• Proteinové interakce – 10.11.
– jak spolu proteiny interagují?
– interaktom
• Proteinové komplexy – 24.11.
– protein-proteinové interakce a komplexy
– komplexom, architektura a funkce komplexů
CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů
CG031 – cvičení z modelování proteinových komplexů
(jarní semestr)
doc. Jan Paleček
jpalecek@sci.muni.cz
PROTEOMIKA
Souhrn - protein-proteinové interakce
+
polá
hydrofob
rní
ní
primární
struktura
sekundární a terciární struktura
- proteiny/domény/motivy interagují s proteinovými partnery
– domény mají určitou strukturu, která do značné míry determinuje tvar
jejího povrchu, ale …
– charakter (hydrofobicitu, polaritu, náboj) povrchu určují postraní řetězce
aminokyselin směřujících do solventu, takže …
– interakce proteinu je determinována povrchem, který musí mít tvar i
charakter komplementární s interakčním partnerem (typy interakcí: …)
- proteiny jsou troj-rozměrné - mají různé tvary a více domén => mají více
vazebných míst na povrchu => komplexy a “sítě“
coiled-coil
Protein-proteinové interakce
• stabilní/silné (velké plochy, většinou součástí komplexů)
• přechodné/slabé (součást dynamických procesů – předávání
signálů, modifikace)
• posttranslační modifikace mohou změnit vazebné vlastnosti
povrchu (fosforylace, ubiquitinace, SUMO)
• souhrn proteinových interakcí = interaktom
(modularita díky interakcím domén – různé kombinace domén
- různé „(re-)wiring“ komplexů)
interaktom
komplex
Baderetal,FEBSLett,2008
Baderetal,FEBSLett,2008
modulace interakcí – inhibice vs nové interakce (virovými proteiny, mutacemi)
Srovnání interaktomů => konzerv. interakcí (=> evoluce komplexů => evoluce organismů )
Síť neznamená komplex
(hůře popisuje stabilní
komplexy, ale lépe
popisuje vztahy)
… kvarterní struktura
Sergeant et al.: MCB, 2005
- více povrchů jednoho proteinu interaguje s více partnery
- vzájemné interakce více proteinů vytváří větší povrchy a
vzájemně se stabilizují – vzniká pevný (kvarterní) komplex
Nse4
NSE1
NSE1
NSE4
NSE4
-L,-T,-H
-L,-T
vect
WT
L264F
P209L
patients
L97A
F266A
NSE3
L264F
P209L
WT
WT
NSE3
NSE3
vanCrabbenetal,JClinInvest,2016
narušení interakce (Nse3-Nse4) vede k nestabilitě celého komplexu
Síť neznamená komplex (hůře popisuje
stabilní komplexy, ale lépe popisuje vztahy)
Interaktom x komplexom
Wang et al., Nature, 2004
transkripce
MAPK
- PPI „přiblíží“ proteiny vs difuze
- koordinované předávání
signálů, substrátů …
- ligandy, PTM … modulují PPI
… procesy
Regulace/modulace interakcí
α
γ
β
k kk
kkkk
kkk
scaf
kkk
k
G-proteiny (β, γ) disociují a následně
interagují (β) se scafold proteinem Ste5 …
Fus3 relokalizuje do jádra a aktivuje Ste12
Gavin et al., Nature, 2006; Krogan et al, Nature, 2006
Izolace komplexů z kvasinky Saccharomyces cerevisiae
2
Replikace DNA (video): DNA helikasa (modrá) “denaturuje” dvoušroubovici–
připojen je „clamp loader“ (šedá tlapka) - 2 raménka drží DNA polymerásy (fialové)
spojené s PCNA („sliding clamp“, zelená). „Leading strand“ je syntetizován
kontinuálně zatímco „lagging strand“ musí být primásou (žluto-zelená) odstartován
(RNA primer = žlutý – Okazakiho fragmenty).
Dynamika komplexů - PPI
ATP moduluje interakce
Kelch et al, BMC Biol, 2012
Kelch et al, BMC Biol, 2012
Kelch et al, Science, 2011ATP modulace - clamp loader
ATP
ADP
Aktivovaný (ATP) clamp loader interaguje s PCNA a otevírá ji pro DNA. Vazba
DNA stimuluje hydrolýzu ATP a uvolnění clamp loader (uzavřeného s DNA).
