Biochemie •Česká studijní literatura §Milan Kodlíček, Olga Valentová, – Radovan Hynek Biochemie. VŠCHT, 2015 – §Zdeněk Vodrážka. Biochemie. – 3. opr. vyd. Praha : Academia, 2007. § §Šípal, Zdeněk. Biochemie. 1. vyd. Praha : Státní pedagogické nakladatelství, 1992. § §Voet, Donald - Voet, Judith G. Biochemie. Translated by Arnošt Kotyk. 1. vyd. Praha : Victoria Publishing, 1995. § Biochemie •Anglická studijní literatura §Voet, Donald - Voet, Judith G. – Biochemistry. 4th ed. Hoboken : – John Wiley & Sons, 2011 § §Voet, Donald - Voet, Judith G. - Pratt, Charlotte W. Fundamentals of biochemistry :life at the molecular level. 3rd ed. Hoboken, N.J. : John Wiley & Sons, 2008. § §Boyer, Rodney. Concepts in biochemistry. 2nd ed. New York : John Wiley & Sons, 2002. Biochemie –1. ÚVOD –2. BÍLKOVINY - Struktura, vlastnosti a funkce –3. NUKLEOVÉ KYSELINY - Struktura, vlastnosti a funkce –4. SACHARIDY - Struktura, vlastnosti a funkce –5. LIPIDY - Struktura, vlastnosti a funkce –6. ENZYMOLOGIE –7. METABOLISMUS A BIOENERGETIKA –8. METABOLISMUS SACHARIDŮ –9. FOTOSYNTÉZA –10.METABOLISMUS LIPIDŮ –11.METABOLISMUS BÍLKOVIN –12.REGULACE BIOCHEMICKÝCH PROCESŮ –13. MOLEKULÁRNÍ FYZIOLOGIE –14. XENOBIOCHEMIE – Zkouška z biochemie Biochemie §chemická disciplína, která studuje chemické složení živé hmoty a chemické procesy, které v ní probíhají § §je hraniční vědní disciplínou, na pomezí mezi chemií a biologií, zkoumá biologické objekty chemickými metodami •Studium tělních tekutin pro klinickou diagnostiku •+ procesy v organismu probíhající •Molekulové složení organismů •BIOCHEMIE • •Hoppe Seyler •1877 •Neuberg •1903 •Biologické membrány •Biologický kód > •MOLEKULÁRNÍ •BIOLOGIE •Astburry •1961 • •Interpretace genetiky na základě struktury NK •Trojrozměrná struktura biomolekul •O. von Warburg (NC 1931) Výsledky pokusu in vitro nesmí být v rozporu se situací in vivo Literatura http://media.wiley.com/product_data/coverImage300/72/04700290/0470029072.jpg Látkové složení • •XXX základní makroprvky (makrobiogenní) •YYY další makroprvky (mikrobiogenní) •ZZZ mikroprvky (stopové) Prvkové složení vesmíru, zemské kůry a člověka Porovnání zastoupení základních biogenních prvků v živé a neživé hmotě •(Si) •?? Voda Voda table 2-03 Voda •Na vodu vázán vznik života • •Je rozpouštědlo • •Má transportní funkci • •Účastní se chemických reakcí • •Udržuje stálost vnitřního prostředí –I, pH, T •5 % •95 % •Sušina • • •Kondenzační reakce - uvolňování H2O → rovnováha posunuta ve směru opačném Sledování rozdílů mezi biopolymery - vývoj života Fylogenetický strom (rRNA) • •Carl Woese •Srovnání molekul rRNA •600 mil. let •současnost •Biochemická taxonomie Fylogenetický strom Prokaryontní bakteriální buňka • Prokaryontní bakteriální buňka Eukaryontní živočišná buňka • Eukaryontní rostlinná buňka Eukaryontní buňka Vznik eukaryotních buněk Lynn Margulis – 1960,1981 endosymbiotická teorie Hypothesized origin of mitochondria and chloroplasts Organizace biologických struktur • •Populace •Biocenosa •společenství •Biosféra figure 1-07c Viry figure 1-07a figure 1-07b figure 1-07d Viry Evoluce života na zemi 1.Chemická evoluce – jednoduché anorganické molekuly dávají vznik organickým polymerům 2. 2.Vznik uspořádaných struktur biopolymerů – ty jsou schopná autoreplikace- RNA 3. 3.Biologická evoluce – evoluce od jednobuněčných k mnohobuněčným živočichům Evoluce života na zemi •Chemická evoluce Evoluce života na zemi Miller Orgel Evoluce života na zemi T01-04.jpg 0005BABDMacintosh HD B74677AA: Evoluce života na zemi •Chemická evoluce •Vznik uspořádaných •struktur biopolymerů •+ LASER → base RNA Evoluce života na zemi •Chemická evoluce •Vznik uspořádaných •struktur biopolymerů •RNA •Biologická evoluce Bílkoviny •Jsou to biomakromolekuly s nejlépe poznanými a definovanými vlastnostmi : • •Fyzikálními – MW, spektra, pI, •Chemickými - složení a struktura •Biologickými - funkce • Bílkoviny •Proč: • •Zřetelná biologická funkce • •Je jednodušší je izolovat i charakterizovat než NK, polysacharidy či lipidy • •Zákonná moc •Výkonná moc F04-04a.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: F04-04b.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: •20 •20, 21, •20, 21, 22 T04-01a.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: Cystin figure 3-06 Cystin F04-05.