BAKTERIÁLNÍ TRANSPOZONY (transponovatelné mobilní elementy)  Transpozon = sekvence DNA schopná transpozice, tj. přemístění z jednoho místa v genomu do jiného místa  Transpozice = proces přemístění transpozonu  Transponáza (transpozáza) = enzym zprostředkující transpozici Základní typy bakteriálních transpozonů  IS = inzerční sekvence (IS-elementy)  Tn = transpozony (složené transpozony)  Bakteriofág MU  Konjugativní transpozony  Poprvé byly bakteriální transpozony popsány v r. 1967 u E. coli analýzou mutant s těmito vlastnostmi:  Mutace byly vysoce polární - každá se mapovala v prvním genu operonu, ale nebyly syntetizovány proteiny genů po směru transkripce. Polarita byla důsledkem přítomnosti transkripčně-terminační sekvence inzertovaného elementu.  Tyto mutace nebylo možné revertovat analogy bází nebo mutageny navozujícími posunové mutace, takže podstatou mutací nemohly být substituce, adice nebo delece bází.  Jestliže byly do kmenů s mutacemi přeneseny plazmidy, podobné polární mutace (i když v jiných genech) se na nich občas objevovaly. Např. F´lac+ se stal F´lac-.  Fyzikální studium plazmidů ukázalo, že plazmid s mutací je delší díky vloženému elementu. SPECIFICKÉ RYSY TRANSPOZICE  cílová místa nejsou homologická s místy donorovými  obvykle dochází k duplikaci přenášené sekvence, tj. transpozon zůstává i v původním donorovém místě  v místě inzerce se zdvojují ve stejném směru sekvence DNA - transpozon je na obou koncích ohraničen přímými repeticemi, což je důsledek mechanismu transpozice  po inzerci transpozonu do cílového místa dochází obvykle k inaktivaci genů, po excizi transpozonu se funkce genu obnovuje. DŮKAZ PŘÍTOMNOSTI IS-SEKVENCÍ U E. coli Vznik specificky transdukujících fágů Vznik heteroduplexů Mapování neznámých IS v gal operonu heteroduplexní analýzou Specificky transdukující fág z kmene A Specificky transdukující fág z kmene B heteroduplex ZNÁZORNĚNÍ PŘÍTOMNOSTI TRANSPOZONŮ V ELEKTRONOVÉM MIKROSKOPU - HETERODUPLEXNÍ ANALÝZA STRUKTURA IS SEKVENCÍ A SLOŽENÝCH TRANSPOZONŮ Struktura inzerční sekvence IS10 Složený transpozon Tn10 ISRISL IRi IRo Struktura složených transpozonů IS mají charakter obrácených repeticí IS mají charakter přímých repeticí Vlastnosti složených transpozonů u E. coli + metabolické geny, RM-systémy aj. Příklady genetické organizace složených transpozonů Struktura IS50 (přímé repetice) Obsah transpozonů v R plazmidu Vznik složených transpozonů tvořených dvěma IS, mezi nimiž se nachází gen nebo geny pro ANTR STRUKTURA TRANSPOZONU Tn3 38 bp obrácená opakování res Základní charakteristiky IS U GRAMNEGATIVNÍCH BAKTERIÍ ~1 kb rozdílnost IR jednotky bp transponáza součást Tn IS U GRAMNEGATIVNÍCH BAKTERIÍ HLAVNÍ TŘÍDY SLOŽENÝCH TRANSPOZONŮ U G- BAKTERIÍ Nová třída V - nemají IR - netvoří TD Konjugativní transpozony IS A TRANSPOZONY U G+ BAKTERIÍ IS U ARCHEÍ Byly vytvořeny umělé složené transpozony (např. z ISH2) použitelné pro mutagenezu u archeí Více kopií přestavby genomu, interakce replikonů Vlastnosti některých inzerčních elementů u E. coli a jejich lokalizace v genomu Transponázy – obecná charakteristika Transponázy jsou enzymy, které se vážou na konce transpozonů k IR sekvencím a katalyzují jejich přesun (transpozici) do jiných míst genomu. Obecně mají slabou aktivitu, neboť transpozice navozují mutace a nízká aktivita transponáz je nezbytná pro snížení rizika vzniku fatálních mutací. Např. u Tn5 je jedním z důvodů slabé reaktivity fakt, že jeho N- a C-konec jsou umístěny relativně blízko (v trojrozměrné struktuře) a mají tendenci se inhibovat. To bylo prokázáno mutacemi (záměnami aminokyselin) transponázy v různých místech, které vedly k hyperaktivním formám transponáz. Tyto záměny vedou ke změně konformace enzymu, v níž jsou oba konce oddáleny. Enzymové aktivity transponáz: endonukleáza, rekombináza, polynukleotidyltransferáza, resolváza, integráza Vysoce konzervovaný DDE motiv tvoří karbonylová rezidua Asp139, Asp75, Glu51 a Asp10, nezbytná pro stabilizaci Mg iontů v aktivním místě. MODEL NEREPLIKATIVNÍ TRANSPOZICE (KONZERVATIVNÍ TRANSPOZICE, „cut and paste“) Působení transponázy Vytvoření dvouřetězcových zlomů Degradace donorové molekuly VZNIK PŘÍMÝCH REPETICÍ V CÍLOVÉM MÍSTĚ PO ZAČLENĚNÍ TRANSPOZONU Průběh konzervativní transpozice („CUT and PASTE“) Dvouřetězcové zlomy na koncích transpozonu Reparační replikace, kterou jsou zaplněny mezery a vznikají tak duplikace v místě začlenění transpozonu. Donorová molekula je rozložena Spojení konců transpozonu s cílovou DNA Vytvoření posunutých zlomů v cílové molekule DNA Zlomy vytváří transponáza Mechanismus konzervativní transpozice Tn5 („cut and paste“) Molekuly transponázy se vážou na konce transpozonu, pak se tyto molekuly spojí za vzniku synapse. Vytvoří se zlomy a znovuspojení, čímž se transpozon vyčlení z donorové DNA a na jeho koncích se vytvoří vlásenky. Tyto vlásenky se pak štěpí a konce transpozonu se spojí s řetězci v cílové DNA, v nichž transponáza vytvořila posunuté zlomy (9 bp). Proběhne reparace mezer doreplikováním chybějících úseků, čímž se vytvoří duplikace (přímá opakování) v místě začlenění transpozonu. MODEL REPLIKATIVNÍ TRANSPOZICE kointegrát 1. Vytvoření jednořetězcových zlomů v donorové a cílové DNA transponázou, spojení volných konců 2. Replikace transpozonu 3. Vznik kointegrátu 4. Rozklad kointegrátu: a) homologní rekombinací v kmenech recA+ b) místně specifickou rekombinací působením resolvázy (Tn3) Replikativní transpozice Tn3 Jednořetězcové zlomy MODEL TRANSPOZICE PROSTŘEDNICTVÍM TVORBY KOINTEGRÁTU (meziprodukt replikativní transpozice Tn3) Tn10-LacZ+ Tn10-LacZDŮKAZ KONZERVATIVNÍ TRANSPOZICE Tn10 Vytváření směsi heteroduplexů a homoduplexů z transpozonů Tn10, které nesou odlišné alely genu lacZ lišící se toliko 3 bázemi. Tn10 je přítomen v transdukujících fágách lambda. Genom fága l Konzervativní transpozice Replikativní transpozice Většina případů Infikovaná buňka, v níž došlo k transpozici Donor (fág) Cílová molekula nebo Důkaz konzervativní transpozice Mutace Nam a Pam – fág není schopen se replikovat ani lyzogenizovat v kmeni sup- -- Směs homoduplexů a heteroduplexů Výsledky konzervativní a replikativní transpozice transpozonu Tn10 1. Konzervativní transpozice: Do chromozomu se začlení oba řetězce transpozonu 2. Replikativní transpozice: Do chromozomu se začleňuje jen jeden řetězec transpozonu nebo 1. 2. heteroduplex Evoluce konjugativních plazmidů obsahujících geny pro rezistenci k antibiotikům mobilizace nekonjugativních plazmidů kondukcí (RTF= resistance transfer factor) ÚLOHA TRANSPOZONŮ PŘI EVOLUCI R-PLAZMIDŮ každý transpozon může být přenášen nezávisle přesná excize – úplná ztráta transpozonu nepřesná excize – ztráta části transpozonu Důsledky přesné a nepřesné excize transpozonu Obráceně orientované IS na koncích Tn se mohou párovat DELECE POZOROVANÉ V MÍSTĚ ZAČLENĚNÍ IS1 V LOKUSU GAL E. coli Chromozomová přeskupení navozená transpozony a. Vznik delece intrachromozomovou rekombinací mezi dvěma stejně orientovanými transpozony b. Vznik inverze intrachromozomovou rekombinací mezi dvěma opačně orientovanými transpozony VZNIK DELECÍ A INVERZÍ PO TRANSPOZICI Model vytváření delecí a inverzí. Do cílové sekvence může být transpozon začleněn v orientaci I (vznik delece) nebo II (vznik inverze). INVERZNÍ TRANSPOZICE Tn Tn fúze replikonů bez Tn Inverzní transpozice: do cílového replikonu se vloží replikon nesoucí transpozon, nikoliv transpozon sám Změna typu flagelinu jako důsledek změny orientace transpozonu u Salmonella typhimurium (variace fází) Promotor p řídí expresi flagelinového genu H2 a represoru rH1 Z