… v hlavní roli červi: hlístice 0,01 mm 0,01 mm 0,5 mm dospělec oplozené vajíčko rýhování embryogeneze vylíhnutí hodiny po oplození Nobelova cena 2002 za fyziologii a lékařství za objevy genetické regulace orgánového vývoje a programované buněčné smrti … na modelu Caenorhabditis elegans Sydney Brenner (1927, JAR) Robert Horvitz (1947, USA) John Sulston (1942, UK) g – gonáda h – hypodermis i – střevo m – svaly nc – nervová trubice Anatomie C. elegans 1. malá, snadno se kultivuje (živí se E. coli) 2. jednoduché tělo: 959 tělních buněk , 1031 u 3. dobře diferencované tkáně včetně nervové soustavy 4. průhledné tělo po celý životní cyklus 5. krátká generační doba: 3,5 dne při 20oC 6. invariantní vývoj a anatomie 7. samooplození (a částečně křižitelná) 8. malý, již sekvencovaný genom ( ~108 bp = 100 Mb = 0,1 pg ) Osm dobrých důvodů, proč studovat C. elegans – model mozaikového vývoje Buněčná genealogie C-elegans tkáně jsou polyklonálního ůvodu hypodermis hltan nervové buňky (389) hltan střevo hypodermis svaly (20) svaly žlázy nervové buňky nervové buňky (47) (80) zárodečné buňky svaly (20) ➢ základní životní cyklus je diploidní ➢ 6 vazebných skupin, odpovídá to 6 chromosomům v haploidní sadě: 5 autosomů a 1 pohlavní chromosom X ➢ hermafrodit má dva chromosomy X v diploidní buňce ➢ hermafrodit tvoří ~ 300 spermií, pak tvoří oocyty ➢ meiosa u hermafrodita vytváří gamety s jednou sadou autosomů a jedním X ➢ samooplození obvykle dává vznik embryu 2 X : 2 A = hermafroditu Základní genetická characteristika C. elegans Caenorhabditis elegans : vznik a dědičnost pohlaví XX XX XO XX XO Pro genetiku jsou potřební samečci ➢ Příležitostná ztráta chromosomu X v průběhu meiosy u hermafrodita dává gamety bez X. Frekvence asi 1 na 500 meios. Když je gameta oplozena, výsledkem je diploidní živočich pouze s 1 X. ➢ Jedinec červa pouze s jedním chromosomem X v diploidní buňce se vyvíjí jako sameček. ➢ Žádný chromosom Y u C. elegans není, samečka značíme XO. ➢ V meiose u samečka segreguje jediný chromosom X a tvoří se dva druhy spermií: s jedním chromosomem X resp. žádným: ➢ Křížení samečka s hermafroditem dává v potomstvu stejné počty samečků a hermafroditů. male sperm oocyte 1X, 1A 1A 1X, 1A X0, AA XX, AA male hermaphrodite oocyty hermafrodita spermie samečka Mutageneza C. elegans + / + + / m m / m+ / m+ / + Po F1 F2 mutagen: chemický, př. EMS fyzikální, př. g - záření aplikace na Po když zárodečná linie má mnoho mitotických buněk: larva ve stádiu L4 1/4 samooplození dává vznik homozygotům v F2 Jaké typy mutantů můžeme mít ? ➢ morfologické př. Dumpy (Dpy) – krátké, tlusté tělo Long (Lon) – delší než WT ➢ chování (pohyb) př. Uncoordinated (Unc) Roller (Rol) ➢ heterochronní př. Cell Lineage Abnormal (Lin) ➢ letální př. Lethal (Let) ➢ sexuální transformace př. Masculinizing (Tra) Feminizing (Fem) Účinek genů řídících programovanou buněčnou smrt u hlístice : geny cell death ced-3 a ced-4 (produkující cytotoxiny) jsou řízeny (inhibovány) genem ced-9 - jestliže je tento gen aktivní, buňka se nepodrobí apoptóze buňka určená k zániku indukce apoptózy pohlcení fagocytózou, degradace buňky i jádra buňka „hrobník“ nukleáza larva anterior posterior Buněčný osud hlístice podél antero-posteriorní osy je určován jediným (kolineárním) shlukem Hox