PCNA
Zheng a spol, PNAS, 2020
polδ−PCNA-DNA komplex
- polδ váže 1 protomer PCNA
- PCNA je kolmo k DNA
- DNA (2nm) „waterskates“ skrze PCNA tunel (3nm)
Zheng a spol, PNAS, 2020
- - polδ-PCNA „dojede“ k RNA primeru (zastaví)
- – Fen1 (nucleasa) se naváže na vedlejší PCNA protomer (PIP místo) a
rozštěpí RNA
- – ligasa kompetuje/nahradí pol/Fen1 a spojí konce DNA
interakce PCNA
PCNA-Fen1 -> PCNA-Lig1ZhengaShen,JMolCellBiol,2011
Gaoaspol,MolCell,2012
- metylovaný Fen1 (flap endonucleasa) se váže na
PCNA (vyštěpí RNA primer)
- demetylace a fosforylace disocuje Fen1 z PCNA
( - po ubikvitinaci je degradován)
- poté PCNA asociuje s Lig1 (ligásou), která spojí
cukrfosfátovou kostru …
Posttranslační (PTM) modifikace
modulují interkce (složení komplexu)
PCNA – regulace buněčného cyklu
p21 blokuje přístup polymerás – zastaví se
replikace a buněčný cyklus v S fázi
p21 je upregulován nádorovým supresorem p53
(v případě poškození DNA …)
Magaetal,FASEBJ,2004
p21 interaguje s
PCNA podobným
způsobem jako
polymerasy
(kompetuje)
Freudenthal et al, NSMB, 2010
pokud je DNA poškozená, polδ se
zastaví a je třeba poškození nejdříve
opravit – jednou z možností je
„zastoupení“ jinou polymerásou, která
poškozené místo „toleruje“ a překopíruje
(translesion synthesis) – přepíná se
ubiquitylací PCNA (na „zadní straně“) TLS
polymerasy (η, ι, κ) obsahují PIP a
UBM motivy pro interakce s Ubi-PCNA
Bergink & Jentsch, Nature, 2009
Sale et al, JCS, 2012
Oprava DNA: PCNA-ptm
TLS polymerasy (η, ι, κ)
obsahují UBM (správně
přečtou chybu a zařadí
správnou bázi)
Srs2 (antirekombinása)
obsahuje SIM (nedovolí
rekombinaci na
zastavených replikačních
vidličkách)
Template switch
K63 polyUb
PCNA asociuje s CAF1 (chromatin
assambly factor) a pomáhá
znovunavázání histonů (nukleosomů) a
vzniku chromatinu
Dohke et al, Genes to Cells, 2008
Ransom et al, Cell, 2010
PCNA je “swiss-army knife”
(PCNA je „core – jádro“ komplexů)
PCNA – moduly
PCNA je „jádrem“ pro mnoho „attachments“
tj. s mnoha funkčními moduly
- Loading
- Sliding
- Terminace
- Buněčný cyklus
- TLS a oprava DNA
- Chromatinizace …
Moldovan et al., Cell, 2007
Liljas a spol.
ATPasová pumpa komplex
se stálým
složením/poměrem
podjednotek („neměnný“)
Stabilní komplex – molekulární stroj
14.4-ATP_synthase – učebnice: Alberts a spol, Molekulární biologie buňky.
„ATP syntasa je jedním z divů molekulárního světa“. Je to molekulární motor –
„nanostroj“ – vyrábějící většinu ATP (energie).
PDB: 1C17:Apumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík aspartátu
Rastogi & Girvin, Nature, 1999
podjednotka a obsahuje arginin, který předává
proton/vodík aspartátu - dochází k neutralizaci
náboje – otočka.
F0 je protonový rotor (uložen v membráně) poháněný tokem vodíkových
iontů (z dýchacího řetězce) přes membránu – dva tunely v podjednotce
a (přivádí a odvádí protony)
Při otočce osa tlačí na F1 stator (3 různé konformace)
– levý panel = konformace vhodná pro vazbu ADP
- pravý panel = ATP molekula byla vytlačena
Iino et al., CO in SB, 2015
rotor je osou spojen s chemickým statorem vyrábějícím ATP (nebo poháněným
ATP ).
