LASEREM INDUKOVANÁ FLUORESCENCE Vítězslav Otruba •Atomová fluorescence •Energetická výtěžnost fluorescence χF •Kvantová účinnost fluorescence ΦF • • • •Zhášení fluorescence: kolize excitovaných atomů s •ostatními částicemi atomizátoru – předání E bez •vyzáření fotonu. •Rozptyl fluorescenčního záření: na nevypařených •částicích v atomizátoru a na optice spektrometru. 2010 prof. Otruba 2 Atomová fluorescence Atomová fluorescence •Základní vztahy •Vliv saturace 2010 prof. Otruba 3 Buzení fluorescence 2010 prof. Otruba 4 Schematický diagram spektrometru 2010 prof. Otruba 5 Schematic diagram of laser-excited atomic fluorescence flame spectrometry system: A, N2 laser; B, dye laser; C, dye laser control unit; D,vacuum pump; E, N2 laser power supply; F, trigger source; G, beam expander; H, panel; I, diaphragm; J, burner/nebulizer; K, light trap; L, light trap; M, diaphragm; N, light baffle and lens; 0, monochromator; P, photomultiplier detector; Q, recorder; R, boxcar integrator; S, photo multiplier power supply. Kalibrace vlnových délek 2010 prof. Otruba 6 Koncentrační závislost •Analytical growth curves •nickel fluorescence excited at 300.249 nm and measured at approximately 342 nm •tin fluorescence excited at 300.914 nm and measured at 317.5 nm. 2010 prof. Otruba 7 LAF přehled •Detekční limity a lineární dynamický rozsah stanovení v plameni acetylen – vzduch • 2010 prof. Otruba 8 LAF - ICP 2010 prof. Otruba 9 LAF – Noble metals 2010 prof. Otruba 10 LAF - ETA 2010 prof. Otruba 11 Tříhladinový systém •Za předpokladu, že spektrální šířka absorpčního profilu hladin je menší než spektrální šířka budícího záření, platí: •dn1/dt=-n1(R12+R13)+n2R21+n3R31 •dn2/dt=n1R12-n2(R21+R23)+n3R32 •dn3/dt=n1R13+n2R23-n3(R31+R32) •kde Rij jsou rychlosti excitace a deexcitace příslušných hladin zahrnující radiační a srážkové procesy. 2010 prof. Otruba 12 R13 R31 R32 Fluor. R21 3 2 1 Čerpání 1 – 3: R12 = R23 = 0; R31 = ϱB31 + A31 + Z31 R13 = ϱB13; R21 = Z21; R32 = A32 + Z32 Detekce olova v plynné fázi 2010 prof. Otruba 13 R13 R31 R32 Fluor. R21 2 1 3 Detekce olova v plynné fázi •PLAS ≈ 2 kWcm-2 •Δλ= 0,02 nm •τ = 5 ns •Ω = 0,16 sr •f/D = 1 : 2,5 •F = 50 Hz •tint = 15 s •MD = 30 atomů Pb 2010 prof. Otruba 14 200 400 °C 2 6 12 log n (at/ml) LAF v grafitové kyvetě - Tl •λexc = 276,8 nm, •λfl = 352,9 + 351,9 nm •Laser barvivový, • 2. harmonická •Buzení dusíkový laser •Plas = 150 nJ, τ = 5 ns, • Δλ = 0,01 nm •RSD: 0,5 pg Tl 9%; 50 pg Tl 6%, 500 pg Tl 4% 2010 prof. Otruba 15 10 105 107 Φ 10-15 10-10 10-6 g Tl Atomární svazky – absorpce a fluorescence •Svazek atomů či molekul expandující do vysokého vakua ve formě paprsku má ve směru kolmém na pohyb částic teplotu blížící se 0K. Pomocí fluorescence je možné (nepřímo) měřit absorpční spektrum. Přímé měření absorpce je obtížné díky nízké koncentraci měřených částic. 