genů - s homologiemi ke čtyřem homeotickým genům z komplexu Antennapedia mouchy nemá článkované tělo! Časování vývojových procesů, zapínání a vypínání genů v závislosti na koncentraci a čase, prahové hodnoty HETEROCHRONNÍ GENY HETEROCHRONNÍ MUTACE model řízení časového vývoje larvy C-elegans specifická stádia larválního vývoje jsou určována hladinou proteinu lin-14 koncentrace lin-14 vysoká střední nízká časový gradient lin-14 je výsledkem transkripční represe lin-14 proteinem lin-4, začínající při časném vývoji larvy standardní typ represe lin-4 lin-14 mutace, „získání“ funkce, nebo „ztráta“ lin-4 funkce lin-14 mutace, „ztráta“ funkce Buněčná genealogie u WT a heterochronních mutantů C-elegans standardní typ „předčasný“ mutant „opožděný“ mutant lin-14 (lf) ln-14 (gf ) mutace „ztráta funkce“ mutace „získání“ funkce klíč : buněčná smrt larvální stádia (1-4) předčasná tvorba specifických linií retardace vývoje linií, opakování vývojových typů Centrální dogma molekulární biologie ( Francis Crick ) transkripce translace DNA (skladování informace) RNA (přenašeč informace) proteiny (výkonná mašinerie buňky) Tento model má přinejmenším dva nedostatky : - nebere v úvahu mnoho faktorů, které modifikují genovou aktivitu v průběhu transkripce a translace - DNA a RNA nejsou jedinými skladníky a přenašeči informace (i) RNA-dependentní RNA polymeráza ss RNA ds RNA (ii) Dicer : ribonukleáza ds RNA malé ds RNA ( ~ 22 nt ) (iii) Argonaut (RISC) - proteiny ribonukleázového komplexu : štěpení (endogenní homologní) mRNA Craig Mello, Andrew Fire (Carnegie Institution 1998) 2006: NOBELOVA CENA ZA FYSIOLOGII A LÉKAŘSTVÍ SELEKTIVNÍ UMLČOVÁNÍ GENŮ PROSTŘEDNICTVÍM RNA INTERFERENCE (1)(2) (3) Sue Guo, 1995 PhD studentka v laboratoři Kena Kemphuese, Cornell University Historie objevu RNA - interference Klonování genu embryonální polarity: par-1 - Mapování par-1 do malé oblasti genetické mapy Problém: nemožnost získání větších DNA klonů zahrnujících kandidátní gen Řešení: připravit antisense RNA z kandidátního genu a pozorovat, zda může navodit fenokopii Par-1 fenotypu RNA-mediated interference Antisense RNA par-1 “Antisense” experiment Sue Guo Sue Guo „antisense” experiment Cell 81: 1, 1995 Injikovaná molekula % embryonální letalita ZC22 (par-1) „antisense“ 52 ZC22 (par-1) „sense“ 54 H20 0 … K našemu překvapení, injekce „sense“ ZC22 RNA také indukovala par-1 mutantní fenotyp. Není jasné, co je příčinou tohoto jevu … … Podstata fenoménu je ve stádiu zkoumání a nebude zde dále diskutována … Andy Fire, Carnegie Institution of Washington Analýza Andyho Firea Nature 391: 806, 1998 … Dva rysy RNA interference je obtížné vysvětlit. (i) Každý preparát sense či antisense RNA je dostatečný k navození interference. (ii) Interferenční efekty mohou přetrvávat do další generace, i když většina endogenních RNA transkriptů je rychle degradována již v časném embryu. Tyto výsledky naznačují významný rozdíl v chování nativních RNA (př. mRNA) a molekul odpovědných za interferenci. … Populace molekul RNA používané k mikroinjekci se obvykle připravují s pomocí bakteriofágové RNA polymerázy. … Tyto polymerázy, i když jsou vysoce specifické, tvoří některé náhodné či ektopické transkripty. … Populace interferenčních RNA mohou zahrnovat některé molekuly s