LIPIDOMIKA 1.Co jsou lipidy, buněčné membrány, buněčná signalizace za účasti lipidů 2.Metody stanovení lipidů (chromatografické analýzy, enzymové aktivity, inhibitory, vizualizace lipidů) 3.Fyziologický/patofyziologický/toxikologický význam lipidů, interpretace dat z lipidomických analýz (účast v diferenciaci, změny lipidomu v karcinogenezi, lipidomické změny po expozici cizorodými látkami) LIPIDOMICS Genomics Lipidomics Proteomics Structural lipids, lipid storage, cell signaling -phospholipids, triglycerides, PIPs -sphingolipids (SLs) -fatty acids (FAs) - eicosanoids (PGs,..) -sterols (bile acids, cholesterol, steroid hormones) Metabolomics Lipid mediators (PIPs, AA, SLs, FAs, PGs,...): -intracellular signaling -auto/paracrine signaling LIPIDY: IZOLACE, DETEKCE, SEPARACE A KVANTITATIVNÍ ANALÝZA uFOSFOLIPIDY - chemické složení v buněčných membránách; metody stanovení fosfolipidů (TLC, HPTLC, HPLC/MS), DIACYLGLYCEROL – stanovení hladin a fosfolipázových aktivit, TRIGLYCERIDY (akumulace v lipidních dropletech) – flurometrická detekce; FOSFATIDYLINOSITOLFOSFÁTY (PIPs) - intracelulární koncentrace (HPLC) uSFINGOLIPIDY (SL) - koncentrace SL v buňkách, extracelulárním prostoru, v plasmě; enzymy metabolismu SL (genová exprese, proteiny, enzymové aktivity) – RT-PCR, Western blotting, ICC, IHC barvení, HPLC/MS, GC/MS uMASTNÉ KYSELINY - chemické složení mastných kyselin (GC/MS); exprese genů metabolismu FAs; EICOSANOIDY (prostaglandiny, leukotrieny,..) stanovení hladin, stanovení enzym. aktivit LOX, COX, CYP, PG syntáz - HPLC/MS uSTEROLY (cholesterol, žlučové kyseliny, steroidní hormony a jejich metabolity) – stanovení hladin (HPLC), komplementární stanovení genové exprese, proteinů a enzymových aktivit enzymů metabolismu sterolů..) Obr_09 Lipidové buněčné membrány “Cell membranes are not just homogenous mixtures of lipids and proteins; they are membrane domains with specific lipid and protein compositions regulating vesicular traffic, cell polarity and cell signaling pathways.“ (Bieberich, Chemistry and Physics of Lipids, 2018) Různé fáze v lipidové membráně: -“liquid ordered phase“ (Lo) = lipidové rafty, velmi dynamické, obohacené o cholesterol a sfingolipidy (SM, GSLs), které jsou asociovány s raft. proteiny; ceramid a lysosfingolipidy indukují srůstání raftů do větších domén; toto srůstání (“coalescence“) pravděpodobně indukováno enzymaticky (SM konverze na ceramid sfingomyelinázami, hydrolýza GSLs glykosidázami); -“liquid disordered phase“ (Ld); přítomnost nenasycených fosfolipidů podporuje Ld; zde přítomny, „izolovány“ neraftové proteiny. INTRACELULÁRNÍ SIGNALIZACE (černě lipidy, zeleně proteiny) SLOŽENÍ GLYCEROLFOSFOLIPIDŮ / FOSFOLIPÁZY (PLA) Obr_03 R1, R2: mastné kyseliny R3: cholin etanolamin serin inositol aj. GLYCEROLFOSFOLIPIDY a bioaktivní lipidy Obr_06 Fosfatidylinositol- specifická fosfolipáza C a fosfolipáza D (reakce fosfatidylcholin- specifické fosfolipázy C není znázorněna) Co stanovujeme: - složení fosfolipidů; - hladiny DAG, PIPs..; - produkci mastných kys. a metabolitů mastných kys. (AA, prostaglandinů, leukotrienů aj.) SFINGOFOSFOLIPIDY - další bioaktivní lipidy Obr_14 SMáza SMsyntáza PC-PLC Různé funkce ceramidu v různých typech buněk (aktivace fosfatáz, apoptotické signály, funkce v membránách) Funkce DAG: (aktivace PKC, proliferační signály aj.) Fyziologické a patofyziologické role SLs (“S1P/Cer rheostat“) Activation of protein kinases (ERK1/2, Akt): Sph-S1P-S1P receptors, proliferation, cell