2010 prof. Otruba 16 Absorpční a fluorescenční spektrum NO2 •A – absorpční spektrum měřené v kyvetě •B – fluorescenční spektrum měřené v molekulárním svazku při teplotě 30 K •C – fluorescenční spektrum měřené při teplotě 3 K v přítomnosti Ar jako nárazníkového plynu 2010 prof. Otruba 17 A B C 2010 prof. Otruba 18 Excitace molekulové fluorescence •Nevýhodou klasických excitačních širokopásmových zdrojů záření je současná excitace většího počtu vyšších energetických hladin, z nichž dochází na celé řadě přechodů ke spontánnímu vyzařování. •V případě laserem vzbuzené fluorescence (LIF, laser induced fluorescence) se obvykle excituje jen jedna horní hladina. • 2010 prof. Otruba 19 Vlnová délka, nm Spektrum perylenu v ethanolu při 4,2 K. 1 – excitace Hg výbojkou při ≈ 365 nm. 2 – excitace při 443 nm laserem Δλ= 0,0125 nm. Časově rozlišená fluorescence •Různá doba života excitovaných stavů u různých molekul dovoluje při použití časově rozlišené fluorescence zvýšit selektivitu detekce např. u kapalinové chromatografie, ale i v řadě dalších aplikací, především ve fluorescenční mikroskpii. •Na obr. je ilustrována změna fluorescenčního spektra fluorescenčního detektoru v HPLC. •1-antracen, 2-azulen, 3-1,12-benzperylen, 4-chrysen, 5-fluoranten, 6-pyren 2010 prof. Otruba 20 0 ns 15 ns 45 ns Eluční čas, minut Konfokální mikroskopie •Odlišnosti konfokálního způsobu od klasického SM •osvětlen je jen jeden bod a signály od okolních bodů (vedle, pod a nad) jsou omezeny otvorem – eliminační aperturou •režim osvětlení: epi (reflexní) nebo fluo – (fluorescenční) •konfokální kondenzor = objektiv (méně odrazů) •skenování: rozmítání laserového svazku, příčné posouvání vzorku před objektivem, případně posouvání objektivu nad vzorkem •konfokální obrazy jsou vždy zaostřené a představují optické řezy vzorkem (pro λ = 488 nm tloušťka = 0,4 μm) 2010 prof. Otruba 21 Konfokální mikrofluorimetrie 2010 prof. Otruba 22 Dvoufotonový mikroskop •Dvoufotonový mikroskop je nový typ optického mikroskopu. Poprvé jej r. 1990 představili američtí vědci v čele s Wattem W. Webbem z Cornellovy univerzity v Ithace. Podobně jako „klasický“ konfokální mikroskop umožnuje zobrazovat tenké optické řezy tlustším vzorkem, jeho princip je však odlišný. Místo jednofotonové excitace využívá speciální laser k excitaci dvěma fotony, které jsou absorbovány téměř současně, s šířkou pulzu řádově pouhých 100 femtosekund. Pravděpodobnost dvoufotonové excitace je úměrná druhé mocnině intenzity excitačního pole. Je nejvyšší v rovině zaostření, a proto k získání obrazů optických řezů vzorkem nepotřebujeme konfokální clonku. Mezi výhody dvoufotonové mikroskopie ve srovnání s mikroskopií konfokální patří například větší hloubka proostření (až do 400 μm), a to i u vzorků, jejichž povrchové vrstvy silně fluoreskují, dále pak zvýšený podíl signálu vůči šumu, tedy i kontrastnější zobrazení, zejména v hlubších vrstvách vzorku. 2010 prof. Otruba 23 Rozptyl záření •Rozptyl budícího záření ve fluorescenční spektrometrii je obvykle základní faktor limitující mez detekce, a to: •Rayleighův rozptyl je pružný rozptyl na částicích menších než vlnová délka primárního záření •Mieho rozptyl je pružný ropzptyl na částicích větších než vlnová délka primárního záření •Rozptyl nekoherentní (nepružný) – rozptýlené záření má jinou vlnovou délku než záření primární •Fluorescence molekul •Ramanův rozptyl •Rezonanční fluorescence •Rozptyl záření na měřící instrumentaci 2010 prof. Otruba 24 Rayleighův rozptyl 2010 prof. Otruba 25 hν hν Virtuální hladina Základní hladina ϱR ≈ 10-10 ϱA Mieho rozptyl •Když se velikost částic přiblíží a nakonec přesáhne vlnovou délku světla λ, Rayleighův přístup se již nedá použít. Pro kulaté částice se dá použít teorie odvozená v roce 1908 německým fyzikem G. Miem. • •Mieova teorie předpokládá, že každá částice, na kterou dopadne světlo,se chová jako rezonanční oscilátor, při čemž bere do úvahy, že při interakci paprskem dochází k rozptylu, odrazu, absorpci, lomu a interferenci světla. 