Michaela Vorlíčková Institute of Biophysics Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i. Brno Laboratory of Biophysics of nucleic acids CD spektroskopie a konformační vlastnosti DNA [USEMAP] U:\MIFI\obrazky\sbírka\kolostruktur.png C:\WINDOWS\Plocha\image002.jpg [USEMAP] U:\MIFI\obrazky\sbírka\kolostruktur.png [USEMAP] Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M.: Nucleic Acids Res. 37 (2009) 1713-1725. [USEMAP] Cirkulární dichroismus a optická aktivita biopolymerů ) optická aktivita – chirální látky (aminokyseliny, cukry) úhel stočení roviny polarizovaného světla, ORD Paprsek, levo-, pravotočivý, paprsek prochází prostředím… Phenomenon, veličina U:\MIFI\obrazky\sbírka\Macek-poekresl..jpg glycin Specific rotation [α]Tλ = α/cl [USEMAP] Cirkulární dichroismus a optická aktivita biopolymerů ) optická aktivita – chirální látky (aminokyseliny, cukry) úhel stočení roviny polarizovaného světla, ORD ) CD – princip, veličiny, elipticita, ΔA, Δε, vztah mezi ORD a CD U:\MIFI\obrazky\sbírka\Macek-poekresl..jpg Cirkulární dichroismus Δε Δε = εL – ε R = ΔA/cl, θ=3300. Δε Elipticita φ [θ] tg θ = b/a = εL – ε R/ εL + ε R [USEMAP] V:\mifi-obr\nové obr pro CD presentaci\obrA.bmp V:\mifi-obr\nové obr pro CD presentaci\obrC.bmp [α] λ[nm] U:\MIFI\obrazky\sbírka\Macek-poekresl..jpg Cottonův efekt Optická rotační disperse (ORD) [USEMAP] V:\mifi-obr\nové obr pro CD presentaci\obrF.bmp Cottonův efekt λ[nm] Optická rotační disperse (ORD) [USEMAP] V:\mifi-obr\obr12.bmp l ORD + CD ORD - CD [USEMAP] V:\mifi-obr\obr1.bmp α-helix β-sheet β-turn CD of proteins [USEMAP] Podmínky vzniku CD DNA • ABSORBCE CHIRALITA + BÁZE * CUKR CD http://biology-forums.com/gallery/33_23_06_11_4_12_30.jpeg [USEMAP] V:\mifi-obr\obr2.bmp [USEMAP] Podmínky vzniku CD • ABSORBCE CHIRALITA + BÁZE * CUKR CD [USEMAP] Cirkulární dichroismus a optická aktivita biopolymerů ) optická aktivita – chirální látky (aminokyseliny, cukry) úhel stočení roviny polarizovaného světla, ORD ) CD – princip, veličiny, elipticita, ΔA, Δε, vztah mezi ORD a CD ) Výhody a nevýhody CD spektroskopie ve srovnání s jinými metodami studia biopolymarů Výhody Citlivost - nízká koncentrace studované látky snadná rozpustnost i v extrémních podmínkách Snadná manipulace - titrace přechody mezi různými strukturami celý konformační prostor Nevýhody Pro složité molekuly jakými je DNA chybí explicitní vztah mezi spektrem CD a strukturou Rozlišení mezi kooperativními a nekooperativními změnami [USEMAP] 40dichro [USEMAP] 02fibryA 03fibryB 04fibryC A B C,D,E,T [USEMAP] 05BCA Tunis-Schneider, M.J.B. + Maestre, M.F. [USEMAP] Kooperativní změny mezi diskrétními strukturami 06a Příklady nekooperativních a kooperativních změn 06a Nekooperativní změny v rámci téže struktury Ivanov, V.I [USEMAP] V:\Iva\učebnicováB.jpg U:\MIFI\obrazky\sbírka\ucebnicovaA.jpg [USEMAP] 220 300 R L GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC l Pohl, F,. Jovin T.: J.Mol Biol 1972 [USEMAP] 06Olson Vilma Olson [USEMAP] V:\mifi-obr\sejmout.jpg V:\mifi-obr\sejmout0005.jpg Sasisekharan [USEMAP] 09Z 08 Z Dickerson [USEMAP] 11B 10B B Dickerson [USEMAP] V:\mifi-obr\sejmout0001.jpg [USEMAP] CD spectral changes accompanying B-Z transition of poly(dG-dC) V:\mifi-obr\ZDFB51-biol1_files\ZDFB51-biol1.jpg B-forma Z-forma wavelength [nm] [USEMAP] V:\mifi-obr\obr7.bmp 12Ivanov V:\mifi-obr\BDJB49-biol1_files\BDJB49-biol1.jpg V:\mifi-obr\ZDFB51-biol1_files\ZDFB51-biol1.jpg V:\mifi-obr\ADH020-biol1.jpg [USEMAP] 13BZ,BX