dvojvláknovým charakterem. Analýza Andyho Firea Experiment Andyho Firea Nature 391: 806, 1998 Injikovaná molekula % „škubajích se“ červů unc-22 „čisté antisense“ 0 unc-22 „čisté sense“ 0 unc-22 „sense + antisense“ 100 Směs „sense plus antisense“ byla o dva řády „interferenčně“ účinnější než kterákoli ze samotných jednovláknových molekul. Baktérie exprimující dsRNA GFP-exprimující červi …. ….pojídající standardní baktérie ….pojídající baktérie exprimující GFP dsRNA RNAi by ingesting dsRNA! Timmons and Fire - Nature 295: 854, 1998 PostTranskripční genové umlčování a RNA interference - spojitost ? David Marjori Baulcombe Matzke (Norwich) (Vienna) „PostTranskripční genové umlčování se vyskytuje u rostlin a hub transformovaných cizí nebo endogenní DNA a má následek v redukované akumulaci RNA molekul se sekvenční podobností k introdukované molekule nukleové kyseliny.” Hamilton and Baulcombe, Science 286: 952, 1999 selektovatelný gen (rezistence ke Km) hranice T-DNA auxinový onkogen cytokininový onkogenreportérový gen (glukuronidáza) VEGETATIVNÍ HYBRIDIZACE U ROSTLIN Ivan Vladimírovič Mičurin (1855-1935) podnož s umlčeným transgenem roub s exprimovaným transgenem exprimovaný axilární pupen roubování podnož indukuje umlčení transgenu v roubu KOMPENZACE DÁVKY GENŮ VÁZANÝCH NA CHROMOZOM X - Caenorhabditis - Drosophila - savci KOMPENZACE DÁVKY GENŮ (hermafrodit) C-elegans Vývojové dráhy vedoucí k determinaci pohlaví a X - dávkové kompenzaci u C-elegans XSE (X-signal elements) a ASE (autosomal -signal elements) regulují hladinu XOL-1, která řídí kaskádu k faktoru SDC2. - vysoká hladina HER-1 vede k samčí pohlavní dráze (potlačení samičí dráhy) - nízká hladina HER-1 umožňuje tvorbu obou pohlavních orgánů aktivace kondenzinových komplexů snižujících expresi obou X (DC-complex) Dosage Compensation Complex zprostředkovává down-regulaci obou chromozomů X a autosomálního lokusu HER-1 lokusu v somatických tkáních hermafrodita DCC komplex se vytváří v XX-červech, váže se a šíří po X-chromozomech, redukuje expresi X-genů ~ 2krát, po vazbě na autosomální HER-1 redukce 20násobná. Proč máme rádi (červy) PLOŠTĚNKY Ploštěnci (Platyhelminthes), ploštěnky (Turbellaria) - první triblastičtí, bilaterálně souměrní (planární, obvykle trikladističtí sladkovodní) živočichové s diferencovanými orgány (tj. mezi nezmarem a hlísticí) - model regenerační morfalaxe (tj. asexuální reprodukce) - model studia kmenových buněk (neoblastů) - nemají zárodečnou dráhu, ale funkční gen Vasa - hermafroditismus a štěpení, resp. sexuální a asexuální (chromosomálně-podmíněné) klony Regenerace hlavy u ploštěnky Dugesia dorotocephala amputace 1 den poté 2 dny 3 dny 4 dny 5 dnů 7 dnů extracelulární epitel matrix buňky mezenchymu odvozené z neoblastů neoblasty Dendrocoelum Schmidtea lacteum mediterranea kopulační aparát hltan hltan plaménkové fotoreceptory exkreční buňky senzorové neurony mozkové uzliny ovária žloutek příčné spoje nervové svazkyanteriorní větev gastrovaskulární systém posteriorní větve testes Vizualizace trávicí a nervové soustavy ploštěnky požití fluoreskujícího latexu nervový systém vizualizován protilátkou vůči neuropeptidu cerebrální ganglia nervové provazce příčné spojové neurony 1 mm2 krmení („growth“) hladovění („degrowth“) Regulace proporcí