A. (1992): Trends Gcncl. 8: 103. Grant S.. HouE>cfl A . Vysko! B., Siroky J.. WeiUus P.. Mhc^s J . Saedlet IT. (1994): Dev. Genet 15: 214. Grant S. G.r Chapman V. M. < I9BB): Annu. Rev. Genet. 21: 199. Hiatt A., Cafferkey R.. Bůwdish K. tl989): Nsivrt 342: 76. HoilkUy R. (1990): Philuj Trans R Soc. London. B 326: 329 luwtiiei H, Šimky J., Vyskoť B. (I99<Ö: Mni. Gen Omet, 250: 433. J a vnes J M , Yang M S., Espincuta IV., Dodds J H (1986): Trends Biotechnol 4: 314. KubkIc J. L.. Allcma.n M. {1990): Development [SuppU, 9. Kuroiwa T. (1982): Int. Rev. Cytol. 75: I. Ijndtchütze V.. VVilmili'cr 1... Müller Roher li. (IWÍ): EM HO J 14: 660. Leu in F, (19*3); Science 219: 47B. LOCk L F., 1 akagi N . Martin C. R. {.1487): Cell 4«: 3ft Lyndon R. F.. Francis D. (19921: Plant Mol Biol 19: 51 Mandel M. A., Bowman J. L., Kcmpin S. A., Ma H.. Mcycrowitz E. M . Yanofcky M. F ÍI992): Cell 71: 133. Marinní C. De ßcuckctccr M.. Tmcltncr J„ Lccmans J.. Guldberjj RR. (1990): Nature 347: 73 7. Msizkt M. A.. Matilte A. J. M. (1995): Plwii Physiol 107; 679. Mjyiurd Siiiitti J. (1990): J. TheOr. Biol. 143:41. Mcins F.. Jr. (1994): In: Mok D. W. S.. Mok M. C. (edi): Cylokimns. Chemistry. Aclivily. and Function. CRC Press. BocaRaton. 269. Mtltlei -Ruber B.. Sonnewatd U., Wülmirar L. (1992): EMBO J. 11: 1229 Magi W. (1990); In: Bajaj Y. P. S. (cd): Sumac tonal Variation in Grúfh Impruvemertl. Vol. I. Springer-Verlag, Berlin, t53. NcgruLiu I.. Gharli-Chlielri G. B. (cds) y 1091): A LarNwalyry Guide for Cellular and Molecular Plant Biology. Birkliauscr Verlag. Basel. Penamtbia L., Kim H_, Gtovannom J., Kim S.-H., Fischer R. L. CIW2); Biortcciinoloiy 10: 5*1. Potrykus I. (1990): Physiol Plant 79: 125. Sambrock J., Fritsch E. F.. ManiitisT (L9S9): Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Ed. 2. Cold Spring Harbor Lab Frcís. Mew York. S^hwur/.-SommeT Z., Hui.iiier P., Nackert W_, Sacdlcr H., Sommer H 11990): Science 250:931. Npcna A., Prinsen b.. Fladung M„ Schulze S. C, van Onckelcn H. (1991): Myl Gen. Genet 227: 205 Stark DM., Timincrman K. P., Barry G. F., Preiss J.. Kishúre G. M. < 1992): Science 258: 287. Tinland B. (1996): Trends Planl Sci. 1: 178 Topfer R . Martini N., Schel! J (1995): Science 2ÍS: 681. Vandckcrcktiove J., van Damme J., van LijscbcHcns M., Botlcrman J., Dc Block M„ Vandewiele M., Dc Clcrcq A., Lremun* J., van .vhimagu M.. Krebrm E. (19B9): Bio/Teťhnolůgy 7: 929. Vyskdl B.. Arayii A.. Vcuiktni J.r Neíjuliu I., Moitras A. Í1993): Mol. Gen. Genet 239: 219. VyxJcnl B.. KrtLikiilLivrl B.. KtivahTc A.. Saehambtila L., Reynalds D, Beidck M. (1995): Thcor. Appl. Genet 9Í: 659. Watbot V.Culhs C. A.(I9Ě5); Annu. Rev. Plant Physiol. 36: 367. Weil J. H f 1987): Ptaní Sii. 49: 149. DOPORUČENÁ LITERATURA AiriswuíiliC. (eií.)H h>98): Sci Determination in Plants.. Bios Scientific Publishers, Oxford. Gusiaíiiun J. P. (cd.) 11990): Gene Manipulaiiůn in Plum Tmpmvc-riMiňi, Vol. II. Plenum Pr-oss, New York. Holm 13 , Dennis E. S. (cds) (1985): Genetic FIuk in Planls, Springer- Vcrlag. Wicn. Jost Í. P., Salu/ K. P. (.eds) Í1993): DNA Methylatioii. Mdlecubr Minify and Bicldgical Siyniíicjrtuc Birkhiluser Verlag, BasL-1 Ondtcj M. (1992): Genoví inženýrství kullitmích rostlin. Academia, Praha. Shaw C H. (ed ) I19KS): Plant Molecular Biology: a Practical Approach, [RL Press. Oxford. 458 FYZIOLOGIE ROSTLIN prof. Ing. Stanislav Procházka, DrSc, RNDr. Ivana Macháčková, CSc, doc. Ing. Jan Krekule, DrSc, prof. Dr. Ing. Jiří Šebánek, DrSc. Autorský kolektiv: prof. RNDr. Jan Gloscr, CSc, prof, RNÍDr. Ladislav Havel, CSc, doc. Ing. Jan Krekule DrSc, RNDr. Ivana Macháčková, CSc, prof. RNDr, Lubomír Nátr, DrSc, RNDr. Ilja PráSil, CSc, prof. Ing. Stanislav Procházka. DrSc, prof. RNDr. Zdeněk Sladký, DrSc, Ing. Jiří Šuninlcek, CSc, prof. Dr. Ing. Jiří Šebánek, DrSc. prof. RNDr. Marta Tesařová, CSc, doc RNDr. Boris Vyškol, CSc. Vydala Academia nakladatelství Akademie vôd Českč republiky Legemva 61, Praha 2 s finanční podporou Fondu Akademie ved České republiky pio vydáváni vedecké literatury Va/bu i pouritím reprodukce obrazu Jiřího Valeni} navrhl Okv Man Redaktorka publikace RNDr. Lva l.eincnovi Technická redaktorka Běla Tmiíovská Vytiskla CENTA, spol. s r. o., odštěpný závod Brno, Vídeňská 113 Vydání 1., Praha 1998 Ed. číslo 4903 ISBN 80-200-0586-2