Epigenetika 14 Mechanismus dávkové kompenzace Epigenetika a onemocnění Metody Dávková kompenzace • Proces, kterým organismy vyrovnávají genovou expresi mezi jedinci různého pohlaví • Hlavní modely • octomilka – 2x vyšší exprese X chromozomu u samčího pohlaví (důsledek Y degenerace) • háďátko – snížení exprese obou X chromozomů u hermaphroditů (vyrovnání X0) • savci – X inaktivace jednoho X chromozomu u samičího pohlaví (důsledek Y degenerace)=Barrovo tělísko Historie - objev dávkové kompenzace • 1949 – Barr a Bertram identifikovali strukturu blízko jaderné laminy v jádře, která nebyla přítomna v samčím jádře („sex chromatin)“ • 1959 – Ohno popsal Barrovo tělísko jako kondenzovaný X chromozom • 1961 – „Lyon hypothesis=law“ • X inaktivace v samičím jádře jako nástroj dávkové kompenzace • Náhodný výběr X-chromozomu • Různé počty X chromozomů • XX,44 – diploid, normální karyotyp, 1 X • XY, 44 – diploid, normální karyotyp, 0 X • XXX, 44 – X trisomie, abnormální vývoj, 2 X • XXY, 44 – Klinefelterův syndrom, abnormální vývoj, 1 X • XXXX, 88 – tetraploid, abnormální vývoj, 2 X S. Ohno M. F. LyonM. Barr a E. G. Bertram Fenotypový projev dávkové kompenzace • U koček gen ginger (G) odpovědný za oranžové zbarvení (phaeomelanin), recesivní alela (g), nulová (b) – „black color“ (eumelanin) – X vázaný gen • Kocouři = oranžové zabarvení nebo hnědo-černé (pruhované velmi vzácné, časo XXY), kočky = pruhování G g g G MM MFF Neplést – gen pro zrzavé vlasy (MCR1) je na chromozomu 16! Dvě formy X inaktivace u savců • Náhodná • Během gastrulace (epiblast) • Inaktivace maternálního nebo paternálního chromozomu, dědičná do dceřiných buněk • Důvod pruhovaného zabarvení u koček • Imprintovaná X inaktivace • Paternální X chromozom • Pre-implantační perioda embrya a extra-embryonální tkáň • U vačnatců, zřejmě vývojově původnější/primitivnjěší mechanismus Imprintovaná X-inaktivace Pre-implantační doba Paternální X chromozom, stádium 2-4 buněk Imprintovaná X-inaktivace Extra-embryonální tkáň Paternální X chromozom Náhodná inaktivace E5.5 u myši v buňkách epiblastu Kafer 2020 Náhodná inaktivace Udržovaná u somatických buněk během celého života Imprintovaná X-inaktivace Pre-implantační doba Paternální X chromozom, 2- 4 buněk Imprintovaná X-inaktivace Extra-embryonální tkáň Paternální X chromozom Náhodná inaktivace E5.5 u myši v buňkách epiblastu Kafer 2020 Náhodná inaktivace Udržovaná u somatických buněk během celého života Vnitřní buňky – dva X chromozomy aktivní Izolace ES buněk Zárodečné buňky – dva X chromozomy aktivní Fáze X chromozom inaktivace u savců • Počítání, založeno na mechanismu X:A dávky • Výběr, který chromozom bude inaktivován • Iniciace, inaktivace chromozomu, Xist exprese z X inaktivačního centra (XIC) • Šíření, in cis podél inaktivovaného chromozomu • Kompletní umlčení, stabilizace X inaktivace, Xist je umlčen • Udržení inaktivace, během života a buněčného dělení, klonální populace buněk Determinace počtu X chromozomů • Úloha XIC kontrolní oblasti a Rnf12/Rlim proteinu • XIC je nezbytná pro X inaktivaci • Oblast zahrnující elementy regulující Xist RNA • Xist polyadenylovaná 17kb RNA, nemá proteinový produkt • Pouze z jednoho chromozomu (determinace Xp/m inaktivace, první známka procesu) • Xist RNA pokrývá celý chromozom • Tsix, DXPas34, Xite a Tsx přímo i nepřímo negativně reguluje Xist expresi • Ftx a Jpx poozitivně reguluje expresi + + - - - Determinace počtu X chromozomů • Ne zcela popsáno, konsensus – X-vázané faktory a autozomální faktory determinují počet X:A • Delece X-vázané oblasti (nekódující RNA) blízko Xist elementu vede k neúspěšné inaktivaci, autozomální faktory nejsou