těla podle dostupné potravy - ALLOMETRIE Antero-posteriorní specifikace je řízena homeotickými geny Anatomie ploštěnky Obnovení tělní polarity je řízeno gradienty morfogenů Regenerace dvojitého anteriorního jedince z krátkého fragmentu („ztráta či chyba polární paměti“) Transplantace druhé hlavy vede k potlačení regenerace amputované první hlavy (cf. nezmar) – tvorba hlavového inhibitoru ? Transplantace druhé hlavy do oblasti posterior (za hltanem) vede ke tvorbě páru nových hltanů v místě spojení (úloha morfogenních gradientů?) Detekce replikace DNA s pomocí digesce BrdU - dělí se pouze neoblasty A) Phagocata sp. B) Girardia dorotocephala C) Schmidtea meditorranea 0,3 mm 100 umanteriorní blastéma posteriorní blastéma Akumulace nově se replikujících (dělících) buněk – neoblastů v oblastech regenerační blastémy 3 dny po amputaci anterioru či posterioru ploštěnky ( značení a detekce BrdU ) Ploštěnka Schmidtea mediterranea pohlavní kmen nepohlavní kmen (aberace) Whole – mount in situ hybridizace s cDNA sondami Ingesce bakteriálně exprimované dvouvláknové RNA inhibuje genovou expresi u ploštěnek Escherichia coli cDNA T7 T7 ds RNA + játra, agaróza a barvení potravy E. coli hltan ds RNA umělá potrava - mikroinjekce ds RNA či prosté krmení ds RNA produkujícími bakteriemi vede (stejně jako u Caenorhabditis elegans) k inhibici příslušných genů - inhibice persistuje po regeneraci, což umožňuje analýzu fenotypů - metoda transgenoze dosud nebyla u ploštěnek zvládnuta, ds RNA je tedy hlavním nástrojem identifikace funkce genů RNA-interference (i) RNA-dependentní RNA polymeráza ss RNA ds RNA (ii) Dicer: ribonukleáza ds RNA malé RNAi (iii) Argonaut: proteiny ribonukleázového komplexu štěpení mRNA Využití RNA interference k identifikaci genů vyžadovaných k regeneračním procesům introdukce specifické ds RNA ampu- tace ztráta schopnosti regenerace dvojitý anterior dvojitý posterior Pane, pojďte si hrát ....... Ploštěnky v učebně psychologie : habituace a instrumentální kondiciování Názorný experiment z Oklahomské univerzity Regenerace vizuálního systému ploštěnky po amputaci hlavy (den 0): pigmentové buňky (*), fotoreceptorové buňky (>), spojovací neuron (]), ... Whole-mount imunobarvení protilátkou vůči arrestinu CD-PC sportovní bazén pro hravé ploštěnky Modelování trajektorií negativní fototaxe ploštěnky start cíl směr světla normální jedinci bezhlaví jedinci Trajektorie pohybu ploštěnek po odstranění (den 0) a regeneraci hlavy světlo Pijavenky (Bdelloidea), kmen Vířníci (Rotatoria) asexuální červi („EVOLUČNÍ SKANDÁL“, Maynard Smith) Bdelloid rotifers vířníci - mikroskopičtí mnohobuněční živočichové, červi (100µm až 1mm) - velmi početní v mokrých stanovištích - anhydrobióza: klidové stádium a šíření - schopné fixovat fragmenty DNA (horizontální genový přenos) - obligátní partenogeneze (samečci nejsou) - asi 450 morphologicky rozlišitelných druhů - radiorezistence (vysoká účinnost reparací) Vířníci neznají genetickou rekombinaci, přesto se podrobují speciaci díky odlišné selekci a geografické izolaci. Dnes existuje asi 400 druhů starých přes 40 milionů let. Určitou genetickou variabilitu zajišťují kromě přirozené mutageneze i restrukturalizace genomu v průběhu anhydrobiózy (včetně fixace cizí DNA). Bdelloid rotifers vířníci