2010 prof. Otruba 26 A hν hν ∅A ≧ λhν Rayleighův a Mieho rozptyl 2010 prof. Otruba 27 http://www.astrohk.cz/experiment/rozptyl_aparatura_img_2882s.jpg http://www.astrohk.cz/experiment/rozptyl_voda2_img_2897s.jpg voda rozptyl_rayleighuv2_img_2896s.jpg (640×303) mléko - Rayleighův rozptyl rozptyl_mieho2_img_2898s.jpg (640×303) prachová zrna - Mieho rozptyl Ramanův rozptyl 2010 prof. Otruba 28 Soubor:Ramanscattering.png ϱR ≈ 10-15 ϱA absorpční průřez Fluorescence molekul •Fluorescence molekul může být velmi rušivý jev, poněvadž fluorescenční spektrum může pokrývat velký rozsah vlnových délek – až stovky nm. 2010 prof. Otruba 29 hν hν* BBQ - [4,4" "-bis-(2-butyloctyloxy)-p-quaterphenyl] Korekce pozadí •Korekce signálu na rozptýlené záření, resp. snížení rozptýleného záření, dovoluje snížit mez detekce až o několik řádů. Optimální je měření fluorescence na jiném přechodu, než na kterém probíhá excitace. Další možnosti jsou: •Využití Zeemanova jevu – štěpení absorpční čáry v magnetickém poli •Skenování pomocí laditelného laseru – měření rozptylu v okolí fluorescenční čáry. •Periodické rozmítání emisní čáry budícího laseru v kombinaci s frekvenčně selektivní detekcí (např. lock-in) •Využití časově rozlišené fluorescence •Multikanálová detekce • 2010 prof. Otruba 30 Korekce pozadí Zeemanovým jevem •V proměnném magnetickém poli se mění absorpční profil spektrální čáry, kterou excitujeme pro měření fluorescence. V případě dokonalého štěpení čáry měříme v přítomnosti magnetického pole pouze rozptýlené záření. Pokud dokonalé štěpení absorpčního profilu nenastává (v praxi téměř vždy), pak fluorescenční signál kolísá v rytmu změn magnetického pole a tuto frekvenci je možné dobře oddělit od konstantního signálu rozptýleného záření. •Molekulová spektra některých molekul, např. O2, NO, ClO2, NO2, jsou v magnetickém poli také modulována, takže Zeemanův jev ke korekci jejich fluorescence není možné použít. • 2010 prof. Otruba 31 Detekce jednotlivých atomů 2010 prof. Otruba 32 x(t) y(t) Ix Iy Rxy t t t Rxy (Uxy) atomů/sec Detekce jednotlivých atomů 2010 prof. Otruba 33 laserový paprsek, I>Isat atom AF (n) Nejběžnější náhodné procesy: •Gaussovský proces (spojitá proměnná) •Brownův pohyb, •difúze, •rychlost molekul, •šíření tepla, •šum v elektr. obvodech, •fluktuace tlaku, •elektrická intenzita světla •Poissonovský proces (diskrétní proměnná) •radioaktivní rozpad, •pojišťovací události, •poruchy, zmetky, •dopravní zácpy, •fluktuace hustoty atomů (molekul), •výstřelový šum, •fotodetekce, •standardní kvantový šum • • 2010 prof. Otruba 34 Korelace náhodných veličin •Střední hodnota ‹xy› součinu dvou nezávislých veličin je rovna součinu jejich středních hodnot ‹x› ‹y› → ‹xy›-‹x›‹y›=0 •Míra závislosti neboli korelace C(x;y) je definována vztahem: • C(x;y) ≡ ‹xy›-‹x›‹y› •Korelace fluktuací C(Δx;Δy): • Δx ≡ x - ‹x›; Δy ≡ y - ‹y› •jsou fluktuace příslušných veličin a jelikož • ‹Δx› = 0; ‹Δy› = 0 •Bude C(Δx;Δy) = ‹Δx.