známy • Gen Rnf12 X-vázaný gen lokalizován před XIC • Rnf12/Rlim protein a jeho hladina jsou nutné pro pokračování inaktivace Úloha Rnf12/Rlim a determinace počtu X chromozomů • Počátek X inaktivace pro daný X chromozom se již nemění • Rnf12 aktivuje Xist expresi (?) • X inaktivace snižuje hladinu Rnf12=druhý chromozom již nemůže být inaktivován • Neznámý autozomální faktor nebo další faktory-Rnf12 musí být přímo zahrnuty v determinaci počtu, ale samotný Rnf12 zcela nevysvětluje celý jev 2 X aktivní 1 X aktivní Determinace počtu X chromozomů • Rnf12 aktivuje expresi Xist • Pluripotentní faktory – pluripotentní stav buňky (ES, PGC aj.) • Oct4, Sox2, Nanog… • Represe Xist (vazba do intronu) • Aktivace regulujících elementů (Tsix, vazba DXPas34 a Xite) • Represe Rnf12 (Rnf12 aktivuje Xist) „X-chromosome kissing“ - výběr • X chromozomy přicházejí do své blízkosti a párují se přes XIC a přiléhající oblasti, stabilizující expresi pouze z jednoho XIC • Výměna informace, které dávají volbu (vazebné faktory) • Kritické pro funkci – ektopické párování X:X vede k poruše exprese Xist • Výměna dalších zatím neznámých faktorů? Epigenetická dědičnost X-inaktivace a důvod zabarvení Callico koček Iniciace a šíření X-inaktivace • Iniciace zahrnuje Xist expresi a pokrytí celého chromozomu touto RNA • Xist exprese setrvává po celý život buňky • X inaktivace je závislá na Xist expresi a je reverzibilní, během buněčné determinace se stává neměnná (epigenetický krajinný model) • Pro úspěšné umlčení je Xist dostatečný pouze v několika buněčných typech (další faktory?) • Šíření X inaktivace zahrnuje odstranění RNA PolII a umlčení repetic • „sex body“ formace se objevuje před umlčením genů • Akumulace inaktivních epigenetických značek • Úloha LINE elementů v TADs (autozomy obohacené uměle o LINE-1 elementy jsou umlčeny)-similarita s Xist RNA Iniciace a šíření X-inaktivace LINE elementy Další faktory nutné pro inaktivaci Úloha genů, které nejsou inaktivovány? Neúplná X-inaktivace • Nejsou zahrnuty v „sex chromatin body“ • Geny PAR • Non-PAR mají 2x vyšší expresi • Poruchy regulace genů, které přiléhají k XIC, jsou zdrojem X-vázaných chorob • Rettův syndrom • Mutace nebo ztráta genu MeCP2 – mentální poruchy Umlčení a udržení X-inaktivace • Není zcela přesně determinováno (nejasné rozhraní) • Založení trvale umlčeného chromatinu • Ztráta aktivních chromatinových modifikací (H3K4me, H4ac) • Akumulace represivních modifikací (H3K27me3, H3K9me2) • Vazba PRC2 (H3K27me) a PRC1 (H2AK119Ub) • Funkce RepA (Repeat A) jako vazebný faktor Shrnutí X-inaktivace a hlavních událostí • Pro udržení nutná aktivita Dnmt1, vazba Smchd1 (SMC třída proteinů) Dávková kompenzace u drozofily a háďátka De-regulace obou chromozomů • Úloha SMC proteinů (kondenziny a kondenzin-like proteiny-podobnost se Schmd1?) • Meiotické a proliferující buňky – regulace transkcripce chromatin remodelujícími proteiny MES („maternal effect sterile“=PcG→H3K27me2, H3K27me3) • Epigenetické značky (jiné pro jeden X chromozom u samečků v důsledku nepárování)-role? Up-regulace samčího X chromozomu • Úloha nekódující RNA (roX1 a roX2) • Zahrnuje histon acetyltransferázy, RNA/DNA helikázy • Založení aktivní jaderné domény obohacené o transkripční jednotky ÚLOHA EPIGENETIKY V LIDSKÝCH CHOROBÁCH Hlavní epigenetické mechanismy odpovědné za chromatin-asociované vývojové poruchy • Narušení DNA methylace nebo chromatinu na imprintovaných lokusech • Ztráta chromatin-regulujících faktorů vede ke změně struktury chromatinu a změně exprese • Změna DNA a změna chromatinu jako zdroj variabilní exprese Monoalelická exprese Změna DNA a/nebo chromatinu=změna exprese