survival, migration, ... (Hannun, Obeid, Nature Rev 2018, 19, 175-191) Stress stimuli: Cer, dhCer, ...: apoptosis, cell cycle arrest, autophagy leading to cell death, senescence,... Fyziologické a patofyziologické role GSLs GD3 and GD2 enhance the malignant properties of cancer cells such as cell proliferation, invasion, migration, and metastasis; GM3, GM2 and GM1 often suppress malignant properties (Furukawa et al., Cancer Sci, 2019, 110, 1544-1551). STANOVENÍ FOSFOLIPIDŮ uTenkovrstvá chromatografie (TLC, HPTLC): uFosfolipidy odvozené od glycerolu – skupinová analýza; uSfingolipidy – skupinová analýza; u - izolace skupiny pro další analýzu individuál. u lipidů (zde 2. krokem je metoda LC/MS) u uLC/MS: uStanovení jednotlivých fosfolipidů u- analýza celého vzorku (lyzátu buněk, liposomů apod.); u separace jednotlivých tříd na kolonce SPE + analýza u LC/MS u- izolace HPTLC + analýza LC/MS; TLC STANOVENÍ LIPIDŮ (výběr mobilních fází) Obr_15 Příklad stanovení PC-PLC: - buňky značeny [14C] cholinem a [3H] kyselinou myristovou (inkorporace do PC) - extrakce lipidů (CHCl3:MeOH) - separace TLC -popř. spray s barvičkou (primulin) - separace TLC v 2. mobilní fázi Proč stanovujeme fosfolipidy: - složení buněčných membrán -složení fosfolipidů v liposomech (=medicínské nanonosiče léčiv) - stanovení enzymových aktivit (PI-PLC, PC-PLC, PLD) „PHOSPHOLIPIDOMICS“ (HPTLC) STANOVENÍ CERAMIDŮ A DAG METODOU HPTLC (detekce densitometricky) 13DAG Chol 12DAG MAG Cer(2) FFA HPLC (SKUPINOVÉ) STANOVENÍ FOSFOLIPIDŮ Obr_16 „PHOSPHOLIPIDOMICS“ (TLC + LC/MS) Electrospray ionization and triple quadrupole mass spectrometer (ESI-MS) molekulární ionty fragmentační spektrum STANOVENÍ SFINGOLIPIDŮ Typické spektrum SLs (stejné složení, jiné vlastnosti): STANOVENÍ SFINGOLIPIDŮ (LC/MS/MS) Alternativní stanovení SLs metodou MALDI-IMS zamražený vzorek tkáně je potažen homogenní vrstvou organického roztoku; laserový paprsek poté scanuje specifickou oblast vzorku a sbírá hmotnostní spektrum pro každou koordinátu: STANOVENÍ SFINGOLIPIDOVÉHO METABOLISMU 1)Stanovení hladin SLs v buňkách / tkáni; poté kalkulace poměru SLs (např. Cer/dhCer, Cer/S1P, GM3/GD3 aj.) 2) Proby pro studium SL metabolismu (Snider et al., Anal. Biochem, 2019): C13, deuterované nebo fluoresc. značené substráty 3)Využití specifických chem. inhibitorů enzymových aktivit nebo silencing genů těchto enzymů VIZUALIZACE SFINGOLIPIDŮ - lipidní fluoresc. analoga SLs -proteiny vázající se specificky na SL (lysenin-SM, Shiga toxin-Gb3, cholera toxin-GM1) - protilátky proti SLs (př. Cer Ab) -fluoresc. sondy vázající se na lipid. rafty (C-laurdan) Vizualizace ceramidu v mitochondriích Využití jevu, že annexin A1 se váže specificky na ceramid (Canals, Chem Phys Lipids, 2019) MASTNÉ KYSELINY a metody stanovení NASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY METODY STANOVENÍ: („SFA“): - máselná (4:0) - laurová (12:0) HPLC / fluorimetrická derivatizace - myristová (14:0) HPLC / radiometrická nebo - palmitová (16:0) refraktometrická detekce - stearová (16:0) GC po derivatizaci (methylaci) /MS NENASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY (“MUFA“, „PUFA“): olejová (18:1) linolová (18:2, příklad n-6 kyseliny) HPLC / fluorimetrická detekce linolenová (18:3) nebo GC/MS arachidonová (20:4) eikosapentaenová (20:5) dokosahexaenová (22:6) DERIVATIZACE MASTNÝCH KYSELIN Derivatizace v HPLC se používá z následujících důvodů: • zvýšení citlivosti nebo umožnění detekce