VELIKOST  OBJEKTŮ   ČASOVÁ  NÁROČNOST  FYZIKÁLNĚ-­‐CHEMICKÝCH  PROCESŮ   ČASOVÁ  NÁROČNOST  FYZIKÁLNĚ-­‐CHEMICKÝCH  PROCESŮ   ČASOVÁ  NÁROČNOST  FYZIKÁLNĚ-­‐CHEMICKÝCH  PROCESŮ   MODULACE  NÁBOJ-­‐NÁBOJOVÝCH  INTERAKCÍ:     Dielectric  constant  of  cytosol:  cca.  60  (50:50  H2O/ACN)   POUŽÍVANÁ  ČINIDLA  PŘI  PRÁCI  S  BIOMOLEKULAMI     Denaturace  –  rozrušení  3D  struktury:       a)  chemicky    (proteiny,  DNA/RNA)  –  6  –  8  M  UREA  nebo  Guanidine                                 b)  teplotou  (DNA/RNA)   POUŽÍVANÁ  ČINIDLA  PŘI  PRÁCI  S  BIOMOLEKULAMI     Simulace  redukčního  prostředí  buňky  –    relevantní  pro  proteiny     (eliminace  disulfidických  můstků  –  zabránění  vzniku  oligomerů),  DTT,  TCEP,  merkaptoethanol   Mechanismus   Mechanismus   POUŽÍVANÁ  ČINIDLA  PŘI  PRÁCI  S  BIOMOLEKULAMI     Iontové  pasp  –  dvojmocné  ionty  (EDTA  –  Ca2+,  Mg2+;  EGTA  –  Ca2+)     EDTA:  inhibice  metaloproteinů  poškozujících  DNA/RNA  (nukleázy),  proteiny  (pep@dázy)     EGTA:  ve  srovnání  s  EDTA  má  nižší  afinitu  pro  Ca2+.  Používá  se  tedy  pro  simulaci    vnitrobuněčného  prostředí,  kde  [Ca2+]  je  1000  <  [Mg2+]  –  DNA/RNA   EGTA  -­‐  ethylene  glycol  tetraace@c  acid   POUŽÍVANÁ  ČINIDLA  PŘI  PRÁCI  S  BIOMOLEKULAMI     Iontové  detergenty  –  rozvolnění  3D  struktury  proteinu  a/nebo  quanptapvní  dodaní  naboje   Cetyl  tetraamonium  bromide  CTAB  –  rozvodni  strukturu  protein  a  dodá  kladný  náboj     (CTAB  PAGE)  –  princip  analogický  to  SDS.   Sodium  dodecyl  sulfate  SDS  –  rozvodni  strukturu  protein  a  dodá  záporný  náboj     (SDS  PAGE).  SDS  It  binds  to  polypep@des  in  a  constant  weight  ra@o     of  1.4  g  SDS/g  of  polypep@de.  In  this  process,  the  intrinsic  charges  of  polypep@des  becomes     negligible  when  compared  to  the  nega@ve  charges  contributed  by  SDS.     Thus  polypep@des  aber  treatment  become  rod-­‐like  structures  possessing  a  uniform  charge     density,  that  is  same  net  nega@ve  charge  per  unit  weight.  The  electrophore@c  mobili@es    of  these  proteins  is  a  linear  func@on  of  the  logarithms  of  their  molecular  weights.     POUŽÍVANÁ  ČINIDLA  PŘI  PRÁCI  S  BIOMOLEKULAMI     Neiontové  detergenty  –  rozvolnění  3D  struktury  proteinu   POUŽÍVANÁ  ČINIDLA  PŘI  PRÁCI  S  BIOMOLEKULAMI     Proteinové  barvení  (napvní  I  denaturovaný  protein)  a  dodaní  náboje  napvnímu  proteinu   (BLUE  NATIVE  PAGE)  –  protein  migruje  uměrně  své  velikosp  a  tvaru   COOMASSIE  BLUE   PRVKY  TVOŘÍCÍ  VODÍKOVOU  VAZBU:   H,  N,  O,  F   Délka  vodíkové  vazby  cca  2.5-­‐3.0  A  (1  A  =  0.1  nm,  délka  C-­‐H  vazby  cca.  1  A)     PROTEINS   PI:  Isoelectric  point  –  hodnota  pH  při  které  čás@ce  má  nulový  náboj     (nehýbe  se  v  elektrickém  poli,  má  nejnižší  rozpustnost)   KTERÉ  AMK  OBSAHUJÍ  SÍRU:   cysteine   methionine   V  proteinové  chemii  se  často  výužívá  značení  radioak@vní  sírou  (35S)   KTERÉ  AMK  tvoří  disulfidické  vazby:   cysteine   V  buňce  je  redukující  prostředí  (=  disulfidické  vazby  jsou  rozrušeny).   Při  práci  v  roztoku  se  redukující  prostředí  zabezpečuje  přidáním     redukčních  činidel  např.  merkaptoethanol,  TCEP)