1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif • Luděk Bláha, PřF MU •Stanovení ekotoxicity OPVK_MU_stred_2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Cíl přednášky – co by si měl student odnést •Chápat princip testování ekotoxicity s využitím „biologických modelů“ •Znát různé typy (křivky) vztahů mezi dávkou a toxickou odpovědí •Dokázat zakreslit, využít a interpretovat jednoduchou křivku „dávka-odpověď“ •Znát základní odvozené parametry •Znát princip probitové metody •Umět vysvětlit rozdíly a principy „prahového“ a „bezprahového“ působení •Znát příčiny a příklady „nemonotonního“ působení toxických látek •Chápat vztah toxicity a doby expozice a principy kritických reziduí •Dokázat vysvětlit pojmy aditivita – antagonismus – synergismus v ekotoxikologii a uvést příklady •Umět odhadnout toxicitu směsi látek za předpokladu aditivního působení • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Cílem ekotoxikologických analýz je poznání efektů, které působí přítomnost stresorů na organismy v prostředí • - suborganismální úroveň laboratoř - - jednotlivé organismy laboratoř - - populační efekty laboratoř mikro/mezokosmy - - efekty ve společenstvech mikro/mezokosmy polní studie terénní pozorování - - ekosystémové efekty terénní pozorování •Hodnocení efektů v ekotoxikologii • •ekologická reálnost, relevance •obtížnost stanovení • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 • •laboratoř •Testování •ekotoxicity v realitě • •= Účinky na vybraných modelových organismech (systémech) •à predikce / extrapolace pro celý ekosystém 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Hlavním požadavkem ekotoxikologické studie je •průkaz KAUZALITY mezi expozicí (látkou) a efektem •(= nejčastěji průkaz „jak se toxicita mění s dávkou“ – dávka/odpověď) • •Expozice •(dávka) • • • Atmospheric Deposition • • Erosion & Runoff • Untreated discharges • • • • • • •Efekt •(Jaká expozice vyvolá efekt ?) bosmina FISH Laboratorní a polní studie Ekotoxikologické testy sample56 lab2 faCTORY1 • •WWTP • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • •Praktické metody stanovení ekotoxicity • • - laboratorní biotesty in vitro • • - laboratorní biotesty in vivo - jednodruhové • • - laboratorní mikrokosmy • • - manipulované a kontrolované mezokosmy • • - polní studie • • - reálné ekosystémy •METODY HODNOCENÍ EFEKTŮ •Roste obtížnost průkazu KAUZALITY • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Stanovení ekotoxicity REALIZACE BIOTESTU (přípravné cvičení) Úvod: Do rybníka, ve kterém kapři onemocněli plísní, se má jako léčivo přidávat malachitová zeleň MZ. Je třeba zjistit, zda účinná koncentrace MZ (1mg/L) nepoškodí po aplikaci populace zooplanktonu v rybníku. To by následně celkovou stabilitu ekosystému a také ekonomický přínos (chybějící zdroj potravy pro ryby, snížené přírůstky ryb atd). Zadání Pro zjištění potenciálních negativních účinků MZ využijete biotest s Daphnia magna (48 hod expozice). Diskutujte, jak konkrétně byste realizovali experimenty, které odpoví na tyto otázky: 1)Je koncentrace 1 mg/L bezpečná? 2)Jaká maximální koncentrace nebude u D. magna způsobovat letalitu? 3)Jaká koncentrace způsobí po 2 dnech uhynutí 50% jedinců D. magna? • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Schema testu Ps_putida •1) Příprava organismu • • • •2) Příprava vzorku § § § § § § •3) Expozice • • • •4) Vyhodnocení § 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Kroky realizace biotestu (stručně) •1) Příprava organismu §kultivační médium, standardní počty, stáří ... • •2) Příprava vzorku §ředění vzorku (mimo nádoby s organismy) – koncentrační řada ředící medium : • – voda/medium – lze přímo přidávat k organismům • – organické rozpouštědlo – přídavky jen malých koncentrací (0.5%) §negativní kontrola – ředicí medium § •3) Expozice §přídavky vzorku (kontrolního roztoku) k organismu, expozice (24, 96 h) • •4) Vyhodnocení §stanovení letality / růstu, srovnání vzorek – kontrola, odvození křivky dávka odpověď, statistické srovnání § 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Dávka/Koncentrace - Efekt/Odpověď • •Dose/Concentration Response Relationships 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 •Biologické účinky v závislosti na koncentraci látek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Toxikant působí škodlivý efekt v biologickém systému • - po vstupu do prostředí dosahuje látka určitých koncentrací v prostředí - - toxický efekt je vyvolán dávkou v těle (působení koncentrace látky v těle po definovanou dobu – viz toxikodynamika) • •Toxikologie – práce s dávkami v těle • mg/kg hmotnosti (mg/kg b.w. - body weight), mg/kg b.w./day • •Ekotoxikologie –spíše práce s koncentracemi v prostředí v prostředí měříme koncentrace ne dávky - •Vztahy Dávka - Odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Toxikant působí škodlivý efekt v biologickém systému • •Příklady efektů? • změna zdravotního stavu • pokles příjmu potravy • snížení reprodukční schopnosti • mortalita - - •Jak změříme „změnu zdravotního stavu“ ? •Vztahy Dávka - Odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Toxikant působí škodlivý efekt v biologickém systému • •Příklady efektů? • změna zdravotního stavu • pokles příjmu potravy • snížení reprodukční schopnosti • mortalita - - •V experimentu se hodnotí POZOROVATELNÝ (měřitelný) PARAMETR = ENDPOINT •charakterizuje účinek a má k účinku jasný vztah • •Př. % přežívajících jedinců po působení dávky (efekt – mortalita) • počty vajíček po působení dávky (efekt - reprodukční toxicita) • •Endpoint může být „kvalitativní“ (nemusí být kvantifikovatelný): • - př. iritace na kůži ANO/NE • - kategorizace NEJHORŠÍ / LEPŠÍ / NEJLEPŠÍ •Vztahy Dávka - Odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • •Nejčastější (klasická ekotoxikologie) •„koncentrace“ vs. „spojitý efekt“ • •- Spojitá (vyhodnocuje a využívá se nejčastěji) - Nespojitá (např. mortalita +/-, kategorie iritance kůže - p) •Závislost odpovědi (endpointu) na koncentraci (dávce) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Proč má křivka sigmoidní charakter ? • •Proč není lineární ? •Účinek •(např. % uhynutých) •Rostoucí koncentrace 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Většina dějů v přírodě má statisticky NORMÁLNÍ ROZLOŽENÍ (resp. Log-normální) • •(nejčastější jsou „průměrní“, méně časté jsou extrémy …) • •à z něj vychází u velké většiny hodnocených efektů • - sigmoidní tvar křivky •Statistické odvození „sigmoidní křivky“ dávka-odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 •Modelový experiment • •* 10 potkanů •* Postupné injekční podávání toxinu jednotlivým zvířatům •* Pomalu zvyšování koncentrace (dávky) podávané jednotlivcům •à Sledování mortality • •Výsledek: •- Někteří jedinci zemřou již při nižších dávkách (1, 2, 3) - Někteří jedinci hodně vydrží a smrt nastane až při vysokých dávkách (5-7) - Většina jedinců však s největší pravděpodobností zemře při dávce 4 •(většina je „průměrných“, tj. ani extrémně citlivých ani rezistentních) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1 •Modelový experiment • •Postupné zvyšování koncentrace (dávky) podávané jednotlivcům •: Histogram (četnost) à kumulativní četnost: sigmoidní charakter křivky • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • •1) Parametry odvozené přímo z experimentálních dat • •LOEC/L Lowest Observable Effect Concentration/L • - první nejnižší koncentrace použitá v experimentu, která vyvolala významné efekty •NOEC/L No Observable Effect Concentration/Level • - podobně: koncentrace použitá v experimentu … • •Nedostatky - subjektivní • – závisí na zvolených koncentracích • - jiný experiment à jiné výsledky (koncentrační rozmezí, ředicí faktor – rozdíly mezi koncentracemi 2x, 5x, 10x…) •Pro srovnání toxicity různých látek (vzorků) se užívají parametry odvozené z křivky dávka-odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •2) další parametry odvozené z křivky dávka – odpověď •ECx (x=1,5,10,25,50,75,90,99 apod.) • - ne vždy je v experimentu dosaženo „přesně 5% efektu“ • - parametry se počítají (z „modelované křivky“) • •STANDARD - Hodnoty odvozené pro 50% efekt - nejčastěji užívány pro srovnání toxicity (!) - odhady v oblasti 