metody využívající sérologické reakce A. Precipitační metody V kapalinách V gelu B. Imunodifuzní metody •Jednoduchá imunodifúze •dvojitá imunodifúze C. Imunoelektroforetické metody Kombinace s elfo •Imunoelektroforéza podle Williamse a Grabara •Raketová imunoelektroforéza •Protisměrná •Dvojrozměrná •D. Aglutinační metody E. Hemaglutinační F. Komplementové G. Immunoblotting Zákalové reakce •Imunonefelometrie •Imunoturbidimetrie H. Imunochemické metody a) RIA b) FIA c)EIA Časové rozdělení metod •Metody I.generace •Některé techniky v roztoku – precipitační, aglutinační, KFR •Metody II.generace •Kvantitativně i složité směsi antigenu •Imunodifúze, imunoelfo •Metody III.generace •Velmi citlivé metody při stanovení Ag, Ab i haptenů •Imunoanalýzy – př. RIA, FIA, EIA, imunoturbidimetrie •– nefelometrie, -fluorimetrie, chemiluminiscence, popř jejich kombinace •Metody IV.generace •Kontinuálně měří Ag, Ab i hapteny •Imunosenzory, MALDI - TOF, SELDI – TOF hmotnostní spektroskopie Příklady metod I.-IV. generace •Metody I.generace – pacientův vzorek obsahující S. aureus koaguluje králičí plasmu •Metody II.generace – ve vz. pacienta se identifikují povrchové Ag S. aureus pomocí fibrinogenu / IgG, rutinní Metody III.generace – stanovení Ag pouzdra S. aureus, odhalení MRSA (metycilin rezist.), bez pouzdra – reakce s fibrinogenem nebo nebo IgG •Metody IV.generace – zjištění rezistentního kmene hned! CM-MP částice (Carboxylate modified microparticles) navázány na latex a jsou schopné detekovat kapsulární polysacharidy S. aureus ve vzorku pacienta. Silná, jasně viditelná aglutinace za 20s. • • • •1929 Heidelberg a Kendall – popsali reakci rozpustného Ag s odpovídající Ab ve vhodném poměru. •Výsledek reakce – precipitát •Stanovili precipitační křivku a 3 oblasti reakce Ag s Ab Precipitační křivka Precipitační křívka Závislost tvorby precipitátu na vzájemné koncentraci protilátka – antigen (Stanly, 2002) Imunoprecipitační křivka (Ag – antigen, Ab – protilátka) Oblast ekvivalence Precipitační metody Oblast nadbytku protilátky Nekompetitivní metody • zákalové nefelometrie turbidimetrie • s markerem EIA, IRMA.. Oblast nadbytku antigenu Kompetitivní metody • heterogenní RIA, ELISA.. • homogenní EMIT (EIA)… - faktory ovlivňující precipitaci: · typ Ab /např. IgG/ · teplota – se zvyšující se teplotou se urychluje precipitace /např. 38°C/ · vzájemná koncentrace Ag a Ab · pH · iontový náboj · tvar a velikost části Serologické metody - precipitace •Ag + Ab ® Ag-Ab • precipitinogen precipitin precipitát sraženina •solubilní /rozpustný/ •Koncentrace 0,1g/ a vyšší!! •- dělíme: •A) v kapalinách : •I. prstencová • – prstenec sraženiny precipitátu • • •II. sklíčková – určení pod mikroskopem •B) v gelu: •IMUNODIFÚZE PRECIPITAČNÍ metody: •využití : ke stanovení Ag, Ab, H •praxe – 1. zjištění výskytu či stanovení Ab v séru při inf. onemocnění 2. identifikace Ag (patogena) •Koncentrace Ab se vyjadřuje jako TITR SÉRA. • => nejmenší zředění Ab, které ještě reaguje s Ag •- hodnocení : kvalitativně – odečtení okem •· kvantitativně : •a, zjištěním množství precipitátu •b, zjištěním množství Ag v precipitátu či supernatantu •c, změna optických vlastností vzorku – 2 metody : •NEFELOMETRIE –* TURBIDIMETRIE •Velmi nízké mn. precipitátu lze hodnotit pomocí detekčních systémů využívajících Ab nebo Ag značené radioizotopem, fluoresc. látkou, enzymem, luminiscenční látkou PRECIPITAČNÍ metody: • • Titrace séra Precipitační imunochemické metody Screeningové metody – jednoduché precipitační testy terénní kazetové testy pracující v oblasti ekvivalence, imunochromatografická Vzorky: moč, výtěr z nosu, pochvy, konečníku, krev jen vyjímečně ! Stanovení Ag nebo Ab a jejich vizualizace barevnou složkou S T C S T C Negativní výsledek Pozitivní výsledek Za přítomnosti drogy ve vzorku moče reaguje s Ag drogy protilátka za vzniku imunokomplexu (precipitát) se v místě testu T. (S – vzorek, C – kontrola) Využití: Rychlé chromatografické testy – stanovení přítomnosti drogy v tělesných tekutinách, Ab (na desce přítomný antigen) nebo Ag (na desce přítomná protilátka, např.u infekčních nemocí (Chlamydie, Streptococcus pneumoniae, Adenovirus, Rotavirus, Helicobacter pylori, Influenza