vůbec • zvýšení rozlišení nebo umožnění separace vůbec • zamezení nežádoucí sorpce látek na koloně. Způsoby derivatizace: • Předkolonová derivatizace (pre-column chromatography); chemická reakce probíhá před kolonou • Postkolonová derivatizace (post-column chromatography); chemická reakce probíhá za kolonou • Derivatizace na koloně; chemická reakce probíhá přímo v koloně Obr_18 HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci pyrenyldiazomethanem AA Obr_17 AA EIKOSANOIDY Obr_01 KYSELINA ARACHIDONOVÁ = PREKURSOR Obr_13 Obr_12 Stanovení koncentrací PGs, LTs, HETEs; stanovení aktivit COX, LOX a CYP: GC/MS nebo HPLC/MS analýza metabolitů AA COX LOX PGE2 PGD2 TXA2 LTA4, TTB4, LTC4,.. pro-/protizánětlivé aj. efekty Fyziologický/patofyziologický/toxikologický význam lipidů SIGNAL TRANSDUCTION PATHWAYS Membrane Receptors Ras, Rho, PLA2, PLC Arachidonic Acid, Reactive Oxygen Species, Ca2+, DNA Damage. Sphingolipids, PGs, LTs Protein Kinases (ERK1/2, JNK, p38, PKB/Akt, PKC, PKA, c-Src, Ras, Rho), Protein Phosphatases Transcription Factors, Modulators of Gene Expression (AhR, ERs, CAR, NF-kB, AP-1, c-Jun, c-Fos, c-Myc, p53) CELLULAR EVENTS Mitogenic signal transduction Cell cycle modulation Regulation of apoptosis Modulation of intercellular communication (SPECIFIC PROTEIN TARGETS) (e.g. ERK1/2, ERs, c-Myc) (p53, p21, pRb, CDKs, GADDs) (TNFR, Fas, p53, Bax, Bcl‑2, Casp) (Cx 43, Cx32) Cell survival, proliferation, cell death, senescence, cell differentiation, cancer promotion, progression Jaký je biologický význam změn v lipidomu? -změny vlastností plasmatických membrán nebo jejich mikrodomén (lipidových raftů); -změny v mezibuněčné komunikaci a mezibuněčné interakci (mezerové spoje – GJIC, adherentní spoje atd.); -změny aktivity membránově vázaných proteinů (povrchových receptorů - kináz apod.); -změny v intracelulární komunikaci (MAPK, PKC aj. přímo ovlivněny lipidními signálními molekulami, např. sfingolipidy) -embryogeneze, diferenciace tkáně; -role v karcinogenezi (SLs – přežívání a proliferace buněk, migrace, resistence, změny v energet. metabolismu rakovinných buněk atd.) -infekce - GSLs = povrchové receptory -regulace prozánětlivých a protizánětlivých procesů (eikosanoidy) -..... Lipidomické změny po expozici cizorodými látkami Time course of effects of 25mM PCB 153 on SL metabolism in liver WB-344 cells -PCB 153 increased significantly the concentrations of dhSph, dhSph-1-P, dhCer and dhSM during short-term exposure time; dhCer and dhSM were further increased after the 24-h exposure; - PCB 153 slightly suppressed Cer and HexCer levels during 30-min. to 3-h exposure and it induced Cer, HexCer and LacCer after 24-h exposure. Měření aktivity enzymů lipidového metabolismu a jejich genové exprese PCB 153 inhibits DES1 activity (DES1 activity determined as production of Cer 12/0 in the cells pretreated with artificial DES1 substrate dhCer C12/0) -fenretinide (chem. inhibitor of DES1) mimicked effects of PCB 153 - PCB 153 treatment suppressed the Cer C12/0 production Effects of PCB 153 on expression of major enzymes involved in Cer production -RT-PCR analysis: the Cer increase might be linked to changes in gene expression of major enzymes responsible for Cer production after 6-h exposure to PCB 153 Modulation of sphingomyelinase activity by PCB 153 (the cells were pretreated with deuterated SM 16/0 for 6 h and then exposed to PCB 153 for 24 h) -our data suggests a possible role of SMase activity