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: Selenocystein (UGA) SECIS (60 Nukl.) unnumbered figure pg 73b •Prokaryota – za UGA •Eukaryota – netranslační oblast mRNA Pyrrolysin (UAG) PYLIS Desulfitobacterium hafniense http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/71/Pyrrolysine.svg/560px-Pyrrolysine.svg.png Názvosloví •Triviální – vlastnost, místo + in –Glycin –Tyrosin –Asparagová kyselina – •Systématické –2-aminoethanová kyselina Esenciální AMK •Rostliny + mikroorganismy 0 •Člověk – biosyntéza -12 • esenciální - 8 Lys, Try, Phe, Met, • Thr, Ile, Leu, Val, • Arg, His? •Semiesenciální - mláďata • 2 • Aminocyclopropan-1-karboxylová kyselina Azetidine-2-karboxylová kyselina •Amfoterní charakter - zwitterionty figure 3-04b figure 3-07 •Amfoterní charakter - zwitterionty •Pufrační kapacita • Titrační křivka glycinu F04-06.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: Henderson-Hasselbachova rovnice > Optické vlastnosti Thalidomid Thalidomides Thalidomid thalidomide thalidomid2 Thalidomid Thalidomides •Teratogen •Léčivo Thalidomid Cahn-Ingold-Prelogova pravidla pro určování R/S; číslování od nejtěžšího k nejlehčímu •ectus •inister L AMK - CO-R-N F04-14.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: http://articlegems.co.uk/scinet/chemistry/ep/opticalisomers.gif •nC* •* •* Diastomery threoninu (Ile) – 2C* F04-15.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: Ninhydrinová reakce figure 3-09a Reakce AMK s dansylchloridem figure 3-09d Papírová chromatografie AMK •Martin Synge Nobelova cena za chemii 1952 Papírová chromatografie AMK •Martin Synge Nobelova cena za chemii 1952 Kolonová chromatografie Mikhail Semyonovich Tsvet Chromatographia 1906 RP HPLC AMK F07-06.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: http://static1.comsol.com/shared/images/stories/waters_corp_hplc_systems/html/figure2.jpg Figure 1 •Ve svalech •Ve všech buňkách figure 3-11a • 2 GSH → GSSG + 2 H+ + 2 e- •GSH + •OH (RO•, ROO•) → GS• + H2O (ROH, ROOH) • •2 GS• → GSSG • • GST •Zadní lalok hypofýzy figure 3-11c figure 3-11b • • • • •pankreas Proinzulín 84 AMK Inzulín – 51 AMK Genetické inženýrství •5 AMK • •15-32 AMK figure 3-11e figure 3-11f Falotoxiny •Amanitin •Faloidin File:Phalloidin.png File:Alpha-amanitin structure.png Amanita phalloides • Microcystiny microcy3 sin_rozklad Microcystiny •Konformace •Funkce F07-01.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: •Konformace figure 3-15 AMK analyzátor AMK analyzátor F07-01.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: •MS – hmotnostní spektrometrie •Sekvence AMK Proč je nutné znát primární strukturu •Pro objasnění vyšších struktur • •Pro porozumění jejich funkce • •Taxonomické evoluční studie • •Klinický význam • Taxonomické evoluční studie F07-21.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: •Cytochrom c T07-04a.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: T07-04b.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: F07-24.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: •Hemoglobin a myoglobin F07-22.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Proč je nutné znát primární strukturu •Pro objasnění vyšších struktur • •Pro porozumění jejich funkce • •Taxonomické evoluční studie • •Klinický význam • Srpkovitá anémie •HbA HbS Hemoglobin Srpkovitá anémie •HbA HbS Srpkovitá anémie •Krvinky sprkovité, špatně procházejí kapilárami • •Křehčí – snížené životnost z 7 na 3 měsíce • •Homozygot 100 % srpkovitost • Heterozygot 40% srpkovitost • •Jedinci se nedožívají dospělosti • • Srpkovitá anémie versus malárie F07-20.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Srpkovitá anémie versus malárie •40% srpkovitosti v kapilárách 2 % (nízká koncentrace O2) • •Plasmodium snižuje pH v erytrocytu o 0.4 – zvýšení přilnavosti ke stěnám cév – neprochází slezinou • •Snížení pH vyvolává zvýšení srpkovitosti na 40 % • •Normální erytrocyt – vysoká koncentrace K+ nezbytná pro prvoka • •Srpkovitý erytrocyt propouští K+ • •Prvok umírá • • •Přírodní výběr ????? •MS – hmotnostní spektrometrie Určování primární struktury AMK sekvenátorem • A.Purifikace bílkoviny – získání homogenní bílkoviny B. B.Aminokyselinové složení – určení počtu jednotlivých AMK zbytků (kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 –110 ºC, 24 h) C. C.Pořadí aminokyselin: 1.Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce(redukce nebo oxidace disulfidických můstků) 2.Určit N-konec a C-konec – počet řetězců 3.Určit pořadí aminokyselin Edmanovým odbouráváním (kam až to jde) – 60-70 AMK 4.2 nezávislá specifická štěpení → isolovat štěpy (peptidy) 5.Opakovat bod 3. 6.Sestavit primární strukturu řetězce 7.Určit způsob propojení původních řetězců Zjišťování N-koncových AMK • • •X + A-B-C = X-A + B + C Zjišťování N-koncových AMK http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/7e/Sanger_peptide_end-group_analysis.svg/360p x-Sanger_peptide_end-group_analysis.svg.png File:Frederick Sanger2.jpg •Frederick Sanger Zjišťování N-koncových AMK F07-03.