Δy› - ‹Δx›‹Δy› = ‹xy›-‹x›‹y› a tedy • C(Δx;Δy) = C(x;y) • • • 2010 prof. Otruba 35 Diskrétní náhodný proces 2010 prof. Otruba 36 pravděpodobnost impulzu je úměrná času ® Poissonovský proces p(n) » ánńn /n! Poissonovský proces á(Dn)2ń = ánń Chaotický proces á(Dn)2ń > ánń (shlukování impulzů) Deterministický proces á(Dn)2ń = 0 (antishlukování impulzů á(Dn)2ń < ánń) čas deterministický proces – takový, kde každý následující stav nutně vyplývá z předchozího stochastický proces – takový, kde lze další vývoj předvídat jen s určitou pravděpodobností Spektroskopie jednotlivých molekul •Je-li ve vzorku 105 molekul, dostáváme široký pás, často nazývaný nehomogenně rozšířený pás. •Snížíme-li počet molekul na 103, pás zůstává široký a objevuje se jemná statistická struktura. •Je-li 10 molekul ve vzorku, napočítáme ve spektru 10 dobře rozlišených spektrálních čar. •Laser zaostříme na mikrometrový průměr při koncentraci vzorku 10–7 mol/l. 2010 prof. Otruba 37 Experimentální požadavky •Bude světlo vyzářené jednou molekulou dost silné na to, abychom ho dokázali zaregistrovat? •Světlo musíme zachytit co nejúčinněji – nejlépe tak, že vzorek umístíme do ohniska parabolického zrcadla nebo objektivu mikroskopu. •použít co nejcitlivější detektor světla, nejlépe fotonásobič a čítač fotonů. I tak ale zaregistrujeme přinejlepším několik procent vyzářeného světla. A vzhledem k tomu, že na výstupu z detektoru bychom potřebovali detegovat aspoň stovky impulzů za sekundu, abychom světlo molekuly odlišili od pozadí, musí být molekula schopna vyzářit za stejnou dobu desetitisíce (104) fotonů, aniž by při tom prodělala jakoukoli změnu. A aby pozadí bylo co nejnižší, musí molekula měřící laserové světlo také účinně pohlcovat. Z toho všeho se nám pomalu rýsují vlastnosti, jaké bude muset molekula mít: vysoký absorpční průřez, vysoký kvantový výtěžek fluorescence, vysokou stabilitu a zanedbatelné obsazování tripletního stavu. To jsou poměrně přísné požadavky, které doposud splňuje několik málo aromatických uhlovodíků. Nejčastěji se pro spektroskopii používají pentacen a terrylen. •Zkusme tedy shrnout experimentální podmínky: potřebujeme měřit zředěný roztok (o koncentraci nejvýše 10–7 mol/l) vhodně vybraných molekul při nízké teplotě (nejlépe pod 2 K). Signál musíme sbírat optikou s vysokou numerickou aperturou a detegovat velmi citlivým detektorem. A potřebujeme měřit excitační spektra, tzn. budeme sledovat, jakou frekvenci má světlo, které molekula pohltí, tím, že budeme registrovat světlo, které molekula po pohlcení vyzáří. • 2010 prof. Otruba 38 Reprodukovatelnost spekter •Vezměme organickou látku terrylen a rozpusťme ji v normálním alkanu (např. dodekan) na koncentraci 10–7 mol/l. Na obr. vidíme spektrum takového vzorku, které na první pohled vypadá spíš jako chaotický šum. Ve skutečnosti jde o dvě různá spektra měřená hned po sobě, která se téměř dokonale překrývají. Podíváme-li se na obrázek, připomene nám to prostřední spektrum – ano, jde o jemnou statistickou strukturu. Molekuly v krystalu zamrzly chaoticky a výsledkem je značně rozdílný počet molekul na jednotlivých frekvencích. 2010 prof. Otruba 39 Spektrum jedné molekuly •Přelaďme tedy frekvenci světla laseru na okraj širokého pásu – tam můžeme jednotlivé čáry rozlišit. Pak celému spektru dominuje jedna úzká intenzivní čára, která pochází od jedné molekuly. 