in PCB-induced increase of Cer concentrations Summary of changes in SL biosynthetic and remodeling pathways in WB-F344 cells following short-term and 24-h exposure to PCB 153 - inhibition of DES1 activity; - induction of SMase and/or also CerS6 activity after 24-h exposure (red, increased concentrations; green decreased concentrations) Acute inhibition of gap junction intercellular communication (rat liver progenitor WB-F344 cells) Inhibition of GJIC by fenretinide (DEGS1 inhibitor) or external exposure to dhSph (sphinganine), Sph (sphingosine) and dhCer (dihydroceramide): external addition of dhSph, but not of dhCer, inhibited GJIC (suggesting dhSph as a possible candidate effector in WB-F344 cells). Změny lipidomu v karcinogenezi Modulations of phospholipid and sphingolipid metabolism in colon cancer epithelial cells? Many of cell biological processes are critically modulated by bioactive sphingolipids and other lipid signaling molecules, including growth regulation, cell migration, adhesion, apoptosis, senescence and inflammatory responses. (Hannun Y.A., Obeid L.M., Nature Reviews Mol. Cell Biol. 19, 175–191, 2018) Metabolic reprogramming, including dysregulation of lipid metabolism is a hallmark of cancer. (Nomura D., Cravatt B., Biochim. Biophys. Acta, 2013) Introduction: the main goals of these studies -to identify deregulation in metabolism of phospholipids, sphingolipids in subpopulation of colon cancer epithelial cells, using LC-tandem MS; - -to find a link between deregulation of lipid metabolism genes and altered ratio in tumor and adjacent nontumor cells; - -to compare lipidomics data in plasma samples of patients and „healthy“ people -to identify potential markers of colon adenocarcinoma cells Lipidomické změny v rakovinné vs. normální tkáni Levels of SLs in the EpCAM+ epithelial cells isolated from colorectal adenocarcinoma and adjacent non-tumor colon tissue Increased levels of SLs (SM and LacCer) contain both long-chain and very long-chain fatty acids (T vs. N cells) The data suggested a significant possible role of elongase ELOVL5. GSLs might be also also deregulated in CRC (see significant increase in GM3). Změny exprese genů zapojených do metabolismu lipidů Expression qRT-PCR analysis of genes involved in LacCer metabolism and in LCFA-/VLCFA-sphingolipid subspecies accumulation (T/N) A: B4GALT5 and B4GALT6 increase preferentially in EpCAM+ cells isolated from CRC B: B4GALT6 but not B4GALT5 is upregulated in total colon tissue samples C: ELOVL5 mRNA is upregulated in total colon tissue samples Deregulated expression of lipid metabolism genes in CRC (total tissues, T/N ratio, Custom PCR Array) SPHK1, S1PR2, PLPP3 SGMS1, SMPD4, SMPD1, SMPDL3B, SMPD3 SPHK1, S1PR2. NEU3, GLA, GBA2 ST3GAL2, ST6GALNAC3, ST6GALNAC6 PTGES, PTGES3, PLA2G4B, PLA2G10 Sphingolipid metabolism altered in colorectal adenocarcinoma Other glycosphingolipid-metabolizing enzymes (NEU3, GLA) Změny lipidomu v plasmě (potenciální biomarkery karcinogeneze?) Concentration of prostaglandins in colon adenocarcinoma patients vs. “healthy population“ PGE2: pro-inflammatory and cancer-promoting effects; PGD2: suppressor of cell invasion and generally was reported as anti-tumorigenic PGI2: anti-proliferative, anti-thrombotic, vasodilator,.... TXA2: platelet activation and aggregation Concentration of eicosanoids in colon adenocarcinoma patients vs. “healthy population“ PGI2 TXA2 Diagnostic ratio: Markers of oxidative damage