https://www.bonvinlab.org/education/HADDOCK-protein-protein-basic/ • Proteinové interakce – 26.10. – jak spolu proteiny interagují? – interaktom • Proteinové komplexy – 2.11. – protein-proteinové interakce a komplexy – komplexom, architektura a funkce komplexů CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů doc. Jan Paleček jpalecek@sci.muni.cz PROTEOMIKA Souhrn - protein-proteinové interakce + polá hydrofob rní ní primární struktura sekundární a terciární struktura - proteiny/domény/motivy interagují s proteinovými partnery – domény mají určitou strukturu, která do značné míry determinuje tvar jejího povrchu, ale … – charakter (hydrofobicitu, polaritu, náboj) povrchu určují postraní řetězce aminokyselin směřujících do solventu, takže … – interakce proteinu je determinována povrchem, který musí mít tvar i charakter komplementární s interakčním partnerem (typy interakcí: …) - proteiny jsou troj-rozměrné - mají různé tvary a více domén => mají více vazebných míst na povrchu => komplexy a “sítě“ coiled-coil Protein-proteinové interakce • stabilní/silné (velké plochy, většinou součástí komplexů) • přechodné/slabé (součást dynamických procesů – předávání signálů, modifikace) • posttranslační modifikace mohou změnit vazebné vlastnosti povrchu (fosforylace, ubiquitinace, SUMO) • souhrn proteinových interakcí = interaktom (modularita díky interakcím domén – různé kombinace domén - různé „(re-)wiring“ komplexů) interaktom komplex Baderetal,FEBSLett,2008 Baderetal,FEBSLett,2008 modulace interakcí – inhibice vs nové interakce (virovými proteiny, mutacemi) Srovnání interaktomů => konzerv. interakcí (=> evoluce komplexů => evoluce organismů ) Síť neznamená komplex (hůře popisuje stabilní komplexy, ale lépe popisuje vztahy) … kvarterní struktura Sergeant et al.: MCB, 2005 - více povrchů jednoho proteinu interaguje s více partnery - vzájemné interakce více proteinů vytváří větší povrchy a vzájemně se stabilizují – vzniká pevný (kvarterní) komplex Nse4 NSE1 NSE1 NSE4 NSE4 -L,-T,-H -L,-T vect WT L264F P209L patients L97A F266A NSE3 L264F P209L WT WT NSE3 NSE3 vanCrabbenetal,JClinInvest,2016 narušení interakce (Nse3-Nse4) vede k nestabilitě celého komplexu Liljas a spol. ATPasová pumpa komplex se stálým složením/poměrem podjednotek („neměnný“) Stabilní komplex – molekulární stroj PDB: 1C17:Apumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík aspartátu F0 je protonový rotor (uložen v membráně) poháněný tokem vodíkových iontů (z dýchacího řetězce) přes membránu – dva tunely v podjednotce a (přivádí a odvádí protony) Při otočce osa tlačí na F1 stator (3 různé konformace) – levý panel = konformace vhodná pro vazbu ADP - pravý panel = ATP molekula byla vytlačena Iino et al., CO in SB, 2015 rotor je osou spojen s chemickým statorem vyrábějícím ATP (nebo poháněným ATP ). 14.4-ATP_synthase – učebnice: Alberts a spol, Molekulární biologie buňky. „ATP syntasa je jedním z divů molekulárního světa“. Je to molekulární motor – „nanostroj“ – vyrábějící většinu ATP (energie). Mulkidjanian et al, NRM, 2007 - ATPasové pumpy … - sekreční systém (T3SS injectisom) - pohon bičíků … Replikace DNA (video): DNA helikasa (modrá) “denaturuje” dvoušroubovici– připojen je „clamp loader“ (šedá tlapka) - 2 raménka drží DNA polymerásy (fialové) spojené s PCNA („sliding clamp“, zelená). „Leading strand“ je syntetizován kontinuálně zatímco „lagging strand“ musí být primásou (žluto-zelená) odstartován (RNA primer = žlutý – Okazakiho fragmenty). Dynamika komplexů - PPI ATP moduluje interakce Kelch et al, BMC Biol, 2012 Kelch et al, BMC Biol, 2012 Kelch et al, Science, 2011ATP modulace - clamp loader ATP ADP Aktivovaný (ATP) clamp loader interaguje s PCNA a otevírá ji pro