promotoru p je exprimován H2 a rH1, je tvořen H2, exprese H1 je potlačena Není exprimován H2 a rH1, exprese H1 probíhá působení místně specifické rekombinázy (hin-invertázy) 1kb P P P – promotor genu H1 Z promotoru p je exprimován H2 a rH1, je tvořen H2, exprese H1 je potlačena Není exprimován H2 a rH1, exprese H1 probíhá Inverze úseku obsahujícího promotor prostřednictvím Hin-invertázy Změna typu flagelinu jako důsledek změny orientace transpozonu u Salmonella typhimurium (variace fází) - II p CHARAKTERISTICKÉ RYSY TRANSPOZICE  frekvence transpozice 10-4 až 10-7/cílový replikon  specifita začlenění je pro různé elementy různá, liší se pro různé replikony (chromozom x plazmidy) – využití malých definovaných plazmidů  mutace v genu pro transponázu ovlivňuje specifitu místa začlenění  transpozice vyžaduje neporušenost koncových IR  u Tn3 aj. je známa imunita k transpozici podmíněná přítomností sekvencí IR - v blízkosti transpozonu nedochází k začlenění jeho další kopie (100 000 bp, i celý replikon) Příčiny nízké FREKVENCE TRANSPOZICE  transponáza je v buňkách přítomna ve velmi nízkých koncentracích (cca 0,15 molekuly na buňku)  aktivita transponázy se obtížně detekuje  preference působení transponázy v cis: působí přednostně na DNA, z níž byla transkribována a translatována (spřažení reakcí!)  po uvolnění transponázy z DNA dochází k jejímu rychlému rozkladu Transpoziční imunita Některé transpozony se netransponují poblíž místa, kde už nějaký transpozon je. Jev je znám jen u některých transpozonů. Imunita zabraňuje, aby se transpozon začlenil sám do sebe nebo vedle sebe. Jev je znám jen u některých transpozonů (MU, Tn7 a Tn3), ne u většiny IS. Může působit i na vzdálenost 100 000 bp. Příčina imunity není známa. U fága Mu, kde je nejvíc poznatků, přítomnost MuB vázaného na konce prvního Mu elementu, může preferenčně vázat MuA, a tento úbytek snižuje jeho potřebné množství pro začlenění do jiného sousedního místa. . REGULACE TRANSPOZICE Tn10 Na koncích IR10R se nacházejí dva promotory s opačnou orientací. Silnější promotor Pout zajišťuje transkripci pokračující do přiléhající hostitelské DNA. Slabší promotor Pin zahajuje transkripci oblasti kódující transponázu. Transkripty (RNA) OUT a In mají přesah 40 bází, kterým se mohou párovat, takže transponáza se nemůže vytvářet. mRNA antisenseRNA Hemimetylovaný stav po replikaci Frekvence transpozice je řízena několika mechanismy, které ovlivňují buď syntézu nebo funkci transponázy. Transpozici brání metylace cílových sekvencí v IR, proto k ní dochází jen krátce po replikaci. Pokud je přítomno více kopií Tn10, uplatňuje se cispreference pro výběr cílové sekvence. Syntézu transponázy inhibuje párování molekul OUT a IN RNA. Regulace transpozice Tn10 prostřednictvím antisense RNA Pin řídí transkripci transponázového genu, Pout řídí transkripci antisense RNA, která je stabilnější než mRNA Při vysokém počtu kopií Tn10 je párování antisenseRNA a mRNA častější, k transpozici nedochází Při nízkém počtu kopií Tn10 dochází k párování antisenseRNA s mRNA jen vzácně a transpozice probíhá GENOM BAKTERIOFÁGA Mu (dsDNA, 37 kb) S-konec C-konec Represor c reguluje negativně expresi genů A a B kódujících transponázu Protein A se váže ke koncům genomu Mu, což stimuluje B protein. Vazba probíhá na 22 bp sekvencích. Vzniklý komplex = transpososom. Na 3´koncích vznikají zlomy, stejně je zlomena DNA v hostitelském chromozomu. Po infekci bakteriální buňky se DNA fága MU začleňuje náhodně do chromozomu konzervativní transpozicí Pomnožování fágových genomů probíhá replikativní transpozicí, čímž dochází k inaktivaci genů hostitelské buňky, která následně umírá Reprodukční cyklus fága Mu Konjugativní transpozony Konjugativní transpozony (CTn) = integrované elementy (18-500 kbp), které se samy vyčleňují