Aplikovaná elektrochemie
pro studium biomolekul a jejich detekci
Dr. Karel Lacina
lacinak@chemi.muni.cz
Literatura
• Joseph Wang
Analytical Electrochemistry
• Internet…
Základní představy a principy
• Přitahování / odpuzování nábojů
• Rozložení potenciálů
– Chemický potenciál
– Koncentrační gradienty
• Přenos elektronů (= proud)
e-
Mred
Mox
elektroda
Základní představy a principy
• Děje na elektrodě
• Tzn. kovový povrch ve (vodných)
roztocích
• Nutné mít dvě elektrody v roztoku
– Uzavření „elektrického“ obvodu
(elektrochemického)
– Elektrony musí téct odněkud -
někam
Základní představy a principy
Přitahování / odpuzování nábojů
• Elektrostatické interakce
• Analogie s magnetismem
• Stejné póly se odpuzují
• Opačné póly se přitahují
Základní představy a principy
Přitahování / odpuzování nábojů
• Nabité látky/molekuly
• Proteiny za fyziologického
pH?
• Konduktometrie (vodivost)
https://www.chromservis.eu/media/0/05_pdf/Ca
talogues/chs-elchemie2017_w1_150dpi.pdf
Základní představy a principy
Rozložení potenciálů
• Potenciál
• Chemický potenciál
– Reakce “chce” proběhnout
• Koncentrační gradienty/potenciál
https://www.wikiskripta.eu/w/Sklen
%C4%9Bn%C3%A1_elektroda
https://www.mit.edu/~kardar/teaching/projects
/chemotaxis(AndreaSchmidt)/gradients.htm
Měření pH
Potenciometrie
Měření potenciálu
• Iontově selektivní elektrody
• Ionofor = nosič měřeného iontu
• pH, Na+, K+, vápník, chloridy,…
• V klinické laboratoři
• Potravinářství
https://is.muni.cz/el/1411/podzim2013/K
BOMII/um/ISE_bisenzory_I_2013.pdf
https://www.chromservis.eu/media/0/05_pdf/Ca
talogues/chs-elchemie2017_w1_150dpi.pdf
Základní představy a principy
Přenos elektronů
• Elektrický proud
• Náboj prošlý obvodem za čas
• Čím víc, tím víc…
• 4 e- > 2e•
Amperometrie (měření procházejícího proudu)
e-
Mred
Mox
elektroda
Elektrochemie je všude
• Analytická chemie, měření (biosenzory, spotřeba O2, alkohol
tester)
• Generování experimentálních podmínek
– Elektroforéza (vložení napětí/potenciálu)
• Aplikace pro klinické účely (mimo analytiku)
– Stimulace neuronových tkání
• Homogenní redoxní reakce! (srážecí reakce, syntéza látek)
• …
Typy elektrod
• Zásadní je rozhraní elektroda/roztok
– Vše dál je „konstantní“
• Kovové elektrody
• Mikroelektrody
• Tištěné elektrody
• Litograficky připravené elektrody
• Speciální elektrody – kombinací metod
• Zatavení Pt drátku (25 µm) do skleněné kapiláry
• Lepší poměr signál / šum
Mikroelektrody
Electrode kinetics
http://www.thomas
recording.com
Typy elektrod
• Mikroelektrody
– Litograficky definované
Různé struktury
Různé materiály
Varshney, Li,
Biosensor Bioelectronic
24 (2009) 2951
Yu, Wilson, Faraday Discuss 116 (2000) 305
Mikroelektrody nejen pro analytiku
• Experimenty s tkáňovými kulturami
– Mikroelektrodý svazek / array - MEA Chip
• Neurostimulace
Bucher, Schubert, Kern, Nisch, Microelectron Eng 57-58 (2001) 705
Yakushenko, Mayer, Buitenhuis, Offenhäusser,
Wolfrum, Lab Chip 14 (2014) 602
https://www.nature.com/articles/s41598-017-07823-3/figures/3
https://www.mayoclinicproceedings.org/article/S0025-6196(17)30325-7/pdf
Elektrochemická reakce za daného
potenciálu
• Nejčastější využití
• Vložení potenciálu mezi 2 elektrody
• Např.
– Oxidace probíhá za potenciálu 200 mV
– Mezi 2 elektrody v roztoku vložíme
napětí 200 mV
– Redoxní látka – ferro/ferrikaynid –
[Fe(CN)6]4-/3-
e-
Mred
Mox
elektroda
Cyklická voltametrie
• Analogie s optickým „absorpčním“ spektrem
– Vlnová délka = charakter látky
• Redoxní potenciál = charakter látky
• Detekce těžkých kovů
https://www.metrohm.com/en/company/
news/news-946-portable-va-analyzer/
Amperometrie
• Sledování proudu za daného potenciálu
• Redoxní reakce (např. oxidace) v přítomnosti analytu
• Glukometr (biamperometrie), průtoková analýza (flow injection analysis)
e-
Mred
Mox
elektroda
Modifikované elektrody
• Dle modifikací získáváme další informace
– Specifita interagujících partnerů
– BIOSENZORY (doc. Petr Skládal)
Elektrochemická impedanční
spektroskopie
• Dále budou představeny výzkumné
(experimentální) metody, umožňující studium
interakcí biomolekul využívající jejich přirozený
náboj ve vodném prostředí
Elektrochemická impedance
• Vložení střídavého napětí mezi 2 elektrody
• Sledování procházejícího proudu
• Za různých frekvencí
https://www.comsol.com/blogs/electrochemical-
impedance-spectroscopy-experiment-model-and-app/
Nyquistův graf
Představa
• S narůstajícím materiálem na elektrodě narůstá i
impedance
• Redoxní značka – ferro/ferrikaynid – [Fe(CN)6]4-/3•
Náboj látek v blízkosti elektrody!!!
