Epigenetická pamět Vývojová genetika 2021 Obsah • Epigenetické reprogramování • Vývojové epigenetické změny u savců • Epigenetické změny navozené umělým zásahem • Vývojové epigenetické změny u rostlin • Chromatin-remodelující proteiny – funkce histonové informace • Paměťové proteiny a jejich funkce • Polycomb • Thritorax • Vývojové epigenetické změny u rostlin • Paramutace, RNAi • Úloha PcG proteinů Epigenetické reprogramování u savců • Ke kompletnímu odstranění epigenetických značek dochází během vývoje u savců 2x • Ranná fáze embryonálního vývoje • Vývoj zárodečných buněk = doba sensitivity k vlivům prostředí je nejsilnější v období specifikace zárodečných buněk a následně v první fázi meiόzy (druhá fáze-dozrávání oocytů a spermií, u člověka se liší-ženy 8-10 let, muži 9-12 let) Vývoj zárodečných buněk Pre-implantační doba ranného vývoje Rozdíly ranného a PGC reprogramování • Rychlá a aktivní demethylace paternálního genomu • Pasivní demethylace maternálního geomu • V pozdním vývoji je odstranění DNA methylace rozdílná během spermatogeneze a oogeneze Ranný vývoj PGC vývoj Epigenetické reprogramování u savců – repetice a imprintované lokusy Ranný vývoj PGC vývoj Ochrana DNA methylace – úloha maternálních proteinů v oocytech Liší se ve spermiích a zralých vajíčkách Epigenetické reprogramování zárodečných buněk • Methylace na ICRs oblastech reguluje expresi imprintovaných lokusů- DMRs (=„differentially methylated regions“) • Lokusy líšící se úrovní methylace mezi vzorky nebo alelami navzájem • tDMR – buněčně specifické • cDMR – rakovinné • dDMRs – vývojové • rDMR – reprogramované • AMR – alel-specifické • aDMR – věkově specifické Úloha maternálních faktorů Aktivita DNMT and TET enzymů během reprogramování TET3, DNMT 3a, 3b – de-novo methylace TET1, TET2 DNMT 3a, 3C a 3L Ranný vývoj PGC vývoj Greenberg 2019 Epigenetické reprogramování u savců shrnutí • Zárodečné buňky • Paternální a maternální genomy mají odstraněny všechny značky (reset) • Repetice jsou umlčeny • Imprintované geny mají odstraněný imprinting • Výhradně ve vajíčku • Výhradně ve spermiích • Pre-implantační perioda • Paternální a maternální genomy mají odstraněny všechny značky (reset) • Repetice zůstávají umlčeny • Imprintované geny si ponechávají imprinting dle původu (úloha maternálních proteinů) Vývoj zárodečných buněk Pre-implantační doba ranného vývoje Epigenetické změny navozené umělým zásahem • Působení prostředí • Změny prostředí v průběhu sensitivní periody • Överkalix • Holandský hladomor = „thrifty phenotype“ • Dieta, maternální péče aj. • Vědecky- nebo klinicky-navozené změny • ART, klonování, somatické reprogramování Maternální programování epigenetických stavů Maternální péče jako model „experience-dependent“ chromatinové plasticity mateřská péče o novorozence (lízání a mazlení) DOBRÁ MATEŘSKÁ PÉČE vysoká exprese genu kódujícího glukokortikoidní receptor STABILNÍ PSYCHIKA DOSPĚLÉHO POTOMSTVA (Ac = acetylace histonů) DNA-metyltransferáza ŠPATNÁ MATEŘSKÁ PÉČE nízká exprese genu GR, STRESOVÁ PSYCHIKA DOSPĚLÉHO POTOMSTVA (CH3 = metylace DNA) DNA demetylázy histon-acetyltransferázy serotonin mozkový transmitter mozkový transkripční faktor cyklický adenosin monofosfát protein kináza A Historie epigenetického reprogramování Hochedlinger 2015 Epigenetické reprogramování v somatickém buněčném jaderném přenosu (klonování) – ovečka Dolly • Fúze buňky izolované z vemene genetické matky (Fin Dorset) a matky vajíčka (Blackface) • Odstranění buňky