2010 prof. Otruba 40 Orientace molekul v krystalu •dvě spektra celé série čar jednotlivých molekul, přitom každá z nich je jinak intenzivní •ne všechny molekuly se nalézají přímo v bodě největšího zaostření laserového paprsku •Další příčinou je, že záření laseru je polarizované. Polarizované světlo nejlépe pohlcují molekuly jejichž dipólové momenty přechodu jsou orientovány rovnoběžně s rovinou polarizace laserového světla. Naopak molekuly, které jsou orientovány kolmo k této rovině, nepohlcují světlo vůbec. •Při měření spekter byl použit analyzátor. Ten nám umožňuje zjistit, jak je polarizované světlo, které molekuly vyzařují. Opět nejlépe zaregistrujeme molekuly, jejichž vyzářené světlo je polarizované rovnoběžně s rovinou analyzátoru, kdežto ty, jejichž rovina polarizace je kolmá k analyzátoru, nezaregistrujeme vůbec. •Spektra se liší tím, že jedno je změřeno s analyzátorem rovnoběžným s rovinou polarizace laseru, druhé s analyzátorem kolmo k polarizaci laseru. Jak se tedy mění intenzity jednotlivých čar? • Čáry číslo 1 a 3 jsou v dolním spektru méně než poloviční, čára 2 zmizela úplně a čára 4 zůstala stejná. Co nám to říká o orientaci molekul? Molekula 2 musí být rovnoběžná s rovinou polarizace laseru, molekula 4 s ní svírá úhel přibližně 45 stupňů, a molekuly 1 a 3 úhly mezi 0 a 45 stupni.. •V každém případě nám obr. ukazuje jednu z možností této metody – dokážeme poměrně přesně měřit orientaci jednotlivých molekul ve vzorku! Polarizační spektra jednotlivých molekul. Intenzita jednotlivých čar se mění při změně orientace roviny analyzátoru ze směru rovnoběžného s rovinou polarizace laserového světla (horní spektrum) do směru kolmého (dolní spektrum). Terrylen v dodekanu, teplota 1,6 K. 2010 prof. Otruba 41 Emisní profil fluorescence •Na obr. je detailně změřena čára jedné molekuly. Má lorentzovský profil, jak to předpovídá kvantová teorie, a je to také jeden z argumentů, proč jde právě o jednu molekulu a ne o více. Čára na obr. má šířku 52 MHz. Tady se znovu obrátíme ke kvantové teorii, jejíž princip neurčitosti nám říká, že šířka čáry je nepřímo úměrná době života vybuzeného stavu molekuly. Doba života vybuzeného stavu se dá přímo změřit a pro terrylen vychází 3,8 ns, a měla by být pro všechny molekuly stejná. Z toho pak snadno spočítáme, že všechny molekuly by měly mít stejné spektrální čáry o šířce 42 MHz. Deatilně změřený tvar čáry jedné molekuly, naznačený křížky. Plná čára představuje proložení změřeného spektra lorentzovskou funkcí 2010 prof. Otruba 42 Šířky čar •Histogram ukazuje, s jakou pravděpodobností se ve spektrech vyskytly čáry s danou šířkou, že proti očekávání byla většina čar širších než 42 MHz. Během měření spektra se krystal nepatrně mění, je v neustálém pohybu i když měříme při teplotách 1,6 K. Neustálé nepatrné změny struktury krystalu ovlivňují energetické hladiny molekul. Histogram rozdělení šířek čar 120 molekul 2010 prof. Otruba 43 Přelaďování frekvence molekuly •Změny okolí měřené molekuly ovlivňují samozřejmě její energetické hladiny a tedy i frekvenci vyzářeného světla. Pokud tyto změny nastávají podstatně rychleji, než dokážeme změřit čáru, měříme vlastně jakousi obálku různě pozměněných čar. Histogramy nám pak mohou říci hodně o dynamice krystalů, ale i skel nebo polymerů