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Zjišťování C-koncových AMK • • •A-B-C → A-B + C • • + X • • X-C •karboxypeptidáza Edmanovo sekvenování • •X + A-B-C.. = X-A + B-C.. • •X + B-C.. = X-B + C.. • •Pehr Victor Edman http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/74/Edman-1968.png Edmanovo sekvenování F07-04.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Možnosti štěpení figure 3-17a figure 3-17b figure 3-17c •Trypsin •Chymotrypsin •CNBr Metoda překrývajících se štěpů Stanovení na základě sekvenace NK • •Není snadné identifikovat gen kódující daný protein (introny a exony) • •Nelze takto zjistit posttranslační modifikace • •V genetickém kódu mohou být chyby • •Genetický kód není universální •Pomocí hmotnostní spektrometrie - MS • • • • • • • • •převedení molekul na ionty (může dojít k jejich fragmentaci) • •rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) • •záznam relativních intenzit jednotlivých iontů •Hmotnostní spektrometr • •Hmotnostní spektrometr je iontově-optické zařízení, které separuje ionty podle poměru jejich m/z. • > Blokové schéma MS • MS – NC 2002 (Tanaka, Fen) F07-08a.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: F07-08b.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: •ESI •MALDI > Electrospray (ESI) Tanaka Ionizace Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) Fen Analyzátor doby letu (TOF) Analyzátor doby letu (TOF) MS F07-09.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) Analyzátor doby letu (TOF) Tandemová MS-MS F07-10.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: > Kvadrupol Tandemová MS-MS • Tandemová MS-MS F07-11.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Proč syntéza peptidů •Proteinové inženýrství • •Příprava modifikovaných peptidů • •Příprava peptidových léčiv a vakcín • Pravidla syntézy •Pořadí AMK je dáno genetickým kódem • •COOH málo reaktivní, musí se aktivovat • •Je nutné blokovat další skupiny aby se zabránilo vedlejším reakcím, blokace musí být reverzibilní • •Nesmí být narušena L-konfigurace • •Co největší výtěžek (90 % u dekapeptidu = celkový 39%) • • •V ROZTOKU •X-A-Y + B-X = X-A-B-X + X-A-Y + B-X •X – chránící skupina •Y – aktivační skupina • • • •NA PEVNÉ FÁZI •A-O + Y-B-X = X-B-A-O + Y-B-X •Imobilizovaná AMK •Volná aktivovaná AMK •s blokovanou aminoskupinou •Reakce - dipeptid •Odstranění blokování •Atd. •Atd. •Tripeptid • •Bruce Merrifield •1962 •Aktivace Syntetizátor peptidů •1971 Merrifield syntetizoval RNAsu - 128 AMK z 80 % aktivní • (výtěžek 3 % na původní množství valinu) F07-01.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: •L.P. NC chemie 1954 • NC mír 1962 •Polypeptidový skelet •Trans Cis F08-01.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-02.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-04.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-06.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-07.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-08.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-07.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-08.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: α - helix F08-11.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: •H můstek mezi C=O n-té peptidické •vazby a N-H n+4 peptidické vazby • • • Optimální vzdálenost 0,28 nm •3,6 AMK na závit • •Torzní úhly •Počet AMK na závit •Výška závitu α - helix F08-12.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: β - sheet F08-16a.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-16b.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: β - sheet F08-18.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: β - turn F08-22.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: β - turn F08-23.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F07-01.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: •Polypeptidový skelet + vedlejší řetězce AMK figure 4-03 Strukturní motivy F08-46abc.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-46d.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: Strukturní motivy F08-47a.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-47b.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-48.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: Strukturní domény – NAD+ Strukturní domény IgG F07-01.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Podjednotkové složení – více polypetidických řetězců •Usnadnění proteosyntézy • •Možnost regulací – allosterie, izoenzymy • •Multienzymové komplexy – enzymové továrny Hemoglobin Hemoglobin allosterie Myoglobin Hb versus Mb Laktátdehydrogenáza http://www.wikiskripta.eu/images/thumb/b/b9/LDH_01.png/300px-LDH_01.png •Sval •Játra Corriho cyklus •M LDH •H LDH Pyruvátdehydrogenáza http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d9/Pyruvate_dehydrogenase_E1_subunit_of_E._coli_(20 00_pixels).png •3 enzymy •5 kofaktorů •2 X • • • Rtg difrakce figure 4-15 Rtg difrakce NMR podstata – 1H,13C,19F,23Na,31P • •E NMR Blokové schéma • NMR NMR spektrum NMR spektrum F08-38a.