50% efektů zatíženy nejmenší chybou •viz předchozí modelový experiment „nejvíce je průměrných“ a proto je odhad průměru nejpřesnější - •Parametry • LC50 – koncentrace (C) způsobující 50% letalitu (L) • LD50 – dávka (Dose) způsobující 50% letalitu (L) • EC50 – koncentrace způsobující 50% efekt (E) • IC50 – koncentrace způsobující 50% inhibici (I) • •Pro srovnání toxicity různých látek (vzorků) se užívají parametry odvozené z křivky dávka-odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad – úkol 1 Koncentrace (mg/L) Počet přežívajících % Přeživajících 0 20 100 0,05 20 100 0,1 18 90 0,2 19 95 0,4 15 75 0,8 9 45 1,6 3 15 3,2 0 0 6,4 0 0 •Jaká je hodnota NOEC?, LOEC?, LC50?, LC90? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •MODEL SIGMOIDNÍ KŘIVKY •- Složité matematické modely pro aproximaci •- V současnosti - využití počítačové techniky à nelineární modely pro aproximace sigmoidy • •Jednodušší (historický) přístup (je ale třeba ho znát!) • àLinearizace sigmoidy pomocí probitové metody • • •Žádaný výsledek • 1) odhad LCx • 2) přesnost odhadu LCx (Interval Spolehlivosti) • [Čím vyšší variabilita okolo křivky à tím menší přesnost] • •Jak prakticky odvodit parametry ECx ? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 •Probitová metoda •Vychází z „normálního pravděpodobnostního rozložení“ • •1) Každé hodnotě % (pravděpodobnost) přiřazena konkrétní hodnota – tzv. „probit “ •(viz tabulka) •2) Probit „5“ odpovídá 50% pravděpodobnosti (50% efekt) àVztah „probit“ vs. Logaritmus koncentrace je lineární • Linearizace sigmoidy •Snadný odečet LC50: y=a.x +b •Probit = a . Log(c) + b •50% efekt: Probit = 5 • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Srovnání toxicity různých látek • •porovnání hodnot ICx - - •Příklad Látka 1 je toxičtější •- nižší ECx •- při nižších koncentracích se projevují efekty • • •Interpretace a využití křivek dávka-odpověď 1 • • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://openi.nlm.nih.gov/imgs/512/240/3220671/3220671_pone.0024139.g002.png •Srovnání toxicity různých látek • •Problém: různé směrnice (sklon) křivky Dávka-Odpověď •à Pro interpretaci je nutno uchovat (ukázat) data celé křivky - •Příklad: • •Na základě EC50 není rozdíl • • ALE • •látka 1 vykazuje efekty ve významně nižších koncentracích •(bude mít nižší LOEC/NOEC] •Využití křivky dávka - odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 •BEZPRAHOVÉ působení • -při klasickém hodnocení se předpokládá prahová koncentrace, při které •již nelze pozorovat žádný efekt (NOEC / NOEL) • •-u některých látek se uvažuje o •NEEXISTENCI prahu; •tj. efekt se projeví při jakékoliv nenulové koncentraci (bezprahová toxicita), à stochastický účinek • •Bezprahově působící látky: • Mutageny, genotoxické karcinogeny • •Koncentrace pouze zvyšuje pravděpodobnost •stochastické (náhodné) události, tedy vzniku mutace • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Ne všechny křivky jsou „jednoduše sigmoidní“ à Nové poznatky: Endokrinní disruptory à Domácí úkol: Samostudium – PDF: Nature (2012) 490:462 à Znát odpovědi na tyto otázky: Jaké mechanismy způsobují „nemonotonní“ tvar křivky? Které látky například (znát strukturu) tyto efekty vyvolávají 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Vyjádření KONCENTRACÍ při hodnocení TOXICITY • •(1) čisté látky a definované směsi látek (barvy, produkty chemické výroby ...) • KONCENTRACE hmotnostní nebo molární • – mg/L, ug/L, mmol/L (=mM), nmol/L (=nM) apod. • ! Znát přepočty koncentrací ! • •(2) vzorky z prostředí a jejich extrakty (výluhy apod.) • - KONCENTRACE původní matrice • př. Voda …. EC50 = 1% (100x ředěná voda vyvolává 50% efekt) • - KONCENTRACE EXTRAKTU (% ředění ...) • •Výsledkem hodnocení toxicity jsou tedy „KONCENTRACE“ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •TOXICITA SMĚSÍ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Vzorky v prostředí = KOMPLEXNÍ SMĚSI •- Látky ve směsích mají ve srovnání s čistými – izolovanými – látkami odlišné biologické vlastnosti (vč. toxicity) - - Látky se mohou v efektech ovlivňovat • ADITIVITA / SYNERGISMUS / ANTAGONISMUS • •- Připomínka: model „Dynamic Energy Budget“ (tři hlavní procesy v biotě a jejich ovlivnění toxickými látkami) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •(1) ADITIVITA • - nejčastější princip v realitě směsí • - základní princip kumulativní toxicity = Aditivní model • - nejčastější u látek s "nespecifickým" mechanismem toxicity (polární narkoza) • • Př. látka 1 vyvolá v koncentraci c1, efekt 25% • látka 2 vyvolá v koncentraci c2, efekt 30% • směsný roztok L1 a L2 v koncentracích c1 a c2 vyvolá efekt 55% (25 + 30) •Vzorky v prostředí – KOMPLEXNÍ SMĚSI 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • • •(2) ANTAGONISMUS • - látky ve směsi vzájemně inhibují toxický efekt • - efekt po působení směsi je menší než podle předpovědi aditivního modelu • - u látek se specifickými biologickými-toxikologickými vlastnostmi, spíše vzácný • •Příklady • Současné působení neurotoxinů s různým mechanismem (princip "protijedů") – Veratridin (otevření membránových kanálů pro Na+/K+) • - Saxitoxin (inhibice kanálů) •Vyšší tvrdost vody (Ca, Mg) snižuje toxicitu těžkých kovů (Cu, Cd apod.) • (Kompetice toxických kovů vs. Ca/Mg na žábrech o přenašeče • à vyšší tvrdost: menší příjem toxických kovů • à menší toxicita (antagonismus) •Vzorky v prostředí – KOMPLEXNÍ SMĚSI 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • •(3) SYNERGISMUS • - látky ve směsi se vzájemně potencují • - efekt po působení směsi je vyšší než podle předpovědi aditivního modelu • - často u látek se specifickými biologickými-toxikologickými vlastnostmi • •Příklad • •Toxicita pro Ryby: •současné působení detergentu (snížení povrchového napětí na membránách žaber) a polární látky (např. inhibitoru mitochondriální respirace) (samotný jed obtížně vstupuje do buňky ALE v přítomnosti detergentu à rychlý vstup, významný toxický efekt) • • •Vzorky v prostředí – KOMPLEXNÍ SMĚSI 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Vyhodnocení toxického působení látek v binárních směsích •- tzv. isobologramy - •Příklady: Aditivita Synergismus 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Praktické hodnocení toxicity směsí za předpokladu ADITIVITY 1) skupiny látek se stejným mechanismem toxicity („aditivita koncentrací“) 2) mezi skupinami („aditivita efektů“) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Příklad Jaká bude pravděpodobně toxicita vzorku vody pro řasy, pokud v něm byly nalezeny uvedené toxické látky? •Chemikálie •a koncentrace ve vodě Skupina Mechanismus toxicity •Atrazin – 0,1 ug/L trazin – vazba na PQ v PSII Simazin – 0,2 ug/L triazin – vazba na PQ v PSII •2,4-D – 3 ug/L močovina - rozpojení PSII •MCPA – 1 ug/L močovina - rozpojení PSII •Chlorfenol – 500 ug/L neutrální HC - polární narkoza • •Víte, že •… EC50 jsou přibližně následující: • triazinové herbicidy 0,5 ug/L • deriváty močoviny 6 ug/L • chlorfenol 2 mg/L •… směrnice křivky dávka-odpověď je pro všechny skupiny látek cca „1“ •(zdvojnásobení dávky vyvolá u každé skupiny přibližně dvojnásobný efekt) • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Expozice (čas) •vs. toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Vztah mezi toxicitou (koncentrací) a časem •„Kritická rezidua látky v organismu“ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Vztah mezi toxicitou (koncentrací) a časem •„Kritická rezidua látky v organismu“ http://www.glerl.noaa.gov/res/Task_rpts/Images/2004/epland06-2f8.png •S prodlužující se expozicí přirozeně roste toxicita, ALE •Toxicita neroste s časem nekonečně (resp. hodnota LC50 neklesá nekonečně) •Podle modelů CBR lze odvodit nejnižší reálnou hodnotu LC50 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Vztah mezi toxicitou (koncentrací) a časem (2) •- Nesouvislá, sekvenční expozice - •Organismy nejsou chemickým látkám vystaveny kontinuálně –Expozice jednorázová –Expozice vícenásobná, dlohodobá atd. – •Čas a působení „směsí“ –1) Expozice látce A à změna fyziologie, zvýšení/snížení citlivosti –2) Následná expozice látce B à vyšší (neočekávaná) toxicita (viz Nature (2012) 490:462) http://www.bozpinfo.cz/obrazek/bumba_probit_analyza_001.gif