MUTAGENEZE INDUKOVANÁ TRANSPOZONY (TRANSPOZONOVÁ MUTAGENEZE) Výhody: 1. vyšší frekvence mutace než při klasické mutagenezi 2. úplná blokáda transkripce a translace zasažených genů – dosažení plně mutantního fenotypu 3. silný polární účinek (zejména na operony) 4. ve většině případů jen jediná mutace na buňku (inzerce jediného transpozonu) 5. možnost přímé selekce mutant (geneticky podle markeru na transpozonu, nebo s využitím sekvence transpozonu jako sondy) Inzerce transpozonu pro účely mutageneze nemohou být směrovány do určitého genu. Technika využívá skutečnosti, že inzerční místa transpozonu jsou víceméně náhodná. Požadované mutace jsou skrínovány mezi větším počtem inzerčních mutant standardními postupy. Vlastnosti transpozonu vhodného pro mutagenezu: ◼ a) začleňování do náhodných míst (Tn5, Tn7, Mu) ◼ b) stabilita inzerce (možnost odstranění genu pro transponázu) Nejrozšířenější použití transpozonů je mutageneza za účelem lokalizace genů a charakterizace jejich exprese Charakteristika mutací způsobených transpozony  1. Transpozony mohou být začleněny do velkého počtu různých míst v bakteriálním genomu (chromozomu a plazmidech) (prakticky v každém genu nebo v jeho blízkosti).  2. Geny se začleněným transpozonem ztrácejí plně svou funkci (nulové (inzerční) mutace).  3. Fenotyp inzerčních mutací je doprovázen rezistencí k antibiotikům podmíněnou genem pro rezistenci na transpozonu (snadná selekce mutant v novém hostiteli selekcí na AntR).  4. Inzerční mutanty mají inaktivován obvykle jen jeden gen, mutanty s více mutacemi jsou vzácné.  5. Inzerční mutace obvykle revertují přesnou excizí transpozonu, doprovázenou ztrátou transpozonu (frekvence zpětné mutace je ale velmi nízká).  6. Inzerce v operonech jsou silně polární. Lze určit, zda geny jsou součástí operonu (a jejich pořadí).  7. Transpozony mohou vyvolat delece v okolí svého začlenění. Lze tak připravit deleční mutanty vhodné pro mapování genů.  8. Transpozony představují přenosné oblasti homologie. Lze pomocí nich vnést do genomu další genetické elementy rekombinací.  9. Lze získat inzerce poblíž genu zájmu, nikoliv v něm samém (vnesení promotorů a dalších sekvencí na transpozonu – reportérové geny) gen A gen B antR SITUACE VHODNÉ PRO VYUŽITÍ TRANSPOZONOVÉ MUTAGENEZE  a. hledaná mutace má obtížně selektovatelný fenotyp ◼ snížení počtu klonů, které nutno prověřit (mutanty Nif- deficientní v symbióze s rostlinou: genotyp může být nod- nebo nif-) ◼ identifikace genů, které jsou zapínány např. při poškození DNA nebo po vystavení buněk specifickým faktorům b. studovaný druh (kmen) je klasické mutagenezi nepřístupný ◼ mutanty v metabolických drahách, např. auxotrofní  c. kmen má několik podobných aktivit, znemožňujících přímý skríning na fenotyp ◼ gen je nejdříve klonován v jiném hostiteli (E. coli) a po mutagenezi je přenesen do původního kmene, kde se alely zamění homologní rekombinací („reverzní genetika“ - u druhů dosud geneticky málo prostudovaných) Vektory používané pro dopravení transpozonu do buněk, v nichž mají navodit mutaci = tzv. SEBEVRAŽEDNÉ VEKTORY  A. Vektory odvozené od fága lambda obsahující mutace sus - replikují se v buňkách E. coli obsahujících supresory; v buňkách sup- se chovají sebevražedně  B. Vektory odvozené z promiskuitních plazmidů (konjugativních nebo mobilizovatelných) – po přenosu do cílové buňky se nereplikují  C. Vektory s ts mutacemi v replikačním aparátu (při vyšší teplotě se nereplikují)  D. Inkompatibilní plazmidy: první plazmid nese transpozon, po přenosu je z buňky vytěsněn druhým plazmidem ABr = ANT rezistenceABr = ANT rezistence na T X = gen, který má být mutován Vektor nesoucí transpozon chromozomu selekce s