vajíčka před fúzí, následná stimulace dělení – embryo vloženo do další matky Blackface • Věk stejný jako genetická matka, Dolly byla jediná ovce z 277 pokusů, která přežila do dospělosti • Jméno po americké zpěvačce – Dolly Parton Nízká úspěšnost klonování a epigenetické následky • Velké efekty v potomstvu – velký plod, placenta • Nedostatečné nastavení imprintovaných lokusů • Imprintované geny regulují růst, hlavně v placentě • Somatické jádro neprochází PGC reprogramováním (ICR lokusy nejsou „pře-nastaveny“, absence změny konformace chromatinu na úrovni gamet – protaminy?) • Efekt maternálních proteinů při ranném vývoji – eroze ICR methylace ? Odkaz ovečky Dolly • Další velká zvířata - prase, jelen, koně a skot • 2007 – tým, který klonoval ovečku Dolly zhodnotil, že klonování a jeho malý úspěch je nedostatečný pro člověka • 2014 – čínští vědci dokázali mít 70 – 80% úspěšnost při klonování prasat • Výzkum kmenových buněk! Klonování ohrožených druhů/druhů na pokraji vyhynutí? =kozorožec pyrenejský Úspěšnost buněčného reprogramování a hlavní faktory vedoucí k pluripotenci • c-Myc – homologie onkogenu viru Myelocytomatosis, transkripční faktor obsahující helix-loop-helix a motif zikového prstu, reguluje celou řadu pro-proliferativních genů • Oct4 – „“octamere-binding transcription factor 4“ – aktivní jako maternální faktor v oocytech a v preimplantační periodě, zabraňuje diferenciaci=udržuje pluripotenci • Klf4 – „Krupple like factor 4“ – transkripční faktor, motif zinkového prstu, regulace telomerázy, kontrola buněčného cyklu a počtu centrozomů (genetická stabilita) • Sox2 – „sex determining region Y-box 2“, obsahuje HMG doménu, transkripční faktor pro udržení pluripotence a dělení, různé úrovně mohou vést k diferenciaci • Pro úspěšné reprogramování musí být kontrolovány a kombinovány specifické transkripční faktory – snížení pluripotentní bariéry • Využití inhibičních látek pro zvýšení úspěšnosti – riziko globálního afektu a mutageneze? Epigenetické reprogramování somatických buněk „Složitost“ epigenetického reprogramování je dána úrovní buněčné diferenciace • Každá úroveň buněčné diferenciace vyžaduje • Změnu stávajících modifikací • Kontrola buněčného plánu (vnitřní plán) • Kontrola buněčného plánu ve vztahu k okolí • Získání nových modifikací • Uměle vyvolané reprogramování vyžaduje • Odstranění typově specifických modifikací • Obnovení modifikací udržujících pluripotentní stav • Obnovení stavu chromatinu • Udržení imprintovaných oblastí • Odstranění XCI (u samiček) • Specifita epigenetických a „dosud“ neznámých faktorů? Specifita modifikací cytosinu - úloha? • Neznámý kontext funkce při buněčné diferenciaci – úloha? • Oxidace 5mC na jeho deriváty v ES buňkách – možná blokace udržovacích methyláz • Oxidační deriváty 5mC mohou měnit funkci/expresi některých genů u terminálně diferenciovaných buněk (Purkyňovi buňky) Kriaucionis 2014 Epigenetické reprogramování a úspěšnost klonování • Globální transkriptomické změny mezi klony naznačují velké abnormality na epigenetické úrovni regulace (stejný genotyp – rozdílnost v úrovních exprese) • Vyšší úspěšnost dosažena přidáním látek, které narušují epigenetický stav buňky (inhibitory methyláz aj.) • Využití • iPS – „embryonic stem cell-like pluripotent cell“ odvozené ze somatické buňky • Terapie – získání kmenových buněk pacienta s určitou poruchou, regenerace orgánů? • Etika – bez podpory se nemůže vyvíjet, chybí placenta=není embryo Zdroj pluripotentních buněk • Kultivace buněk blastocysty • Jaderný přenos do oocytu • Buněčná fúze • iPS (in vitro reprogramování – retrovirový vektor – Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) • iPS reprogramování a dediferenciace není identická k in vivo oplození a materiálu Hochedlinger 2015 Možné terapeutické využití iPS • Dva příklady iPS pro léčbu SMA (spinální svalová atrofie) • Maturace SMA-iPSCs v neuronové buňky a hledání nových látek inhibující degeneraci motorických neuronů • Oprava mutací postihující geny vedoucí k SMA a transplantace opravených motorických neuronů zpět do pacienta Hochedlinger 2015 Změny v epigenetickém reprogramování v důsledku ART ICSI/IVF Kultivování in vitro Mechanické zacházení s embryem Odběr zárodečných buněk? Změny v epigenetickém reprogramování v důsledku ART • Efekt ICSI („Intracytoplasmic Sperm Injection“) nebo IVF („In Vitro Fertilisation“) – • nárůst v počtu BWS a AS syndromů (ICSI) – maternálně přenosné (1/300 000), u ART dětí nízké riziko • Možné problémy s fertilitou, závislé na věku matky • Narušení sensitivní periody • Změna efektu maternálních proteinů z důvodu odběru oocytů – možná eroze DNA methylace a imprintovaných lokusů během ranného vývoje • Transgenerační efekt? Obsah • Epigenetické reprogramování • Vývojové epigenetické změny u savců • Epigenetické změny navozené umělým zásahem • Vývojové epigenetické změny u rostlin • Chromatin-remodelující proteiny – funkce histonové informace • Paměťové proteiny a jejich funkce • Polycomb • Thritorax • Vývojové epigenetické změny u rostlin • Paramutace, RNAi • Úloha PcG proteinů „Writers, erasers and readers“ Acetyltransferázy Methyltransferázy Kinázy Ubiquitinázy Deacetylázy Demethylázy Fosfatázy Deubiquitinázy →Rozpoznání specifických histonových značek → Vazba dalších remodelujících proteinů a chromatin-modifikujících enzymů (změna funkce a architektury chromatinu-Swi, ISWI…) Klasifikace chromatin modifikujících enzymů • Kovalentně modifikující komplexy • Acetylázy/deacetylázy • Methylázy/demethylázy • Ubiquitinázy/deubiuitinázy • Kinázy/fosfatázy • aj. • ATP-dependentní chromatin modifikující komplexy Základní rozdělení enzymů v dráze posttranslačních histonových modifikací (PTMs) Ueada and Seki 2020 Funkce ATP-nekleozom remodelujících komplexů • Remodelující komplexy umožňují vyšší dostupnost transkripčním faktorům • Pohyb nukleozomu • Odstranění nukleozomu • Výměna za specifikou histonovou variantu (CENP-A, H3.3, ƛ-H2AX…) • Sestavení nukleozomu • Nukleozomová frekvence Becker 2013 Srovnání chromatin remodelujících proteinů • ATP-dependentní domény jsou typické pro všechny členy, ostatní domény rozlišují enzymy do jednotlivých pod-rodin • Každý enzym se váže s několika dalšími podjednotkami vytvářející multi-proteinové komplexy, které mění pozici nukleozomu nebo jejich strukturu ATP doména Becker 2013 Koncept buněčné paměti Kingstone 2014 Úloha segmentačních proteinů Thritorax a Polycomb při vývoji larvy drozofily • Hranice abd-A a ostatních Hox genů jsou nastaveny paměťovými proteiny trxG a PcG a „off“ „on“ expresním stavem, dělících embryo do 14 segmentů Kingstone 2014 BRM je asociován s RNA PolII BRM TRX trxG mutace blokuje derepresi Hox genů v PcG mutantech • Aktivace Hox genů v PcG mutantech • Normální vývoj • Absence Hox genů v důsledku mutace trxG Polycomb proteiny • „Polycomb group“ – multiproteinové komplexy, udržují expresi během vývoje u živočichů a rostlin udržením buněčné paměti na úrovní transkripčního umlčení • Tři