• Vliv elektrostatických interakcí
Vliv náboje biomolekul
Vliv náboje biomolekul
Elektrochemická impedance
• Elektrochemická detekce budoucnosti
• Možnost detekce bez redoxní značky
• Možnost sledovat děje jak ve střídavé oblasti excitace
potenciálu tak i ve stejnosměrné
• V poslední části přednášky budou představeny
aplikace elektrochemie uplatňující se v klinické
biochemii, analytické biochemii a jejich dopad na
každodenní život lidí
• Point-of-care
• Glukometr (implantovatelný)
• DNA sekvenování
Point-of-care (PoC)
• Obecně
– Přenesení zdravotnických úkonů (a péče) k místu
pacienta (v čase diagnózy)
• PoC testování
– Transfer analytického úkonu na místo odběru vzorku
(místo, kde se nachází pacient)
• Léčba může být upravena, započata než pacient opustí
ordinaci
– „Polní podmínky“, u lůžka
(environmentální analýza, krevní testy)
Point of care testing (PoCT)
• Jednoduché
– Provedení měření
– Interpretace výsledků
– Manipulace s přístrojem
• Přenosné – Malé rozměry
• Robustní
• Rychlé
• Electronická/vzdálená komunikace (sběr dat)
• Zajištění spolehlivosti výsledků!
– Různě zručné, neškolené osoby
http://www.whitmiremedical.com
Point-of-care testing (PoCT)
• Detekční část (vnesení vzorku)
• Zpracování signálu (elektronika, mikropočítač)
• Vyhodnocení (algoritmus and programy)
• Výstup/odečet (display)
• Papírkové indikátory – pH, proužky na testování moči
• Složitější přístroje – malé stolní instrumenty
Analyty detekované pomocí PoCT
přístrojů
• Glukóza
• Krevní plyny (pCO2, pO2)
• Laktát
• CO-oximetrie (O2Hb, HHb, hypoxie…)
• Hemoglobin A1c
• Abbott Precision Xceed Pro Glucose Meter
• IL Gem Blood Gas analyser
• Siemens DCA 2000 Haemoglobin A1C Analyser
Glukometry
https://en.wikipedia.org/wiki/Glucose_meter
• Glukóza
– Oxidáza vs. dehydrogenáza
• Roche, Abbot
• Nyní mnoho možností
• Nevýhody
– Kalibrace, časté měření
krve
• Podobně i pro alkohol
dehydroenázu
Implantovatelný glukometr
https://ous.eversensediabetes.com/products/
• Interakce glukózy s polymerem
• Současnost - Změna fluorescence
Pro ilustraci:
Měření s nanopóry
- princip
• Sledování toku iontů (proud)
• blokace = generování signálu
• Nanopór = průměr v jednotkách nm
Nanopóry
Sensing
• Nanopóry modifikované např.
– Antigen
– DNA polymeráza
Tvorba nanopórů
• Zásadní podmínka
Gyurcsanyi,
TRAC-Trend Anal Chem
27 (2008) 627
Nanopóry
• Afinitní reakce – rovnovážné (Ab-Ag vysoká
vazná konstanta)
• Signál podobný pulzům
• Vazba – uvolnění – vazba – atd…
• Odhad afinity biomolekul
Nanopóry
sekvenování DNA
• Možná schémata detekce:
• Póry vytvořené v membráně
– Pevné (ion beam milling)
– Bilipidické vrstva (proteinový pór)
• Detekce
– Náboj jednotlivých bazí (A,G,C,T)
– Blokace průchodem báze
– Počet H+ uvolněný při DNA polzmerizaci
Real-time DNA sekvenování
Příklad
• Různá úroveň
reziduálního proudu
pro různé nukleotidy
Derrington, Butler, Collins, Manrao, Pavlenok, Niederweis, Gundlach, PNAS 107 (2015) 16060
Field-effect transistor (FET)
Unipolární tranzistor
• Polovodičové součástky
• Tranzistory řízené elektrickým polem
• Základ kategorie přístrojů Field Effect Devices
– ISFET (ion-sensitive field-effect transistors)
– EGFET (extended gate field effect transistors)
– capacitive EIS sensor (electrolyte-insulator-semiconductor)
– LAPS (light-addressable potentiometric sensors)
• Tranzistor (bipolární)
– Elektronická součástka
– Zesílení signálu
Field-effect transistor
Unipolární tranzistor
• Princip
– Electrické pole tvoří regiony s
přebytkem náboje v
polovodičových substrátech
FET senzory
Princip funkce
• Tvorba signálu (modulování
elektrického pole)
– pH
– Změna koncentrace iontů
– Změna iontového složení
při enzymatických reakcích
– Adsorpce makromolekul
– Afinitní vazba biomolekul
(Ab-Ag, DNA hybridizace)
– Změny v přítomnosti živých
organizmů (e.g.
Metabolické procesy)
http://lsi.epfl.ch
FET senzory
Princip funkce
Matsumoto, Miyahara, Nanoscale 5 (2013) 10702
Kombinace FET s nanopóry
sekvenování DNA
Matsumoto, Miyahara, Nanoscale 5 (2013) 10702
• Ion semiconductor sequencing
• ISFET
• Není třeba značených nukleotidů
• Uvolnění H+ při polymerizaci
https://en.wikipedia.org/wiki/Ion_semiconductor_sequencing