MeCP2 – vazba na meCpG, represor i aktivátor Opakování maternální/paternální (UDP) alelické disomie Zoghbi et al. 2016 2x vyšší exprese pouze jedné alelyKaždá alela je exprimována pouze jednou • Bi-alelická exprese je důsledkem správného maternálního a paternálního imprintingu Prader-Willi a Angelman syndrom • Oba syndromy mohou být způsobeny delecí části lokusu, změnou chromatinu nebo kombinací genetiky a epigenetiky Zoghbi et al. 2016 Prader-Willi a Angelman syndrom Monoalelická paternální expreseMonoalelická maternální exprese Zoghbi et al. 2016 Přehled chorob související s imprintingem Přehled chorob související se změnou chromatinu in trans Přehled chorob související se změnou chromatinu in cis Syndrom fragilního X (Martin-Bell syndrom) • normální X má 6-60 tripletů CGG v 5'UTR genu FMR1 (CGG)10AGG(CGG)9AGG(CGG)9 • muži-přenašeči nesou premutaci mezi 60 and 200 kopiemi • M-B pacienti mají přes 200 kopií repetice C Zoghbi et al. 2016 Facioscapulohumeral dystrophy (FSHD) • Změna počtu repetic D4Z4 vede k zpřístupnění lokusu pro remodelující faktory, změnu na aktivní chromatin a expresi genů s myopathickým potenciálem Zoghbi et al. 2016 Úloha epigenetické regulace v nádorovém bujení • DNA methylace • Histonové modifikace • „Writers“ • „Readers“ • Histonové varianty • Histon-remodelující komplexy • RNA-interference Baylin et al. 2016 Chromatinové změny při nádorovém bujení • Změna chromatinu zahrnuje hypomethylaci a hypermethylace specifických genů, vazba histone-modifikujících enzymů navozujících in/aktivovaný stav • Změna chromatinu je vidět po barvení hematoxylinu-rakovinné buňky mají větší jádra a více granulovaná Baylin et al. 2016 Úloha DNA methylace v nádorovém bujení • Hypomethylace onkogenaktivujících genů • Hypermethylace tumorsupresujících genů • Mutageneze • C-T tranzice • Vyšší vazba meCpG pro karcinogeny • meCpG UV mutageneze Baylin et al. 2016 Úloha DNA methylace v nádorovém bujení a progrese kolorektálního karcinomu Baylin et al. 2016 Příklad povolených léčiv - chemoterapie Zoghbi et al. 2016 DNA methyltransfáraza inhibice (vazba na DNA) Inhibice HDAT • Vliv chemoterapeutik na globální úrovni, • Aktivně proliferující buňky akumulují více látek nebo lokálně dodávané Epigenetika a neurogeneze • Determinující faktory jsou regulovány mozaikou epigenetických modifikací • Methylace genu před promotorem (Dlx2) chrání gen před PcG umlčování, • Úloha TrxG přes bivalentní methylací H3K4me3K27me3, odstranění H3K27me3 aktivuje genovou oblast Lomvardas et al. 2016 Epigenetika a neurogeneze • meCpG se vyskytují na „house-keeping“ genech v neurogenních buňkách, během ranného vývoje jsou umlčeny H3K4me3K27me3 • Neurogenní geny umlčeny během determinace přes inaktivující modifikace (H3K9me) • Neuronální geny uvolněny v pozdním vývoji nebo finální determinaci (geny nutné pro finální funkci-odstranění H3K27me3 x H3K4me3 zůstává a aktivuje) • ESC nemají meCpG v promotorech, aktivní faktory během ranného vývoje, umlčeny během determinace Lomvardas et al. 2016 Úloha histonové varianty H2be při dozrávání feromon-detekujících chemoreceptorů • Olfaktorické neurony jsou smyslové buňky v nose vnímající pachy a čich (v membráně neuronů jsou čichové receptory citlivé na pachy)-umístěné v olfaktorickém epitheliu v čichové sliznici • H2be se liší 5 AA od H2b (není methylován/acetylován na K5) • Aktivace neuoronů vede ke snížení exprese H2be a prodlužuje životnost (aktivované buňky mají nízkou hladinu exprese této histonové varianty) • H2be mimo jiné aktivuje apoptózu a tedy determinuje životnost neuronů Lomvardas et al. 2016 Doporučená literatura/online kurzy Děkuji za pozornost!