zástupci, evolučně konzervované • PRC1 – Polycomb Repressive Complex 1 (H3K27me2 a H3K27me3) • PRC2 – Polycomb Repressive Complex 2 (H2AK119Ub1) • PhoRC – Pho Repressive Complex (vazba a specifikace PcG1 a PcG2) Grossniklaus 2013 Srovnání PRC2 komplexu a udržení H3K27me3 u rostlin a drozofily Význam H3K27me3 při regulaci genové aktivity Obsah • Epigenetické reprogramování • Vývojové epigenetické změny u savců • Epigenetické změny navozené umělým zásahem • Vývojové epigenetické změny u rostlin • Chromatin-remodelující proteiny – funkce histonové informace • Paměťové proteiny a jejich funkce • Polycomb • Thritorax • Vývojové epigenetické změny u rostlin • Paramutace, RNAi • Úloha PcG proteinů Úloha PRC2 komplexů při rostlinném vývoji Vývoj semen Tranzice kvetení Květní organogeneze Grossniklaus 2013 FIS-PRC2 kontroluje expresi neznámého faktoru, který kontroluje dělení centrální buňky (fiss mutace=proliferace), MEA je potřební k nizké expresi matMEA FIS-PRC2 kontroluje dělení embrya a endospermu po oplození, udržuje nízkou expresi mat genu PHE1, udržuje/podílí se na utišení patMEA alely+a obou alel FUS3 EMF-PRC2 je represor FT alely regulující kvetení a květních genů AG+STM VRN PRC2 spouští kvetení umlčením květního represoru FLC, EMF PRC2 je uvolněn z FT genu=kvetení je zahájeno EMF PRC2 reguluje expresi STM a AG genů, které řídí květní determinaci a identitu květních orgánů/vývin květních orgánů Kontrola kvetení epigenetickým reprogramováním Proteiny skupiny POLYCOMB - jsou antagonisty (represory) homeotických genů s homeoboxem či MADS doménou - specifikují místo účinku homeotických transkripčních faktorů Arabidopsis CURLY LEAF versus AGAMOUS Justin Goodrich (Edinburgh) listy wild-typu listy mutace clf : ektopická exprese květního genu AG Parentální imprinting u rostlin : maternální efekt genu MEDEA maternální wt-alela: kontrola (redukce) embryonální proliferace Ueli Grossniklaus (Zurich 1998) wt Medea mutace medea MM / mm / - Fenotyp mutace medea • embryo odvozené z vajíčka medea nadměrně roste a umírá v průběhu desikace semene • letalita embrya je nezávislá na paternálním příspěvku a dávce genu • embryo vykazuje zvýšenou buněčnou proliferaci na úkor endospermu DEMETER řídí maternální expresi genu MEDEA Steve Jacobsen (UCLA 2002) DME / DME dme / DME dme / dme abort viabilní GUS GFP exprese DME v centrální buňce samičího gametofytu (DNA glykosyláza?) Irreversibilní demetylace genu MEDEA v samičím gametofytu Arabidopsis (konvergentní evoluce se savčím imprintingem) udržovací metylace DNA umlčený gen MEDEA vegetativní fáze vývoje embryo dvojí oplození spermie vaječná buňka centrální buňka samičí gamety demetyláza založení exprese MEDEA v endospermu Imprintované geny u rostlin Gen druh exprese mechanismus funkce MEDEA Arabidopsis maternální Polycomb remodelování chromatinu PHERES1 Arabidopsis paternální Polycomb transkripční faktor FWA Arabidopsis maternální DNA-metyltransferáza transkripční faktor FIS2 Arabidopsis maternální DNA-metyltransferáza remodelování chromatinu FIE Arabidopsis maternální ? remodelování chromatinu AGL80 Arabidopsis maternální ? transkripční faktor AtFH5 Arabidopsis maternální ? regulace aktinu FIE1 kukuřice maternální DNA-metyltransferáza remodelování chromatinu FIE2 kukuřice maternální DNA-metyltransferáza remodelování chromatinu R kukuřice maternální ? syntéza pigmentu Imprinting v endospermu r1 a dzr-1 lokusů, zein a tubulin genů Imprinting genu MEDEA Baroux 2002 Děkuji za pozornost!