ATATATATATATATATATATATATATATATATATATA Vorlíčková, M., Sklenář, V., Kypr, J.: J. Mol. Biol. 166 (1983) 85-92 [USEMAP] V:\mifi-obr\obr5.tif X-DNA ATATATATATATATATATATATATATATATATATATA Vorlíčková, M., Sklenář, V., Kypr, J.: J. Mol. Biol. 166 (1983) 85-92 [USEMAP] 14zvyraz B B-A A A-X B-X X [USEMAP] V:\mifi-obr\Fig2.jpg ALTERNATING A-T FRAGMENT WITH HOOGSTEEN BASE PAIRING Subirana, J. Proc.Nat.Acad.Sci.USA , 99, pp. 2806, 2002. Biochemistry , 43, pp. 4092 - 4100, 2004. V:\mifi-obr\Fig1.jpg [USEMAP] G C G C G C C G C G C G … … A T A T A T T A T A T A … … A C A C A C T G T G T G … … (Pu)n . (Py)n complexes Alternating (Pu-Py)n B A Z B A X Z B A Z X G G G G G G C C C C C C … … A A A A A A T T T T T T … … A G A G A G T C T C T C … … poly(dG).poly(dC) poly(dA).poly(dT) poly(dA-dG).poly(dC-dT) [USEMAP] C:\WINDOWS\Plocha\149D-inset.jpg DNA Triplex Radhakrishnan, I., Patel, D.J. (1994) Pyrimidine. Purine. Pyrimidine V:\mifi-obr\sejmout0004.jpg [USEMAP] C:\WINDOWS\Plocha\135D-model.jpg DNA TRIPLEX T C C T C C T T T T T T A G G A G G A T T T T T T G G T G G T Radhakrishnan, I., Patel, D.J. (1993) Pyrimidine. Purine. Purine V:\mifi-obr\sejmout0004.jpg [USEMAP] U:\MIFI\presentace\Bez názvu 1.tif U:\MIFI\presentace\Bez názvu 2.tif U:\MIFI\presentace\Bez názvu 3.tif [USEMAP] Quadruplexes Wang, Y., Patel, D.J. (1994) Kang, C.H. et al.(1994) frequently occur in promoters of genes and were shown to control their expression. [USEMAP] 27i-tetr i - motif Two parallel-bonded duplexes are intercalated in the antiparallel fashion U:\MIFI\obrazky\sbírka\C.C+.jpg Leroy, J.L., Gueron, M.,1995 V:\mifi-obr\UDF043-inset.jpg [USEMAP] 28PY copy (1) TCCCCACCTTCCCCACCCTCCCCACCCTCCCCA Fragmenty promotoru c-myc [USEMAP] V:\mifi-obr\UDF062-inset.jpg CD spectra reflecting formation of a parallel and antiparallel guanine quadruplex V:\mifi-obr\UD0014-inset.jpg RNA DNA DNA K [USEMAP] WAVELENGTH [nm] Fragment Pu-27 promotoru c-myc: TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG Pan, A.T. et al.: J.Am.Chem.Soc.126(2004)8710 V:\Iva\obr3.JPG V:\mifi-obr\Fig8.jpg V:\mifi-obr\G_Q_Elsevier.JPG [USEMAP] V:\mifi-obr\Figure1.jpg V:\mifi-obr\Figure2.jpg V:\mifi-obr\Figure5.jpg Parkinson, G.N., Lee, M.P.H, Neidle, S. Nature 417 (2002) 876-880. d(TAGGGTTAGGGT) 12 d[AGGG(TTAGGG)3] 22 [USEMAP] Human telomeric DNA forms quadruplex Xu, Y.: Chem. Soc. Rev. (2011) C:\WINDOWS\Plocha\143D-model.jpg The telomere quadruplex became a target for developing anticancer drugs Telomeric DNA is associated with aging [USEMAP] Guanine quadruplex topology of human telomere DNA is governed by the number of (TTAGGG) repeats. Nucleic Acids Res. 33 (2005) 5851-5860. wavelength [nm] G3(TTAG3)n in 150 mM K+ 1mM Na phosphate Number of G3 blocks 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 16 17 3+1 [USEMAP] AG3(TTAG3)3 TAG3(TTAG3)3 AAAG3(TTAG3)3AA U:\Iva_U\2007\Mifi_Albany\3+1_lsam.jpg U:\Iva_U\2007\Mifi_Albany\3+1_sam.png TAG3(TTAG3)3TT 3 + 1 Luu, K.N., Phan, A.T., Kuryavyi, V., Lacroix, L., Patel, D.J. (2006) J.Am.Chem.Soc., 128, 9963-9970. Ambrus, A., Chen, D., Dai, J., Bialis, T., Jones, R.A., Yang, D. (2006) Nucleic Acids Res. 34, 2723–2735. Phan, A. T., Luu, K.N., Patel, D.J. (2006) Nucleic Acids Res., 34, 5715-5719. anti syn K+ 3 + 1 [USEMAP] obr8 Long telomere molecules have a beads on a string- like arrangement Xu, et al. Angev. Chemie (2009) How does the structure of the long telomere DNA look like? Nucleic Acids Res. 33 (2005) 5851-5860 What is the structure of the bead? AFM [USEMAP] 3-50 mM strand concentration in CD 3 + 1 AG3(TTAG3)3 TAG3(TTAG3)3 AAAG3(TTAG3)3AA U:\Iva_U\2007\Mifi_Albany\3+1_lsam.jpg U:\Iva_U\2007\Mifi_Albany\3+1_sam.png TAG3(TTAG3)3TT 3 + 1 U:\Iva_U\2007\Mifi_Albany\chair.jpg CHAIR AG3(TTAG3)3 BASKET Phan, at al.: Nucleic Acids Res. 34 (2006) 5715-5719. He et al.:Nucleic Acids Res. 32 (2004) 5359-5367. Matsugami, et al.:. Nucleic acids symp. series, 50 (2006) 45-46. Xu et al.: Bioorg.