DNA. Vazba DNA stimuluje hydrolýzu ATP a uvolnění clamp loader (uzavřeného s DNA). PCNA Zheng a spol, PNAS, 2020 - - polδ-PCNA „dojede“ k RNA primeru (zastaví) - - Fen1 (nucleasa) se naváže na vedlejší PCNA protomer (PIP místo) a rozštěpí RNA - - ligasa kompetuje/nahradí pol/Fen1 a spojí konce DNA interakce PCNA PCNA-Fen1 -> PCNA-Lig1ZhengaShen,JMolCellBiol,2011 Gaoaspol,MolCell,2012 - metylovaný Fen1 (flap endonucleasa) se váže na PCNA (vyštěpí RNA primer) - demetylace a fosforylace disocuje Fen1 z PCNA ( - po ubikvitinaci je degradován) - poté PCNA asociuje s Lig1 (ligásou), která spojí cukrfosfátovou kostru … Posttranslační (PTM) modifikace modulují interkce (složení komplexu) PCNA – regulace buněčného cyklu p21 blokuje přístup polymerás – zastaví se replikace a buněčný cyklus v S fázi p21 je upregulován nádorovým supresorem p53 (v případě poškození DNA …) Magaetal,FASEBJ,2004 p21 interaguje s PCNA podobným způsobem jako polymerasy (kompetuje) Freudenthal et al, NSMB, 2010 pokud je DNA poškozená, polδ se zastaví a je třeba poškození nejdříve opravit – jednou z možností je „zastoupení“ jinou polymerásou, která poškozené místo „toleruje“ a překopíruje (translesion synthesis) – přepíná se ubiquitylací PCNA (na „zadní straně“) TLS polymerasy (η, ι, κ) obsahují PIP a UBM motivy pro interakce s Ubi-PCNA Bergink & Jentsch, Nature, 2009 Sale et al, JCS, 2012 Oprava DNA: PCNA-ptm TLS polymerasy (η, ι, κ) obsahují UBM (tolerují poškozené báze a „zreplikují“ DNA) Srs2 (antirekombinása) obsahuje SIM (nedovolí rekombinaci na zastavených replikačních vidličkách) Template switch K63 polyUb PCNA asociuje s CAF1 (chromatin assambly factor) a pomáhá znovunavázání histonů (nukleosomů) a vzniku chromatinu Dohke et al, Genes to Cells, 2008 Ransom et al, Cell, 2010 PCNA je “swiss-army knife” (PCNA je „core – jádro“ komplexů) PCNA – moduly PCNA je „jádrem“ pro mnoho „attachments“ tj. s mnoha funkčními moduly - Loading - Sliding - Terminace - Buněčný cyklus - TLS a oprava DNA - Chromatinizace … Moldovan et al., Cell, 2007 •Rotační motory: • FoF1-ATPsyntása/ATPasa – přeměna energie ATP na elektrochemický potenciál (mitochondrie) – nebo naopak pumpování protonů přes membránu (vakuoly) • rotace bakteriálních bičíků •Cytoskeletalní motory • Myosin - svalová kontrakce, transport váčků • Kinesin - transport váčků po mikrotubulech od jádra • Dynein - transport váčků po mikrotubulech k jádru, pohyb bičíků •„Motory“ nukleových kyselin: • Helikasy – oddělují řetězce DNA … (transkripce, replikace …) • SMC proteins – zodpovědné za vytváření smyček na chromatinu • RNA polymerasa – přepisuje DNA do RNA • DNA polymerasa – syntetizuje druhý řetězec na ssDNA • Topoisomerasa - redukce supercoiling DNA • RSC a SWI/SNF komplexy remodelují chromatin Molekulární motory Gavin et al., Nature, 2006; Krogan et al, Nature, 2006 Izolace komplexů z kvasinky Saccharomyces cerevisiae 2 – komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější … Proč skládat komplexy z menších podjednotek? Proč skládat komplexy z menších podjednotek? – komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější … – evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací a novou kombinací podjednotek/modulů) – komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější … – evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací a novou kombinací podjednotek/modulů) – skládání i rozpad komplexů jsou snadněji kontrolovatelné, reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství relativně slabých interakcí - nízká energie) – skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá => stává se toxickým až mimo původní buňku) Proč skládat komplexy z menších podjednotek? bakteriální toxin porin