využitím markerů antibiotikové rezistence nesených na plazmidu a na transpozonu MUTAGENEZE POMOCÍ TRANSPOZONU Tn5 Sebevražedný mobilizovatelný vektor ColE1 Inzerce Tn5 do chromozomu Náhodná mutageneze plazmidů - Vnesení Tn5 do buňky na sebevražedném vektoru (fág lambda) Selekce na plotnách s kanamycinem Izolace plazmidové DNA TRANSFORMACE, SELEKCE BUNĚK KanR G- bakterie: ColE1 se nereplikuje Vytváření mutací na plazmidu nebo v klonované DNA 1. Klonování genu nif v E. coli, provedení mutageneze (gen je přerušen transpozonem) Transpozonová mutageneze genu nif u Rhizobium meliloti Kmen E. coli s mutací recA Selekce buněk TcR, buňky recA- jsou UV-senzitivní Tn10 začleněn poblíž lokusu recA PŘENOS ALELY recA- PO OZNAČENÍ TRANSPOZONEM donor recipient rekombinant Transdukovaný fragment z kmene 1 Chromozom kmene 2 Rekombinantní chromozom kmene 2 kmen 1 kmen 2 STANOVENÍ FYZICKÉ LOKALIZACE GENŮ NA REPLIKONECH A MAPOVÁNÍ GENŮ Zjištění, zda geny s určitou funkcí jsou umístěny na plazmidu nebo na chromozomu nebo zda jsou distribuovány na více replikonech není snadná úloha. „Transpozon targeting“ (cílené začlenění transpozonů) do genů napomáhá v řešení těchto úloh, jak dokresluje tento příklad:  Předpokládalo se, že funkce (geny) týkající se onkogeneze u rostlin infikovaných A. tumefaciens se nacházejí na Ti plazmidu. Bylo izolováno 37 inzerčních mutant Tn5 v kmenech obsahujících Ti plazmid a vykazujících změněnou virulenci. V každém z mutantních kmenů byly transpozony fyzicky lokalizovány na replikonech.  Plazmidová a chromozomová DNA z těchto mutant byla separována za užití standardních technik (rozdíl ve velikosti a nebo GC obsahu). Každá DNA byla hybridizována se značeným Tn5. Dvanáct mutací bylo chromozomálních a 25 nesených na plazmidu. TRANSPOZONOVÁ MUTAGENEZE IN VITRO  Nevýhody mutageneze in vivo: ◼ částečná životaschopnost sebevražedných vektorů --- falešně pozitivní výsledky ◼ omezená velikost cílového genu --- nutný rozsáhlý skríning nebo selekce mutant ◼ u některých bakteriálních druhů nejsou k dispozici vhodné transpozony  Průběh mutageneze in vitro:  Výchozí předpoklad: transponáza je schopna provést většinu reakcí též in vitro ◼ k cílové DNA je přidána donorová DNA nesoucí transpozon a enzym transponáza – dojde k transpozici transpozonu do cílové DNA ◼ cílovou DNA mohou být replikony, např.plazmidy, které se v cílové buňce replikují, nebo lineární úseky DNA, které lze pak zavést do buněk, kde se rekombinací začlení do chromozomu (nahradí standardní gen genem se začleněným transpozonem) ◼ lze použít mutovanou transponázu se zvýšenou účinností transpozice (až 1000x) ◼ lze použít transpozony postrádající gen pro transponázu (stabilní inzerce)  Použití tranpozozomů  Transpozozom (transposome): transpozon, na nějž byl in vitro navázán enzym transponáza  Transpozozom se připraví in vitro v prostředí bez Mg-iontů, čímž dojde k rozštěpení donorové DNA, ale transponáza zůstává přichycena na koncích. Tento meziprodukt transpozozom - se do buněk přenese elektroporací, v nichž transponáza katalyzuje transpozici transpozonu do cílového místa. Enzym je brzy rozložen, takže k další transpozici nemůže docházet. Následně proběhne selekce pro vyhledání žádaných klonů. In vivo integrace Mu-transpozozomu sestaveného in vitro. Tetramer transponázy MuA a konce mini-Mutranspozonu vytvoří in vitro stabilní komplex protein– DNA. Po přenosu do buňky elektroporací se za přítomnosti Mg-iontů transpozon začlení do chromozomu bakterie. Transpozon vyštěpený z donorové molekuly pomocí vhodné RE transponáza transpozozom Přenos transpozozomu je možný i do eukaryotických buněk Vnesení transpozomu do buňky elektroporací, selekce a sekvenční a