& Medicinal Chem. 14 (2006)5584 – 5591. Lim, et al.: J.Am.Chem.Soc. 131 (2009) 4301–4309. anti syn 0.2-5 mM strand concentration in NMR BASKET two tetrads AG3(TTAG3 G3(TTAG3)3 AG3(TTAG3)3 TTAG3(TTAG3)3 G3(TTAG3) 3T Luu, et al.: J.Am.Chem.Soc., 128 (2006) 9963-9970. Ambrus, et al.: Nucleic Acids Res. 34 (2006) 2723–2735. Parkinson, Lee, Neidle: Nature 417 (2002) 876-880. Balagurumoorthy, Brahmachari: J. Biol. Chem. 269 (1994) 21858-21869. Redon et al.: Nucleic Acids Res. 31 (2003) 1605-1613. K+ PARALLEL What may be the reason that different quadruplex structures were observed by various methods? [USEMAP] telomerni telomerni telomerni telomerni telomerni telomerni In nucleosides: 200 mM 120 mM 55 mM 16 mM 0.8 mM ( 0.1 mM) What may be the reason that different quadruplex structures were observed by various methods? G3(TTAG3)16 •Nucleic Acids Research 37 (2009) 6625-6634. Renčiuk et al.: Nucleic Acids Research 37 (2009) 6625-6634 [USEMAP] CHIROPTICKÉ METODY Optická rotační disperze-ORD Závislost úhlu stočení roviny polarizace lineárně polarizovaného světla průchodem opticky aktivní látkou na vlnové délce procházejícího záření. (180-800 nm) Cirkulární dichroismus-CD Závislost rozdílu absorpce pro vlevo a vpravo kruhově polarizované světlo na vlnové délce absorbovaného záření v oblasti energií elektronových přechodů. (180-1000 nm) Infračervený cirkulární dichroismus-IRCD (VCD) Závislost rozdílu absorpce pro vlevo a vpravo kruhově polarizované světlo na vlnové délce absorbovaného záření v oblasti energií vibračních přechodů. (1-5 um) Fluorescenčně detegovaný cirkulární dichroismus-FDCD Závislost rozdílu intenzity fluorescence, excitované vlevo a vpravo kruhově polarizovaným světlem na vlnové délce excitačního záření. (~ 200 nm až vlnová délka emise) Cirkulárně polarizovaná luminiscence (emise)-CPL (CPE) Spektrální průběh rozdílu intenzit (spontánní) emise vlevo a vpravo cirkulárně polarizovaného světla. (Interval vlnových délek emise chromoforu) Cirkulární diferenciální Ramanův rozptyl-Raman CID Spektrální průběh rozdílů intenzit Ramanova rozptylu vlevo a vpravo kruhově polarizovaného dopadajícího záření. (Interval vlnových délek Ramanova jevu) [USEMAP] CD spektroskopie a konformační vlastnosti nukleových kyselin Otázky ) Co je optická aktivita, chirální látky, optická rotace, cirkulární dichroismus ) Jaké jsou (dvě) podmínky vzniku cirkulárního dichroismu (přislušná látka musí být chirální a absorbovat světlo) ) které komponenty odpovídají za vznik CD nukleových kyselin a proteinů ) Jaké jsou výhody a nevýhody metody CD ve srovnání s dalšími metodami struktury biopolymerů ) Co je podstatou unikátní citlivosti metody CD ke strukturním změnám v NA? ) Co je optická rotační disperse a Cottonův efekt? ) Podstata nekooperativních a kooperativních změn ) Globální charakteristika forem B, A a Z DNA (zejména žlábky, obrácená topologie párů bází v případě Z formy) ) nekanonické sekundární struktury DNA ) typy čtyřřetězcových uspořádání NA mifi@ibp.cz [USEMAP]