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: NMR F08-38b.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: Denaturace - renaturace figure 4-14 Skládání – folding bílkovin •Bílkoviny se za fyziologických podmínek skládají do svých nativních konformací spontánně – informace musí být v primární struktuře • • Levinthal Paradox (Cyrus Levinthal) •We assume that there are three conformations for each amino acid(ex. α-helix, β-sheet and random coil). If a protein is made up of 100 amino acid residues, a total number of conformations is : • • 3100 = 515377520732011331036461129765621272702107522001 • ≒ 5 x1047. • •If 100 psec(10-10sec) were required to convert from a conformation to another one, a random search of all conformations would require • • 5 x 1047x 10-10 sec ≒1.6 x 1030 years. • •However, folding of proteins takes place in msec to sec order. Therefore, proteins fold not via a random search but a more sophisticated search process. • Skládání – folding bílkovin •Bílkoviny se za fyziologických podmínek skládají do svých nativních konformací spontánně – informace musí být v primární struktuře • •Nativní konformace odpovídá minimu Gibsovy energie • • Landscape theory F09-11a.jpg 0005D5ECMacintosh HD B74677AA: F09-11c.jpg 0005D5ECMacintosh HD B74677AA: F09-11d.jpg 0005D5ECMacintosh HD B74677AA: •Ideální •Hledání •Přes intermediáty •Peter Wolynes http://www.biology-online.org/user_files/Image/Biophysics/BP-statistical01.JPG Skládání – folding bílkovin •Neprobíhá náhodným způsobem • •Probíhá postupně: –a. malé dočasné periodické struktury –b. supersekundární struktury –c. strukturní domény a "roztavená" glubule –d. závěrečné úpravy za účasti enzymů – figure 4-13 Skládání – folding bílkovin •Neprobíhá náhodným způsobem • •Probíhá postupně: –a. malé dočasné periodické struktury –b. supersekundární struktury –c. strukturní domény a "roztavená" glubule –d. závěrečné úpravy za účasti enzymů – •Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky? Chaperony (Heat shock proteins) •Proteiny jsou skládány do aktivní formy molekulárními chaperony a chaperoniny •Chaperony E. coli Hsp70, rozpoznává nesložené hydrofobní části peptidového řetězce •Váže se na tyto části a ochraňuje je dokud nedojde ke správnému složení •GroES-GroEL komplex – hlavní chaperonin u E. coli - GroEL 2 kruhy, každý 7 x 60 kDa podjednotek (Hsp60) •Nesložený protein se váže dovnitř komplexu a jeho skládání je řízeno energií Chaperony •ATPasa Scrapie - BSE – CJD – Kuru Priony (Proteinaeous infectious particles) http://scienceblogs.com/retrospectacle/upload/2007/02/prion.bmp http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a2/Prusiner_1.JPG •Stanley B. Prusiner •PT 1982 NC 1997 CJD http://www.pawelmazur.org/blog/wp-content/uploads/2010/06/171461.jpg PrPC - PrPSc http://biomedme.com/wp-content/uploads/2010/02/I11-08-prion.jpg •Odolný proteolýze •Dělal se pokus se spálením mozku postižených zvířat při 600 °C, popelem se infikovala asi 1/3 exponovaných zvířat •a-helix •b-sheet Alzheimer (1906 Alois Alzheimer) tvorba b-amyloidu, formace plaku File:COMPARISONSLICE HIGH.JPG Alzheimer tvorba b-amyloidu, formace plaku File:Amyloid-plaque formation-big.jpg Alzheimer tvorba b-amyloidu, formace plaku •Normální •Patologický Alzheimer zánik acetylcholinergních neuronů, hyperfosforylace Tau proteinů Izolace proteinů Literatura •Scopes : Protein Purification •Harris : Protein Purification Methods – Practical Approach •Deutcher : Guide to Protein Purification •Janson : Protein Purification •Kastner : Protein Liqiud Chromatography • • • Literatura Metody separace proteinů •Vychází z klasických metod chemické analýzy • •Uplatňují se zde i speciální metody Problémy se vzorkem •Komplexnost • •Malá množství • •Labilita • Plánování separace bílkovin Cíl izolace •Získání homogenní bílkoviny •Zachování biologické aktivity •Čistota • •Závěr : získat vzorek o patřičné • čistotě s vynaložením • patřičného úsilí Volba vstupního materiálu •Preparát z daného organismu • •Preparát s největším obsahem dané bílkoviny •Preparát s nejmenším obsahem nečistot Sledování průběhu separace Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt 100 100 1 - 100 % HIC 50 99 1.99 1.99 99 % IEX 25 75 3 1.5 75 % SDS PAGE Stanovení koncentrace bílkoviny Kjeldahlova metoda – stanovení N2 •Mineralizace vzorku – převedení organického N na NH4+ • •Stanovení NH4+ - titrace, fotometrie, ionotvě selektivní elektrody Kjeldahlova metoda – stanovení N2 > UV spektrofotometrie •280 nm – aromatické AMK • interference nukleotidů • •180 - 230 nm – peptidická vazba • •Výhody - nedestruktivní metoda • - není třeba kalibrace UV spektrofotometrie UV spektrofotometrie Vzorce pro přímé UV stanovení: c (mg/mL) = 1.55 A280 - 0.76 A260 c (mg/mL) = (A235 - A280)/2.51 c (mg/mL) = (A224 - A233)/5.01 c (mg/mL) = A205 [27 + 120 (A280/A205)] UV spektrofotometrie Edelhochova metoda při znalosti aminokyselinového složení je možné spočíst extinkční koeficient proteinu e280. Podmínkou je přítomnost tryptofanu nebo tyrosinu v molekule. e280 = nTrp.5500 + nTyr.1490 + nCys.125 (M-1.cm-1) VIS spektrofotometrie •Přídavek činidla ® barevný derivát •Destruktivní metoda •Nutná kalibrační závislost Biuretová metoda •Princip : Cu2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N • peptidické vazby • • Cu2+ • •Měření : 540 – 560 nm • 310 nm Folinova metoda •Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany (Folin Ciocalteovo reagens) na molybdenovou modř • •Měření : 725 nm Lowryho metoda •Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody • •Měření : 600 nm Lowryho metoda •biuret é • •Lowryê Metoda dle Bradfordové •Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. • •Meření : 595 nm Metoda dle Bradfordové BCA metoda •Princip : Na+ sůl k. bicinchoninové (BCA), komplexuje Cu+ tvořené reakcí peptidové vazby s Cu2+ • • • • • •Měření : 562 nm • BCA metoda Fluorescence •Princip : - vazba fluoroforu na • bílkovinu ® měření vzniklé • fluorescence (OPA) • • Měření : exc.340 nm • em.440 nm • • - zhášení fluorescence přídavkem • bílkoviny • Polarografie •Princip : Brdičkova reakce – SH skupiny bílkoviny vstupují v přítomnosti Co2+ katalytické reakce na Hg elektrodě ® proud Nejčastěji používané metody Metoda Rozsah (ng) Poznámka Biuretová 0.5 - 5 okamžitý vývoj Lowryho 0.05 - 0.5 pomalý vývoj UV - 280 nm 0.05 - 2 interference UV – 205 nm 0.01 - 0.05 interference Bradfordové 0.01 - 0.05 sorpce barviva Stanovení biologické aktivity Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atd. Vlastní separace Obecné schéma •Získání vstupního materiálu •Rozrušení buněk •Separace Vstupní materiál Mikroorganismy •Bakterie, kvasinky, plísně, řasy • •Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství • - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech • - genetické inženýrství • - termofilní organismy • Bezobratlí •Hmyz, plži, mlži • •Nevýhody - málo se používá, nesnadno se • získává Živočišné tkáně •Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci • •Jateční zvířata – orgány • •Člověk – tělní tekutiny Rostlinné tkáně •Špenát, řepa, hrách, tabák •huseníček (Arabidopsis) •Nevýhoda – problematický růst za • definovaných podmínek Rozbití a extrakce Bakterie •Záleží na lokalizaci –Extracelulární –Intracelulární •Cytoplasma •Periplazma • • • • • •cytoplasma •periplasma Balotina •Princip – jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy – nutno chladit French (X) press •Princip – zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk • • French (X) press Ultrazvuk •Princip – ultrazvuk (> 20 kHz) v roztoku vyvolává střižní síly – nutno chladit Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok) •Princip – lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H2O – bakterie popraskají • • • • • • • Další •Alumina Al2O3 – roztírání v třecí misce • •Opakované zmrazování a rozmrazování • • Kvasinky Kvasinky •Toluenová autolýza •Princip – toluen extrahuje při 35 –40 oC fosfolipidy buněčné stěny ® osmotický šok ® enzymová autolýza • •Balotina, French press, • Živočišné tkáně •Bez buněčné stěny •Velmi křehké •Tkáňové kultury Živočišné tkáně •Třecí miska s pískem • • • • •Ruční homogenizatory – Potter –Elvehjemův Živočišné tkáně •Mixery • • •Osmotická lyse - erytrocyty Rostlinné tkáně •Silná buněčná stěna - celulosa •Tkáňové kultury křehké Rostlinné tkáně •Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas, • •Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony – melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny Optimalizace extrakce •Teplota – 4 - 6 oC chlazení •pH – optimální pro danou bílkovinu – práce v pufrech •I – v prostředí o definované iontové síle •Přídavky látek – EDTA, b-merkaptoethanol, kovové ionty, inhibitory proteas Srážecí metody Srážení •Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu • •První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH4)2SO4 • •Filtrace nahrazena centrifugací • Rozpustnost bílkoviny •Vlastnostmi bílkoviny – distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny •+ •+ •+ •- •- Rozpustnost bílkoviny •Vlastnostmi roztoku – pH, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery, teplota • Titrační křivka F04-07.jpg 0005D4EAMacintosh HD B74677AA: Izoelektrická precipitace •pI • •+ •- • •+ •- • •- • •- •- •- • •+ • •+ •+ •+ Srážení neutrálními solemi •vsolování •vysolování Vsolování • •- •- •- •- •- •+ •+ •+ •+ •+ •H2O •H2O •H2O •H2O •H2O •H2O •H2O Vsolování Vysolování • • • • • • Vysolování (NH4)2SO4 •Rozpustnost se málo mění s teplotou •Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3) •Levný •Stabilizuje bílkoviny •Relativně čistý Srážecí křivka •(NH4)2SO4 • 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Srážecí křivka •(NH4)2SO4 • 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % •Aktivita bílkoviny •Koncentrace bílkoviny Srážení - dvojstupňově •I.Stupeň •II.Stupeň Srážení - dvojstupňově •I.Stupeň •II.Stupeň Přidané množství •Tabulky • •Vzorce • Přidané množství •Tabulky • •Vzorce Provedení • • •El. míchačka •Chlazení •Míchání 10-30’ •Centrifugace •pevný (NH4)2SO4 •nebo •saturovaný roztok •(NH4)2SO4 •úprava pH •NH4OH Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou •Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny • •- •- •- •- •- •+ •+ •+ •+ •+ •H2O •H2O •H2O •H2O •H2O •H2O •H2O Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou •COHN – separace plazmatických bílkovin EtOH •Nutno provádět při T < 0 oC, při větší teplotě dochází k denaturaci •Dvojstupňově •Přídavky z tabulky nebo podle vzorce • Srážení selektivní denaturací •Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. • •Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla • •Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat • Tepelná denaturace Chromatografické metody Mikhail Semyonovich Tsvet Chromatographia 1906 Podstata • •„Při chromatografii dochází •k neustálému vytváření • rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze – stacionární a •mobilní.“ Chromatografie obr22 • •DAV •DET Chromatografie •Stacionární fáze •Mobilní fáze •izokratická eluce •gradientová eluce Zařízení pro LPC Zařízení pro LPC Ionexová chromatografie •+ •elektrostatická interakce •+ •+ •Vazba •Eluce Ionexy •Katexy - - vazba kationtů •silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO3- •slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO- • •Anexy - + vazba aniontů •silné - dietylaminoetyl(DEAE) •slabé – trietylaminoetyl(TEAE) Volba podmínek – pH + typ ionexu •pI •Bílkovina •- Katex Ionex Anex + • •- • • + •OH- •H3O+ •0 •-1 +1 •pI bílkoviny je znám Volba podmínek – pH + typ ionexu •pI bílkoviny není znám •Metoda pokusů a omylů • • • • • • • •Metoda titračních křivek • Ionexová chromatografie •Nanášení vzorku – nízká iontová síla • •Eluce – gradientová •Zvyšováním iontové síly •Změnou pH •Afinitní eluce •Použití – purifikace, zakoncentrování, výměna • pufru • •pI •Bílkovina •- Katex Ionex Anex + • •- • • + •OH- •H3O+ •0 •-1 +1 Ionexová chromatografie Hydrofobní chromatografie •Stacionární fáze – - C8, -fenyl • •Mobilní fáze – vodné roztoky • 1.7 M (NH4)2SO4 • •Eluce – snižováním iontové síly • •Použití : purifikace bílkovin • Hydrofobní chromatografie • Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie • • • • •Princip - stérická exkluse • - omezená difuse •Pořadí eluce : •MrA>MrB>MrC Gelová permeační chromatografie •Totální exkluse •Totální permeace •Selektivní permeace Gelová permeační chromatografie •Pharmacia LPC •Sephadex dextran •Sepharose agarosa •Sephacryl glukosa + akryamid •Sephacel cellulosa • •Pharmacia FPLC •Superose agarosa •Superdex síťovaná agarosa a dextran Sephadex Sephadex Sepharosa Sepharosa Gelová permeační chromatografie •Nanášení vzorku – objem vzorku < 2% • objemu kolony •Eluce – izokratická • •Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie Afinitní chromatografie Afinitní interakce Afinitní chromatografie nanesení vzorku Afinitní chromatografie vznik interakce •SPECIFICITA Afinitní chromatografie vymytí balastů •STABILITA Afinitní chromatografie eluce •REVERZIBILITA Afinitní páry Afinitní interakce Předpoklady pro vznik komplexu •Sterické – použití raménka (spacer) • • • • •Optimální pH, iontová síla • • Afinitní chromatografie Předpoklady pro vznik komplexu •Vazebné • •Konformační • Ligandy • •Monospecifické •váží pouze jedinou biomakromolekulu •nutné si připravovat individuálně • •Skupinově specifické •váží biomakromolekuly s podobnými vlastnostmi •komerčně dostupné Imobilizace ligandů Skupinově specifické ligandy Provedení •Nanesení vzorku – nízká iontová síla • •Eluce – selektivní - volným ligandem • – neselektivní - změna pH, iontové • síly, polarity • •Použítí : analytické (stanovení KD), purifikace Eluce •Eluce – selektivní - volným