v mitochondrii – komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější … – evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací a novou kombinací podjednotek/modulů) – skládání i rozpad komplexů jsou snadněji kontrolovatelné, reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství relativně slabých interakcí - nízká energie) – skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá => stává se toxickým až mimo původní buňku) – velký komplex (homo-oligomer) může být kódován relativně krátkou genetickou informací (skládá se menší protein – větší je méně stabilní a hůře se skládá) – menší pravděpodobnost defektní makromolekuly (menší gen => méně mutací + dá se relativně snadno vyhnout chybám – odstraní/degraduje se pouze jedna poškozená menší podjednotka => méně energie než pro nápravu celé struktury) Proč skládat komplexy z menších podjednotek? Kde najít více proteinových komplexů = PDB Interaktivní web PDB-101 - relativní velikost komplexů voda, ATP ATP pumpa mikrotubuly chromatin Shrnutí • Proteiny mohou být součástí jednoho (stabilní) nebo více komplexů (dynamické/modulární) • Dynamické/modulární komplexy (PCNA) – množství podjednotky determinuje složení komplexu – Interakce/složení podjednotek dynamických komplexů jsou modulovány např. ATP, posttranslačními modifikacemi • Stabilní komplexy (ATPasová pumpa) – podjednotky jsou často koexprimovány (koexprese je vzájemně stabilizuje, lepší rozpustnost) – stabilní komplexy disociují proteolyticky – pokles hladiny jednoho proteinu má za následek pokles hladiny ostatních podjednotek CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů jarní semestr - doc. Jan Paleček Kvíz – zapište komplexy či „molekulární stroje“, které jste zahlédli během videoprojekce Molecular machinery of life: https://www.youtube.com/watch?v=FJ4N0iSeR8U Test 1• testy předat příště přednášejícímu nebo zaslat na E-mail: jpalecek@sci.muni.cz • 1. Jaké typy AMK se nejčastěji podílejí na protein-proteinových interakcích? • a. polární • b. nabité • c. hydrofobní • d. aromatické • • 2. Jaké sekundární struktury se podílí na coiled-coil vazbě? • a. beta-listy • b. beta-listy a šroubovice • c. smyčky • d. vzájemně se obtáčející šroubovice • • 3. interaktom je: • a. interakční síť proteinů (pro daný organismus) • b. soubor všech interakcí jednoho proteinu • c. databáze všech interakcí biomakromolekul • d. interakce podílející se na vzniku komplexů • 4. Jaké charakteristiky musí splňovat povrchy vzájemně interagujících proteinů? • a. stačí, když mají opačné náboje • b. stačí, když mají komplementární tvary • c. musí mít komplementární charakter (tvar, polaritu) • d. stačí, když jsou hydrofobní • 5. napište aspoň 2 příklady proteinů s coiled-coil doménou: Test 2• 6. Co je to komplexom? • a. interakční síť proteinů v buňce • b. soubor všech interakcí jednoho proteinu • c. soubor proteinových komplexů v buňce • d. síť silných interakcí • 7. Jak může post-translační modifikace proteinu přímým způsobem ovlivnit protein-proteinovou interakci? • a. nemůže ji ovlivnit • b. ovlivní pouze konformaci proteinu • c. blokuje nebo posílí vazbu • d. degraduje protein • 8. Jaké hlavní výhody skýtá proteinový komplex složený z podjednotek (oproti stejně velké makromolekule obsahující pouze jeden protein)? • a. lepší dynamika, modularita, regulace • b. větší stabilita proteinů • c. lepší přístup k proteinům • d. účinnější převod regulačních signálů • 9. Jak pracuje mitochondriální ATP pumpa při konverzi ADP na ATP? • a. transportuje přes membránu Na+ • b. využívá molekulu cGMP • c. transportuje K+ přes membránu • d. generuje rotační pohyb při transportu H+ přes membránu • 10. napište aspoň 2 příklady molekulárních strojů: • • •