z chromozomu donora, samy se přenášejí konjugací do recipienta a tam se začleňují do chromozomu Mobilizovatelné transpozony (MTn) = menší integrované transpozony (do 15 kbp), které se vyčleňují a přenášejí za účasti konjugativních transpozonů Současná terminologie Ctn : Conjugative transposon MTn: Mobilizovatelné transpozony, dříve Nbu (non-replicating Bacteroides units) ICE – integrative and conjugal elements –integrující se elementy SXT – site-specific integrating elements CTn – nesou geny kódující: 1. integrázu a excisionázu (protein pro excizi), 2. proteiny vytvářející přenosový aparát, jímž se pohybuje DNA z buňky do buňky 3. mobilizační proteiny, které vytvářejí jednořetězcové zlomy v oriT (geny tra jsou podobné genům plazmidu RP4 nebo F) 4. další produkty, zodpovídající za jiné znaky (např. rezistence k antibiotikům) PRŮBĚH PŘENOSU KONJUGATIVNÍCH TRANSPOZONŮ Transpozon začleněný do chromozomu se vyčlení a vytvoří kružnicový intermediát. Do recipientní buňky se přenáší kopie jednoho z řetězců prostřednictvím multiproteinového párovacího aparátu spojujícího obě buňky. Přenesená jednořetězcová kopie se změní na dvouřetězcovou formu, která se začlení do chromozomu recipientní buňky Mechanismus přenosu konjugativního plazmidu Tn916 Transpozon je vyčleněn z chromozomu pomocí enzymů Int a Xis a je cirkularizován. Cirkularizace umožní expresi genů tra z promotoru P Z místa oriT je zahájen přenos DNA ve formě jednořetězce. V recipientu se přenesená DNA cirkularizuje, doplní se druhý řetězec a transpozon se integruje do chromozomu. transpozony typu Tn916 mají široké rozmezí hostitelů – gen tetR je rozšířen u mnoha bakterií - Transpozon se exciduje z DNA v donorové buňce. Podobně jako fág lambda, Tn916 potřebuje dva proteiny: Int a Xis. - Excize vyžaduje dva zlomy poblíž začleněného transpozonu - Nejdříve integráza vytvoří posunuté zlomy poblíž konců transpozonu – sekvence jsou náhodné a liší se podle místa začlenění transpozonu v donorové DNA – a nejsou tudíž komplementární - Tyto sekvence se přesto párují za tvorby kružnicového transpozonového intermediátu – v místě spojení je heteroduplexní spojující sekvence. - V donorovém místě po vyčlenění transpozonu vzniká krátká delece - Kružnicový intermediát se nemůže replikovat, ale je přenesen do jiné buňky procesem podobným konjugaci plazmidů. - Transpozon má své vlastní oriT místo a tra geny (jsou podobné plazmidu RP4 a F). - Iniciace transferu začíná vytvořením zlomu v oriT a do recipientní buňky je přenesen jeden řetězec. - V recipientní buňce se konce transpozonu spojí a je dosyntetizován komplementární řetězec. - Int protein kódovaný transpozonem pak integruje transpozon do DNA recipientní buňky vytvořením tupých konců v její DNA – proto nevznikají duplikace cílové DNA. Proces přenosu konjugativních transpozonů Tn916 a CTnDOT MODEL EXCIZE A INTEGRACE KONJUGATIVNÍCH TRANSPOZONŮ Tn916 A CTnDOT Spojovací chromozomové sekvence (XXX/YYY nebo QQQ/RRR jsou původně vzájemně komplementární). Šipky naznačují místa vzniku posunutých zlomů před excizí nebo před integrací MOBILIZACE GENETICKÝCH ELEMENTŮ KONJUGATIVNÍMI TRANSPOZONY (PŮSOBENÍ IN TRANS) Mobilizovatelný rezidentní plazmid nese geny kódující proteiny vytvářející zlom v jeho DNA, CTn zajišťuje vytvoření multiproteinového párovacího aparátu CTn navozuje excizi rezidentního mobilizovatelného transpozonu (MTn) - CTn poskytuje proteiny pro excizi a cirkularizaci a pro přenos ss-formy MTn do recipienta, kde se MTn již samostatně integruje do chromozomu Přenos Tn918 do S. aureus prostřednictvím konjugativního plazmidu ( příklad „hitch-hiking“) Transpozon se inzertuje do konjugativního plazmidu Str. feacalis a tento komplex je přenesen do S. aureus, kde se plazmid nereplikuje, Tn se vyčlení a začlení do chromozomu S. aureus.