ligandem • nebo kompetičním činidlem • Eluce •Eluce – neselektivní - změna pH, • iontové síly, • polarity Skupinově specifické ligandy „dye ligand“ •NAD+ NADP+ •Dependentní dehydrogenasy •Skupinově specifické ligandy Cibacron Blue F4G-A Elektromigrační metody Literatura Podstata • • •„Pohyb elektricky nabitých částic •v elektrickém poli“ Frederic Reuss (1807) Katoforéza • Elektroforéza (1909) Leonor Michaelis http://www.bioinfo.org.cn/book/biochemistry/chapt08/212-2.jpg http://plantphys.info/plant_physiology/images/enzmichaelis.gif Elektroforéza •Volná • •Zónová Volná elektroforéza •+ •+ •- •- • •A+B • • • • • • • •C •B+C •A+B+C •A+B+C •A •mA > mB >mC • • • Volná elektroforéza Arne Tiselius (1902 –1971) Volná elektroforéza Arne Tiselius Volná elektroforéza Arne Tiselius (1902 –1971) •Nobelova cena1948 Zónová elektroforéza •+ •+ • •A+B+C • • • •A •B •C •- •- •mA > mB >mC Upořádání • • • •Horizontální •+ •- • •+ • •- Upořádání • •Vertikální Skylab Skylab Stabilizace •Rotací • •Gradienty hustoty • •Porézními medii • •Kapilárou • Porézní media •1939 Papír •1950 Agarový gel •1955 Škrobový gel •1957 Acetát celulosy •1959 Polyacrylamidový gel •1979 Agarosový gel Polyakrylamid •Složení – kopolymer akrylamidu a • N,N,- methylenbisakrylamidu • •+ plně splňuje požadavky -Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! - •Použití : analýza bílkovin Polyakrylamid SDS PAGE •+ •1 g bílkoviny váže 1.4 g SDS Þ •uniformní náboj na jednotku MW SDS PAGE Použití SDS PAGE •Stanovení Mr •Analýza komplexních směsí •Sledování purifikace bílkovin •Stanovení podjednotkového složení • • •+ •- • • •+ •- • • •+ •- Stanovení Mr pomocí SDS PAGE •Log •Mr •Rm • • • • • • • Stanovení Mr pomocí SDS PAGE - standardy 1046053 67771 Použití SDS PAGE •Stanovení Mr •Analýza komplexních směsí •Sledování purifikace bílkovin •Stanovení podjednotkového složení • • •+ •- • • •+ •- • • •+ •- Stanovení Mr pomocí SDS redukujicí x neredukující Kapilární elektroforéza ce-animation Kapilární elektroforéza 1967 - Hjerten 3 mm kapilára Kapilární elektroforéza 1981 - Jorgenson Lukacsová 75 mm kapilára Beckman 1987 P/ACE™ MDQ DNA System Výhody CE •Aplikační diverzita –nabité i neutrální látky –nízkomolekulární i vysokomolekulární látky –chirální i achirální látky –bakterie i viry • • • Výhody CE •Aplikační diverzita •Jednoduchá instrumentace • ce-animation Výhody CE •Aplikační diverzita •Jednoduchá instrumentace • •CEC •CZE, MEKC, •CIEF, CITP •NACE, MEEKC, •CGE, ChCE Výhody CE •Aplikační diverzita •Jednoduchá instrumentace •Vysoké rozlišení a účinnost separací •Malá spotřeba vzorku •Rychlost analýzy •Malá spotřeba chemikálií a malé množství odpadů • Quo vadis Glatz & CE ? •Metabolomika v systémové biologie •mikrobiální, rostlinná a živočišná metabolomika •„Metabolome Targeting“ •(Nucleotides and coenzymes) C:\Users\Aleš\OneDrive\CEITEC\EMMAProof.png PyrLAcC4D.png Quo vadis Glatz & CE ? • • • • Metabolomika a biomarkery v asistované reprodukci amino- a karboxylové kyseliny 1997 µCE 2013 NASA - Mars Bioanalyser Agilent 2100 Bioanalyser Agilent 2100 Chipová chromatografie struktury vyleptané do křemíkové (Si) destičky výhody: rychlost analýzy, velikost, malá spotřeba vzorku (< nl !) nevýhody: práce s malými objemy (povr. napětí, elektrostatické interakce) Disk and MALDI target area doprava MF: pumpa, odstředivá síla, el. staticky Chipová chromatografie Agilent Izoelektrická fokusace • •„Elektroforéza v gradientu pH, částice jsou separováný podle svých pI“ Izoelektrická fokusace 1961 Svensson – Rilbe (1968) Tvorba gradientu •Anoda (+) H3O+ 6H2O®O2 + 4H3O+ + 4e- • •Katoda(-) OH- 4H2O®2H2 + 4OH- - 4 e- • •Ampholyty Izoelektrická fokusace •pH •+ •- •H3O+ •OH- • •A •+ •- •H3O+ •OH- • •A •pI •t0 •t1 Izoelektrická fokusace •+ •- •H3O+ •OH- •pH •tx Izoelektrická fokusace analytická •Provedení - v gelech – PAGE, agarosa • •Použití - sledování komplexních směsí • - izoenzymové složení • - stanovení pI – rozřezání a eluce • – mpH elektrody • – pI standardy • Izoelektrická fokusace analytická 1046056 Izoelektrická fokusace preparativní •Provedení - rotací – Rotofor (BioRad) • • • • • • • • •Použití – izolace bílkovin • • • • • • • • 618354 Dvojrozměrná elektroforéza 1975 O´Farrell 10% Dvojrozměrná elektroforéza • • 10% • • •pI •Mr • • • • • • • • • • • • • • •I.rozměr IEF •II.rozměr SDS-PAGE •pH •3.0 •10.0 Dvojrozměrná elektroforéza •pI •Mr CelM Studium procesů probíhajících v živých organismech •DNA •mRNA •PROTEIN •METABOLIT •Genom / •Genomika •Transkriptom / •Transkriptomika •Proteom / •Proteomika •Metabolom / •Metabolomika •„OMICKÉ“ POLE dna_rgb dna_versus_rna_reversed_large protein Atp kys_citronova pet •Systémová biologie Systémová biologie Systémová