Hahn et al., Science, 2018
ATPsyntáza z chloroplastu (špenát) – 6FKF - cryoEM
26 podjednotek:
a – vstup H+;
b, b’ – spojka;
3α+3β – motor;
δ – uchycení
γ, ε – osa
14xc – rotor
rotor
stator
MoM … 5ARA, 5GAR
Burkinshaw et al, BBA, 2014
Type III secretion systém (T3SS - injectisome)
– bakteriální patogeny injikují (efektorové)
proteiny skrze „jehlu“ do hostitelské buňky –
ATPasová část pomáhá „protlačit“ efektorové
proteiny z patogení bakterie skrze „jehlu“ do
hostitelské buňky
Mulkidjanian et al, NRM, 2007
- ATPasové pumpy …
- sekreční systém (T3SS injectisom)
- pohon bičíků …
Více CG030
•Cytoskeletalní motory
• Myosin – svalová kontrakce, transport váčků
• Kinesin - transport váčků po mikrotubulech od jádra
• Dynein - transport váčků po mikrotubulech k jádru, pohyb bičíků
•Rotační motory:
• FoF1-ATPsyntása/ATPasa – přeměna energie ATP na elektrochemický
potenciál (mitochondrie) – nebo naopak pumpování protonů přes
membránu (vakuoly)
• rotace bakteriálních bičíků
•Motory nukleových kyselin:
• RNA polymerasa – přepisuje DNA do RNA
• DNA polymerasa – syntetizuje druhý řetězec na ssDNA
• Helikasa – odděluje řetězce DNA (transkripce, replikace …)
• Topoisomerasa - redukce supercoiling DNA
• RSC a SWI/SNF komplexy remodelují chromatin
• SMC proteins – zodpovědné za vytváření smyček na chromatinu
Molekulární motory
Více CG030
– evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací
a novou kombinací podjednotek/modulů)
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
– evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací
a novou kombinací podjednotek/modulů)
– komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější …
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
– evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací
a novou kombinací podjednotek/modulů)
– komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější …
– skládání i rozpad komplexů jsou snadněji kontrolovatelné,
reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství
relativně slabých interakcí - nízká energie)
– skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je
transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá =>
stává se toxickým až mimo původní buňku)
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
bakteriální toxin
porin v mitochondrii
– evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací
a novou kombinací podjednotek/modulů)
– komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější …
– skládání i rozpad komplexů jsou snadněji kontrolovatelné,
reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství
relativně slabých interakcí - nízká energie)
– skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je
transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá =>
stává se toxickým až mimo původní buňku)
– velký komplex (homo-oligomer) může být kódován relativně
krátkou genetickou informací (skládá se menší protein – větší
je méně stabilní a hůře se skládá)
– menší pravděpodobnost defektní makromolekuly (menší gen
=> méně mutací + dá se relativně snadno vyhnout chybám –
odstraní/degraduje se pouze jedna poškozená menší
podjednotka => méně energie než pro nápravu celé struktury)
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
Kde najít více proteinových komplexů = PDB
Interaktivní web PDB-101 - relativní velikost komplexů
voda, ATP ATP pumpa
mikrotubuly chromatin
Shrnutí
• Proteiny mohou být součástí jednoho (stabilní) nebo více
komplexů (dynamické/modulární)
• Dynamické/modulární komplexy (PCNA)
– množství podjednotky determinuje složení komplexu
– Interakce/složení podjednotek dynamických komplexů
jsou modulovány např. ATP, posttranslačními
modifikacemi
• Stabilní komplexy (ATPasová pumpa)
– podjednotky jsou často koexprimovány (koexprese je
vzájemně stabilizuje, lepší rozpustnost)
– stabilní komplexy disociují proteolyticky
– pokles hladiny jednoho proteinu má za následek
pokles hladiny ostatních podjednotek
CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů
CG031 – Cvičení z modelování proteinových komplexů
jarní semestr - doc. Jan Paleček
Kvíz – zapište komplexy či „molekulární stroje“, které jste
zahlédli během videoprojekce
Molecular machinery of life:
https://www.youtube.com/watch?v=FJ4N0iSeR8U