fenotypová analýza mutovaných klonů Klony s transpozonem začleněným do různých genů, selekce podle fenotypu Analýza mutovaného genu Tn5 gen REP primery (nebo do něhož se Tn začlenil) RE RE Tn Klonování (vyprošťování) genů mutovaných transpozony Využití Klonování dosud neznámých genů, jejichž mutace vedou ke změně fenotypu, zvláště u bakterií, které se obtížně kultivují (analýza projevu genů se provádí po přenosu do E. coli) Přenos do E. coli Příprava sondy pro vyhledání wt genu v původním hostiteli „plasmid rescue“ – vyproštění genu Transpozon obsahuje plazmidový počátek replikace ori. Transpozon je vyčleněn z chromozomu pomocí vhodné restriktázy (zde EcoRI), je cirkularizován ligázou a přenesen transformací do E. coli. Následuje analýza úseků chromozomové DNA, která přiléhá k transpozonu. MODIFIKACE TRANSPOZONŮ ROZŠIŘUJE MOŽNOSTI JEJICH POUŽITÍ  1. Náhrada genů pro rezistence k antibiotikům: deriváty Tn5 nesoucí sadu různých rezistencí k antibiotikům. Jsou vhodné v kmenech, kde rezistence ke kanamycinu není účinně exprimována.  2. Přidání oriV z plazmidu Sel01 do Tn5 přeměnila tento transpozon na plazmid, který se může replikovat v E. coli.  3. Zavedení oriT (mob) sekvence z RK2 dovoluje mobilizaci chromozomu, do něhož je modifikovaný transpozon začleněn, za předpokladu, že v donorové buňce je přítomen pomocný konjugativní plazmid RK2. Možnost křížení kmenů konjugací.  4. Do blízkosti konců transpozonu lze zavést in vitro sekvence odpovídající místům pro RE. Jestliže je takto modifikovaný transpozon integrován do plazmidu (vektoru), který tato restrikční místa nemá, představují pak koncové sekvence transpozonu jedinečná místa pro klonování a restrikční mapování.  5. Fyzikální separací transponázového genu od zbytku elementu (transpozonu) se vytváří minitranspozon. Když jsou tyto dvě části (tj. gen pro transponázu a minitranspozon) přítomny ve stejné buňce (na stejném nebo různých vektorech), exprese transponázy (obvykle pod kontrolou jiného, inducibilního promotoru) dovoluje transpozici minitranspozonu do cílového místa nebo míst transponovaný element (minitranspozon) v místě začlenění se sám nemůže dále transponovat a tak představuje stabilní marker a irreverzibilní mutaci. použití BAKTERIOFÁG Mu - GENETICKÁ MAPA Oblast zodpovědná za transpozici Fág Mu infikuje široké spektrum G- bakterií SVH – krátká (150 bp) variabilní sekvence z chromozomu hostitele LVH – dlouhá (asi 1,5 kb) variabilní sekvence z chromozomu hostitele attL, attR – konce transpozonu nutné pro transpozici gin - gen kódující invertázu, která invertuje 3kb invertovatelný segment (inv.seg) Mud = INZERČNĚ-DELEČNÍ DERIVÁTY FÁGA Mu a MINITRANSPOZONY Využití Mud a Tn k analýze regulace genů Využití modifikovaných transpozonů Mud pro přípravu genových fúzí  Mud(ApR, lacZ) je modifikovaný fág Mu, u něhož byly deletovány geny pro lytické funkce a nahrazeny genem bla (ApR)(selekce) z Tn3 a lacZ (reportér) z E. coli K12. Byly připraveny dvě serie Mud (Ap, lacZ): 1. U první serie byly zachovány translační signály (rbs) genu lacZ, ale byl deletován promotor tohoto genu. Gen lacZ může být exprimován, když se Mud inzertuje distálně od jiného promotoru ve správné orientaci. Pozorování změn hladiny exprese b-galaktozidázy po změnách podmínek prostředí umožňuje studovat způsob regulace daného genu (nebo operonu). Tento způsob, zvaný transkripční (operonové) fúze, byl intenzívně využíván při studiu exprese genů, jejichž fenotyp se obtížně monitoruje*. 