Imortalizace buněk Proč? - převedení primokultur v permanentní linie - zjednodušení kultivačních podmínek a)Spontánně – pomalé, často málo účinné b) b)Cíleně - fyzikálními faktory: Gama záření, Rentgenové záření (záření X), teplota - chemickými faktory: NiCl, NiSO4, Dimethylsulphate, N-methyl-N-nitrosouera (MNU), benzo[a]pyrene diol epoxide, 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) - biologickými faktory: viry - virus Epstein Barrové, virus myší leukémie, virus Rousova sarkomu, SV40 vektory (plasmidy / viry) exprimujícími transformující protein, např. antigen SV40 large T nebo adenovirus E1A,.. [USEMAP] Cílené genetické manipulace Změny genetické informace, vložením, poškozením nebo vypnutím genu / genů - Vektory plasmidové a virové - - Chemicky nebo fyzikálně – viz. imortalizace The image “http://orders.clontech.com/clontech/techinfo/vectors/vectorsA-B/images/pAcGFP1-Tubulin.gif” cannot be displayed, because it contains errors. [USEMAP] Vnesení vektoru do buněk a)Infekcí – viry b)Chemicky -lipofekce: obalení vektoru s lipidy a fúze komplexu s cytoplasmatickou membránou -Ca2+ precipitace: vysrážení vektoru na povrchu buněk v komplexu s Ca2+ a jeho pohlcení buňkou endocytózou -transfekce pomocí dextranu: komplex vektor / dextran spojený diethylaminoethylem je endocytován do buňky -transferofekce: vektor je navázán na transferin a přes transferinový receptor endocytován do buňky c)Mikroinjikace d)Elektroporace - narušení buněčné membrány elektrickým výbojem a difůze vektoru do buňky e)Nucleofekce - elektroporace v kombinaci s chemií, přenos vektoru do jádra f)Biolisticky – vektor navázaný na partikuli (zlato, wolfram) je vstřelen do tkáně, buněk [USEMAP] Lipofekce [USEMAP] Elektroporace & nukleofekce [USEMAP] Biolistika [USEMAP] Mikromanipulátor [USEMAP] Selekce buněčných klonů Adherentní buňky pod selekčním antibiotikem, při dostatečné nízké účinnosti transfekce nebo jejich konfluenci tvoří samostatné kolonie, které lze mechanicky, případně za pomoci proteáz (trypsin, kolagenáza) oddělit Suspenzní buňky pod selekčním antibiotikem je třeba rozklonovat mezním ředěním (někdy potřeba i u adherentních), nebo růst v polotekutém / viskózním médiu (agar apod.) Nejběžnější selekční antibiotika pro savčí buňky G418 / Neomycin, Hygromycin B, Puromycin [USEMAP] Dodatek – TKÁNĚ a ORGÁNY Tkáně umíme kultivovat / připravovat jen velice omezeně, většinou jde pouze o uchování po určitou dobu, podobně jako orgány. U orgánů je již aktuální otázka přívodu živin, kyslíku a odvodu metabolitů a CO2. Orgány je tedy třeba mít metabolicky utlumeny (podchlazením) a nebo napojeny na oběh s živinami simulující krevní zásobení. V současné době je zvládnutá problematika krve (lze zamrazit), částečně pak epidermis / kůže a jaterní tkáně. Intenzivně se studují možnosti využití buněk pankretu (Langernhansových ostrůvků) z prasat. Velkým příslibem pro transplantace jsou také buňky a tkáně připravené z kmenových buněk. Epidermis – primokultury prasečích / lidských keratinocytů pěstované na syntetických nosičích se používají k regeneraci poškození epidermis po popáleninách apod. Částečné úspěchy jsou při přípravě umělých jater, kdy separované hepatocyty jsou vysety do reaktoru na rozvodné potrubí z polopropustných membrán. Celý takový bioreaktor pak připomíná skutečná játra s krevní oběhem a odvodem žluči. Hepatocyty se však zatím nedaří dostatečně efektivně zamražovat k dlouhodobému uskladnění a tak využití podle potřeby. [USEMAP] Rostlinné explantáty RNDr. Helena Lipavská, Ph.D. Podobné tkáňovým kulturám -Nároky na čistotu / sterilitu -Práce v laminárních boxech -Růst za sterilních podmínek +/- -Speciální inkubátory, klimaboxy – světelný režim -Živné půdy s agarem (pevné), v závislosti na typu +/- glukóza klimabox [USEMAP] Celistvé rostliny Rostlinná pletiva -kalus Protoplasty Mikrospóry [USEMAP] [USEMAP] Založení kultury a její regulace Doporučená literatura: Lesko, J. a kol.: Práce s tkanivovými kulturami, Bratislava, Vydavatelstvo slovenskej akademie ved 1975, s. 212. Alberts, B. a kol.: Základy buněčné biologie. Úvod do molekulární biologie buňky. Ústí nad Labem, Espero Publishing 1998, 630 s. Alberts, B. a kol.: Molekular biology of the cell. New York & London, Garland Publishing, Inc. 1994, 1294 s. Spector, D. L. a kol.: Cells. A laboratory manual. Volumes 1, 2, 3. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998, 3 197 s. Cellis, J. E. a kol.: Cell Biology. A laboratory handbook. San Diego, London, Academic Press Inc. 1994, 1714 s. Sambrook, J. a kol.: Molecular Cloning. A laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 1832 s. Ausubel, F. a kol.: Short Protocols in Molecular Biology. USA, Published by John Wiley & Sons Inc. 1995, 728 s. [USEMAP]