A,B hormon gonádotropin u těhotných žen) Imunodifúze - specifická reakce Ag s Ab - precipitace /gel z agaru nebo agarózy/- AGAR ~ směs polysacharidů extrahovaných z červených mořských řas * ® přírodní agar nutno přečišťovat ~ frakcionací vznikají 2 složky:· agaróza - neobsahuje vedlejší aniontové skupiny - pro difúzi více vhodná - standardnější složení než agar a nižší schopnost nespecifické adsorpce · agaropektin - obsahuje aniontové skupiny ® pro difúzi nevhodný imunodifúze •příprava gelu: • rozvaření agarózy v pufru na vodní lázni •nanesení na skleněné destičky – ztuhnutí ve vodorovné poloze /při teplotě pod 42°C/ •princip ID: •- vzájemná volná difúze Ab a Ag v gelu na základě koncentračního spádu až do místa střetnutí ~ zde vznikají precipitační linie®obloučky®prstence®kruhy /záleží na použitém materiálu/ •- vzniklé precipitáty detekujeme: •* okem - zákal •* barvením – Coomassie blue, amidočerň •* sekundárními protilátkami •* Au, Ag, radioizotopy •- vznik precipitátů je děj postupný!!! • Imunodifúze - rozdělení imunodifúzních metod: •* jednoduchá imunodifúze – gelem difunduje pouze jedna složka –Ag nebo Ab •* dvojitá imunodifúze – gelem difundují obě složky– Ag i Ab •· jednorozměrná – složka putuje v gelu jedním směrem •· dvojrozměrná /radiální/– složka putuje více směry •Ag a Ab si neodpovídají – nevytvoří se precipitační linie •Směs více typů Ag a Ab – počet linií odpovídá počtu sobě si odpovídajících párů Ab a Ag • Imunodifúze •jednoduchá imunodifúze- migruje 1 složka: •1. složka se smíchá s gelem už při jeho přípravě (nemigruje) •2. složka se aplikuje následně do vyřezaných jamek – MIGRUJE – v místě vyrovnání koncentrací vzniká precipitační linie •Jednoduchá jednorozměrná imunodifúze ~ dle OUDINA •- ve spodní části zkumavky agarózový gel s Ab, převrstveno roztokem s Ag - zalito parafínovým olejem – zábrana odpařování •- čím je Ag koncentrovanější, tím dále od roztoku s Ag vznikají precipitační linie /odečitatelnější/ •- využití: · detekce počtu Ag párů roztok s Ag gel s Ab olej Imunodifúze •Jednoduchá radiální /dvojrozměrná/ imunodifúze dle MANCINIOVÉ •- na skleněnou destičku se nalije gel, který obsahuje Ab ® nemigruje • inkubace ve vlhké komůrce ve vodorovné poloze → difúze všemi směry (radiální) • po obarvení - modré precipitační prstence •® čím je vzorek koncentrovanější – větší průměr prstence •→ změření druhé mocniny průměrů prstenců – vynesení kalibrační křivky a odečet koncentrace neznámého vzorku- •využití: •· ke kvantitativnímu stanovení Ag •· klinická praxe: stanovení koncentrace IgG, IgA, IgM, IgD, složek komplementu a proteinů akutní fáze • jamky - vzorky: -gel s Ab * fyziologický roztok –blank * vzorky o neznámé koncentraci * vzorky o známé koncentraci (kalibrační) •dvojitá imunodifúze •- gelem difundují obě složky •- koncentrace Ag a Ab musí být vzájemně ekvivalentní – proti překrývání linií •Dvojitá jednorozměrná imunodifúze •- ve zkumavce agarózový gel s Ab a agarózový gel s Ag •- mezi nimi čistý gel – v místě vyrovnání koncentrací se vytvoří precipitační linie- •využití: · kvalitativní důkaz Ag •· určení imunochemické příbuznosti či odlišnosti Ag • • Imunodifúze •Dvojitá radiální imunodifúze ~dle OUCHTERLONYHO •na skleněné desky nanesen čistý gel •menší jamky – různé Ag či různé koncentrace jednoho Ag •větší prostřední jamka – Ab •koncentrovanější Ag → precipitační obloučky blíže jamky s Ab •inkubace ve vlhké komůrce •počet precipitačních linií odpovídá počtu odpovídajících si párů Ag a Ab •Využití – průkaz Ab při alergických alveolitidách, průkaz Ab proti některým patogenům, např. Toxoplazma gondii Imunodifúze Imunodifúze, odlišení Ag • • •- využití: •· titrace Ag – koncentrace Ag určuje umístění precipitační linie •· důkaz přítomnosti Ab •· porovnávání identity a neidentity Ag směsí ® umístění precipitační linie Ag porovnání Mr (Ag) a Mr (Ab) ® určuje tvar precipitační linie - menší molekula se dostane dále do gelu Souhrn využití ID •Kvalitativní i kvantitativní stanovení Ag, a Ab, porovnání Ag směsí •stanovení koncentrace IgG, IgA, IgM, IgD, složek komplementu a proteinů akutní fáze •průkaz Ab při alergických alveolitidách, průkaz Ab proti některým patogenům, např. Toxoplazma gondii