2. U druhé serie Mud je gen lacZ zbaven místa rbs a též prvních nukleotidů kódující sekvence. Gen může být exprimován jen tehdy, když je transpozon Mud inzertován ve správném čtecím rámci ve směru transkripce od kompletních expresních signálů jak pro transkripci, tak pro translaci (promotor a rbs). Transpozon v tomto případě navozuje translační (genové) fúze. *tvorba B-galaktozidázy se detekuje snadno po přidání X-gal – podle modrého zbarvení kolonií. GENOVÉ FÚZE IN VIVO A. Operonové fúze. U tohoto typu Mud-vektoru mají geny lac svůj vlastní start translace (RBS, AUG) a proto je exprese lacZ přímo úměrná transkripci z promotoru mutovaného genu, avšak translace lacZ je nezávislá na mutovaném genu. Jsou vytvářeny dva samostatné proteiny: N-terminální část produktu mutovaného genu a produkt genu lacZ (B-galaktozidáza). B. Translační fúze. U tohoto typu Mud vektorů nemají geny lac své vlastní místo startu translace (rbs), takže exprese genu lacZ je určena jak transkripcí tak translací mutovaného genu. Při genové fúzi se tvoří hybridní protein s N-terminální částí mutovaného genu kovalentně navázanou na C-konec B-galaktozidázy. Vlastnosti konstruktů pro fúze: Transkripční (operonová) fúze Translační (proteinová) fúze MudI = operonové fúze, MudII = genové fúze jeden transkript, dva produkty jeden transkript, jeden produkt M = gen, do něhož se Mu začlenil Reportérové transkripční (operonové) a translační (genové) fúze mají řadu využití, např. mohou být použity ke stanovení, zda regulace genové exprese sledovaného genu probíhá na transkripční nebo translační úrovni. ◼ Když je gen regulován na transkripční úrovni, bude b-galaktozidáza exprimována jak v případě operonových tak i genových fúzí a indukována nebo reprimována v podobném rozsahu jako gen, do něhož je transpozon začleněn. ◼ Jestliže je gen regulován na úrovni translace, nebude v případě operonové fúze b-galaktozidáza ani indukována ani reprimována, ale v případě genové fúze bude exprese b-galaktozidázy regulována. Tvorba galaktozidázy je ovlivněna translačními signály genu X MudI MudII Exprese lacZ je řízena signály pro transkripci genu X Mud IZOLACE (příprava) GENOVÝCH FÚZÍ PO NÁHODNÉM ZAČLENĚNÍ Mud(AmpR; lac) Indukce profágů, vznik smíšeného fágového potomstva Na plotnách s X-gal se selektují klony s Mud začleněným za promotor specificky regulovaného genu Buňky rostou na Amp a mohou exprimovat b-galaktozidázu Buňka kmene obsahující Mudlac a Mu (pomocný fág) Pro vyhledávání genů, jejichž produkty jsou exportovány do periplazmy nebo do prostředí, byl zkonstruován TnPho. Tento transpozon nese gen pho, který kóduje alkalickou fosfatázu (protein E. coli exportovaný do periplazmatického prostoru). Je aktivní jen jako dimer. Translací vzniká dlouhý prekurzor se signálním peptidem, který je při transportu do periplazmatického prostoru odštěpen. Selekce pomocí XP (5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfát) Signální sekvence genu vir Sekretovaný fúzní protein - pho je aktivní periplazmatický fúzní protein - pho je aktivní cytoplazmatický fúzní protein - pho je inaktivní Transpozon TnPho začleněn do genu vir TnPhoA vyběr klonů, které vykazují změnu v regulaci a expresi lacZ za různých podmínek (např. různá konc. Fe, různá teplota) Klonování neporušeného genu, jehož exprese je ovlivněna změnou podmínek Mud je začleněn do genu, který je aktivován jen při nízké koncentraci Fe Objasnění způsobu regulace Růst buněk za přítomnosti různých indukčních agens Vnesení Mud do buňky a jeho náhodné začlenění do genu X Identifikace genů din aktivovaných po poškození DNA din = damage inducible 1. Přenos Mud (AmpR, lacZ) do E. coli (na fágovém vektoru) 2. Izolace transduktantů AmpR Razítkování jednotlivých transduktantů na plotny s X-gal (A) a na plotny s X-gal + činidlem poškozujícím DNA (B) Modré kolonie = transpozon se začlenil do genu aktivovaného po poškození DNA A B