Epigenetika 15 Metody Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika Bisulfitové sekvenování • Působení hydrogensiřičitanu na cytosin=konverze na U (methylované C zůstávájí stejné) • Nutné porovnání proti referenční sekvenci, kterou analyzujeme • Pro detekci ostatních modifikací (hmC, caC, fC) jsou nutné specifické reakce-konvenční bisulfitové sekvenování nerozlišuje mC a hmC a caC/fC od nemethylovaného C Výstup bisulfitového sekvenování Vytváření methylomových map MSAP • Pre-selektivní PCR amplifikace • Ligace se specifickými primery • Selektivní PCR amplifikace • Amplifikace specifických produktů • PCR produkt screening • PAA nebo kapilárová elektroforéza • Výsledek • Získání DNA methylace analyzovaných vzorků MSAP+NGS technologie • Identifikace regionů s odlišnou methylací (DMRs) • Nutnost specifických softwarů • Po specifické PCR-preamplifikaci • Tvorba NGS knihovny • Sekvenování • Analýza produktů Methyl-sensitivní PCR Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika BSA, případný enzymatický treatment Příprava vzorku Fixace Permeabilizace membrány Blokace aj. Inkubace protilátky Vizualizace Pletivo/tkáň, buněčné útvary aj. PFAM, Glutaraldehyd, EtOH… Detergent Monoklonální vs. polyklonální Mikroskopie Princip imunolokalizace Přímé a nepřímé barvení Monoklonální protilátky • Ve srovnání s pAbs draší • Rozpoznají jeden epitop (váže se na specifické místo) • Tvořeno jednou protilátkou Polyklonální protilátky • Levné pro produkci • Mix různých protilátek • Váží se na různé oblasti jedné molekuly • Tolerantní na malé změny v epitopu cílené molekuly Neumann et al. 2016 Detail polycentromery u hrachu a výskyt histonových modifikací (H2AT120ph)/hi stonových variant (CENH3) Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika ATAC-seq („assay for transposase-accessible chromatin“ • Nukleozomové mapování • Vazba transkripčních faktorů • Detekce faktorů související s nemocemi • Komparativní epigenomika • Regulace buněčné specifikace gDNA je exponována vysoce aktivní transposáze → fragmentace DNA v otevřených oblastech → tagování se sekvenčními primery Illumina official website MNase-seq („micrococcal nuclease digestion“) Wikipedia commons Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika Chemická genetika • Aplikace chemických látek pro studium fenotypu nebo genové regulační dráhy • Chemická epigenetika neinterferuje s DNA (ne primárně) Kawasumi 2007 Chemické látky ovlivňující DNA Liu 2014 Chemické látky ovlivňující chromatin a DNA methylaci Liu 2014 Děkuji za pozornost!