za nízkých teplot. Spektrální skok čáry jedné molekuly pozorovaný během měření spektra. Čára na nové pozici je opět proložena lorentzovskou funkcí 2010 prof. Otruba 44 SNOM (scanning near-field optical microscope) •Studium rozličných vzorků běžnou optickou mikroskopií naráží na neúprosnou mez rozlišení (plynoucí z vlnové povahy světla) – ohybový (difrakční) limit, jenž omezuje nejmenší vzdálenost dvou bodů, které ještě mohou být odlišeny, na zhruba polovinu vlnové délky použitého světla. •Toto omezení je možné obejít u mikroskopu pracujícího v blízkém optickém poli (scanning near-field optical microscope – SNOM), který je variantou jiných skenujících (či správněji řádkujících) mikroskopů (STM – skenující tunelovací mikroskop, AFM – mikroskop atomárních sil aj.). 2010 prof. Otruba 45 Fluorescenční SNOM •J. Michaelis s kolegy z Univerzity v Kostnici (Nature 405,325–327, 2000) sestavili první zařízení tohoto typu. Využili své zkušenosti se spektroskopií jednotlivých molekul a jako vhodný světelný zdroj zvolili molekulu terylenu. K jeho uchycení použili mikrokrystal p-terpenylu obsahující nepatrnou příměs terylenu (jednu molekulu na 10 milionů molekul krystalu). Z mikronových krystalků byl vybrán jeden s vhodnou fluorescencí právě jedné molekuly terylenu a opatrně přilepen na konec zašpičatěného optického vlákna. Vlákno pak bylo připevněno jako hrot do skenujícího mikroskopu pracujícího za teploty1,4 K. Terylen byl excitován laserovým paprskem účinně budící fluorescenci molekuly terylenu, jako pokusný vzorek posloužily 25 nm velké hliníkové ostrůvky uspořádané v pravidelné mřížce na skleněné destičce. Jedna molekula osvětlovala postupně vzorek a procházející světlo bylo detegováno lavinovou fotodiodou. 2010 prof. Otruba 46 Fotonásobiče - rušivé vlivy •Teplota – termoemise z fotokatody – chlazení na -20°C až -40°C u multialkalických katod, na -160°C u typů AgO-Cs •Magnetické pole – deformace dráhy elektronů v PM – stínění slitiny typu pemalloy •Elektrické pole – deformace dráhy elektronů v PM – Faradayovo stínění •Radioaktivita – záření konstrukčních materiálů, především skla (např. draslík), výběr neaktivních materiálů pro výrobu •Kosmické záření – spršky částic z atmosféry. Stínění, vyloučení chybových signálů korelací s referenčním PM. •Helium – difuze přes sklo. Vyloučení He z atmoféry (GC), výměna PM. • • 2010 prof. Otruba 47 Šum 2010 prof. Otruba 48 NEP (noise equivalent power) 2010 prof. Otruba 49 Frekvenční spektrum šumu 2010 prof. Otruba 50 Čítač fotonů •Signál se nejprve zesílí, komparátorem se oddělí pulsy s dostatečnou amplitudou od šumu. Impulsy je pak možno počítat běžným čítačem nebo zaznamenávat počítačem. Tato metoda je složitější než analogové měření, ale dosahuje většího odstupu šumu a stability. •Fotokatoda a dynody vlivem tepelných kmitů mřížky emitují elektrony i když zrovna nedopadá žádné záření. Vzniká tak výstřelový šum. Odpovídající střední hodnota anodového proudu se pak nazývá temný proud nebo proud za tmy. Pokud je nežádoucí elektron emitován na některé z dalších dynod, nedojde k plnému zesílení a výsledný impuls má znatelně menší amplitudu než impuls vyvolaný fotonem. Pokud využíváme režim čítání fotonů, nastavíme komparátor tak, aby na tyto menší impulsy nereagoval. 2010 prof. Otruba 51