biologie Literatura Introducing Proteomics: From concepts to sample separation, mass spectrometry and data analysis Cíl proteomiky • •Cílem je nejen identifikovat všechny bílkoviny, ale zároveň pochopit jejich funkci a strukturu a vytvořit 3D mapu buňky (určit lokalizaci jednotlivých bílkovin). Proč proteomika když máme genomiku ? •nelze určit funkci proteinu na základě sekvence DNA nebo mRNA •!!!! špatná korelace hladin mRNA a skutečných hladin bílkovin !!! •nelze popsat molekulární mechanismy pomocí studia genomu •200 typu posttranslacních modifikací •existuje alternativní translace •PROTOŽE PROTEINY A NIKOLIV GENY VYTVÁREJÍ FENOTYP ! > •Aplikace proteomiky v medicíně (proteomika nemocí) •Vývoj nových léků •Biomarkery nemocí •Exprese proteinů u nemocí • •Úloha proteinů ve vzniku nemocí •Detekce proteinů vznikajících během nemoci je využita k diagnóze •Alzheimerova choroba (amyloid β) •Srdeční onemocnění (interleukin-6 a 8, sérový amyloid A, fibrinogen, troponiny) •Renální buněční karcinom (karbonanhydrasa IX) •Informace o proteinech způsobující onemocnění je využita pro vývoj nových léků •1. Známá 3D struktura proteinu-počítačová simulace-hledání léku, který inhibuje patologický protein (HIV-1 proteasa) •2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-odlišný proteom-vývoj individuálních léků • • > Proteiny hrají centrální úlohu v životě organismu. •Základní schéma analýzy užívané v proteomice •Směs proteinů •Jednotlivé proteiny •Peptidy •Hmotnostní spektra peptidů •Identifikace proteinů • • • • • •1. Separace •2D-PAGE •2. Izolace •Štěpení trypsinem •3. Hmotnostní analýza •Hmotnostní spekroskopie •5. Porovnání s databází •4. Sekvenční analýza •Fragmentace peptidů •Sekvence peptidů • •Peptide fingerprinting •De novo sequencing Dvojrozměrná elektroforéza •pI •Mr CelM Dvojrozměrná elektroforéza •pI •Mr CelM Databáze •http://www.expasy.org/ • Detekce po elektroforéze a izoelektrické fokusaci Nespecifická detekce Nespecifická detekce Nespecifická detekce 71371 •R 250 •G 250 •Ag Specifická detekce Autoradiografie g000485 Specifická detekce Detekce na základě biologické aktivity Detekce na základě biologické aktivity • > Blotting Blotting •Southern – DNA • •Nothern – RNA • •Western - bílkoviny Blotting Výhody blottingu •Dostupnost biomakromolekul •Zakoncentrování biomakromolekul •Redukce doby a množství potřebných chemikálií •Imobilizace biomakromolekul – možnost uchovávání •Možnost vícenásobné detekce •Mechanická stabilita Kapilární blotting • •ZÁVAŽÍ •BLOTOVACÍ •MEMBRÁNA •FILTRAČNÍ •PAPÍR •NÁDOBA S •PŘENOSOVÝM PUFREM •FILTRAČNÍ • PAPÍR •GEL • • • • • • •FILTRAČNÍ •PAPÍR •KATODA •DRŽÁK •FILTRAČNÍ •PAPÍR •NÁDOBA S •PŘENOSOVÝM PUFREM •DRŽÁK •HOUBA • HOUBA • • • • •+ •- •ANODA •BLOTOVACÍ •MEMBRÁNA •GEL Tankový elektroblotting Tankový elektroblotting Tankový elektroblotting Mini Protean Trans Blot Cell > „Semi dry“ blotting • •FILTRAČNÍ •PAPÍR •+ •FILTRAČNÍ •PAPÍR •BLOTOVACÍ •MEMBRÁNA •KATODA •ANODA •- •GEL „Semi dry“ blotting • • •PORÉZNÍ •PODLOŽKA •VÝVĚVA •NANÁŠECÍ •ŠABLONA •BLOTOVACÍ •MEMBRÁNA •TĚSNĚNÍ •ZÁKLADNA •JAMKY PRO NANÁŠENÍ VZORKŮ •TĚSNĚNÍ Kapkovací dot blotting „Dott“ blotting • Membrány Detekce •DNA • • •Proteiny Detekce proteinů Blotting • •Kvantitativní poměr mezi oběma složkami může být různý !! •ROZPUSTNÉ •NEROZPUSTNÉ Typ Molekulární složení Lokalizace I [a1(I)2a2(I)] kost, kůže, šlacha, ligamenta rohovka, cévy II [a1(II)]3 chrupavka, sklivec, nukleus pulposus III [a1(III)]3 kůže, cévy, retikulární vlákna v mnoha tkáních (plíce, játra, slezina, atd.) V XI a1(V)a2(V)a3(V) a1(XI)a2(XI)a3(XI) plíce, rohovka, kost, fetální membrány, doprovází kolagen I chrupavka, sklivec •Kolagen (28 druhů) •Délka molekuly je 300 nm, a-řetězec obsahuje 1000 aminokyselin. •Molekulární struktura fibrilárních kolagenů • pravotočivá trojitá šroubovice - 3 a-řetězce (levotočivá šroubovice s odstupem 18 aminokyselin na jednu otáčku) F32-072.jpg 001177E5Macintosh HD B74677AA: •hydroxylace •glykosylace •Fibroblasty •Chondroblasty •Osteoblasty •svinutí •tvorba bisulfidických můstků •syntéza peptidů •sekrece •Posttranslační modifikace •Buňky pojivových tkání F08-29.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-30a.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: •registrační •peptidy Lysyloxidáza F08-33.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: F08-32.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: Kolagen v kůži F08-31.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: Ehlers–Danlos syndrom (EDS) α - keratin F08-26.jpg 0005D5B7Macintosh HD B74677AA: α – keratin - vlas > Trvalá ondulace •Keratin hair extension Mol šatní Peří β - keratin β - keratin Hedvábí Elastin