Principy vyšetření hemostázy Trombóza - Hemostáza - Krvácení Fyziologie krevního srážení • Základní homeostatický mechanizmus • Spolupůsobení různých systémů včetně regulačních zpětných vazeb – Cévní stěny – Trombocytů – Plazmatické koagulační faktory – Plazmatické inhibitory – Systém fibrinolytický Dělení testů • Testy globální – postihují celý systém (i více) • Testy skupinové (screening) – postihují určitou část koagulačního systému – umožňují odlišení poruch vnitřní a vnější cesty a přeměny fibrinogenu • Testy speciální – vyšetřují jednotlivé složky systémů Dělení testů dle principu • Koagulační • Fotometrické • Imunochemické • Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) • Sledování času rozpuštění koagula • Sledování rozpustnosti koagula • Jiné Dělení testů dle principu • Koagulační – sledování času srážení (srážlivá plná krev) • bez přídavku aktivátoru/aktivovaná doba srážení (ACT) – manuálně (kývání) – POCT (přenosné přístroje point of care) – sledování času vytvoření fibrinového vlákna • manuálně (háčkování) • koagulometr (poloautomat, automat) – mechanické » kuličkové (sledování změn pohybu kuličky) » háčkové » vibrační – optické » nefelometrie (sledování rozptylu světla) » turbidimetrie (sledování průchodnosti světla) » limitace – chylózní vzorky Kývání • Naklánění zkumavky • První metoda detekce času srážení – Vizuálně pozorujeme vznik sraženiny • Používáno například pro RČ – RČ – rekalcifikační čas (plasmy, plné krve) „Háčkování“ • První skutečně použitelná metoda • Protahujeme háček reakční směsí a pozorujeme vznik koagula • Dostatečně přesná, dostatečně citlivá „Háčkování“ • Výhody – Jednoduché a levné vybavení – Velmi zkušená laborantka je přesná • Nevýhody – Potřeba velmi zkušeného personálu – Subjektivní ovlivnění – Velký vliv koncentrace fibrinogenu – Velká spotřeba reagencií Háčkové koagulomery • Využívají vyšší vodivosti fibrinového vlákna • Dvě elektrody, alespoň jedna ve tvaru háčku • Vzniklé fibrinové vlákno vodivě spojí elektrody – zaznamená se čas Háčkové koagulometry • Výhody: – Relativně přesné – Málo citlivé na koncentraci fibrinogenu – Detekují opravdu první fibrinové vlákno • Nevýhody: – Komplikovaná jemná mechanika – Pracné čištění – Velký objem reagencií Koagulometry vibrační • Princip – v kyvetě umístěn vibrující plátek s elektromagnetickou detekcí – Při tvorbě fibrinu dochází ke zvýšení viskozity a zpomalení vibrace kovového plátku – Vyhodnocení změny frekvence vibrací se současným zastavením ukazatele času • Výhody – poměrně citlivý, není prakticky citlivý na koncentraci fibrinogenu • Nevýhody – obtížná manipulace s vibr. plátky a možnost kontaminace vzorku Koagulometry kuličkové • Kuličkové • Měří se změna viskozity – Viskozita reakční směsi ovlivňuje pohyb detektoru • Detektor je kulička • Po startu mají mrtvý čas – Nutné k nastavení přístroje pro příslušný vzorek Viskozitní koagulometry • Citlivost – Je nepřímo úměrná momentu hybnosti detektoru p = m * v (m=hmotnost,v=rychlost) • Přesnost – Je přímo úměrná frekvenci pohybu detektoru • Frekvence pohybu je úměrná rychlosti • Zvýšení citlivosti-snížení momentu hybnosti detektoru – Snížení hmotnosti • Má limity, příliš nízká hmotnost detektoru znamená větší možnost rušení – Snížit rychlost • Menší rychlost znamená menší přesnost Kuličkové koagulometry • Detektorem je kovová kulička – Většinou ocelová – Někdy se specifickým potahem na povrchu • Riziko zmagnetizování kuliček – Nereprodukovatelné výsledky Koagulometry Amelung • Rotující kyveta s kuličkou • Magnetický senzor • Poměrně velká kulička • Poměrně pomalý pohyb • První masově rozšířený koagulometr Koagulometry Amelung • Výhody – Kulička prochází většinou objemu • Nevýhody – Velký objem reagencí – Nižší citlivost Koagulometry Benck CL • Kuličkový koagulometr • Malá kulička, rychlá rotace • Optický senzor • Měří změnu frekvence průchodů kuličky před detektorem f t f t f t Koagulometry Benck CL • Výhody – Malý objem reagencíí – Průměrná citlivost • Nevýhody – Problémy se vzorky s dlouhým nebo velmi krátkým koagulačním časem • Kulička tuneluje Koagulometry Stago • Kuličkový koagulometr • Malá kulička, kývavý pohyb • Elektromagnetický senzor • Měří změnu frekvence a amplitudy kuličky • Zpomalení, zastavení pohybu kuličky je detekováno jako koagulační čas Koagulometry Stago • Výhody – kývavý pohyb kuličky – mění se rychlost • v úvratích má kulička nulovou rychlost • velice vysoká citlivost • měření fibrinogenu od 0,2 g/l – chylózní, ikterické, hemolytické vzorky • Nevýhody – velký objem reagencií pro fotometrické testy z důvodu přítomnosti kuličky Optické koagulometry • Měří vznik zákalu nikoli přímo koagula – Problém vyhodnocení naměřené reakční křivky – Různí výrobci mají rozdílné řešení • Určení rozdílu před a po koagulaci (Siemens) • Derivace koagulační křivky (Organon) • Určení počáteční rychlosti (např. ACL) Optické koagulometry • Citlivé na rychlost tvorby koagula – nízký fibrinogen – přítomnost inhibitorů (heparin) • Citlivé na zabarvení plasmy – ikterická plasma – chylózní plasma – hemolytická plasma A t A t A t A t Derivace A t Rozdíl A t Rozdíl A t Rozdíl 50 % A t Rozdíl 50 % A t Rozdíl 50 % A t Rozdíl A t Derivace Rozdíl a Derivace • Není problém u normálních vzorků • U pomalu koagulujících vzorků významně prodlužují koagulační časy A t Počáteční rychlost A t Počáteční rychlost A t Počáteční rychlost Počáteční rychlost • Není problém u normálních vzorků • Pomalu koagulující vzorky významné zkrácení času Optické koagulometry • Výhody – Jednodušší konstrukce – Snadná implementace do automatů • Nevýhody – Nelze analyzovat zabarvené vzorky – Problémy při pomalém vzniku koagula – Nutno udržovat optiku v perfektní čistotě Dělení testů dle principu • Fotometrické – sledování změn zbarvení v důsledku štěpení specifického chromogenního substrátu - detekce absorbance (A) • end point“ (A) • kinetické (A/min) – limitace -hemolytické a ikterické vzorky • Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) – sledování změn zakalení • detekce změn transmise (propustnosti T) • detekce změn absorbance – limitace- chylózní vzorky Chromogeny • Chromogenní substrát – uměle připravený NO3NHArg bezbarvý paranitroanilid velkoobjemová koncovka aminokyselinové raménko zakončené Argininem Chromogeny • Princip – enzymy štěpí substrát – vzniká žluté zbarvení – měříme při 405 nm NO3NH2 Arg NO3NH paranitroanilin Kinetické měření čas měření (min) A 405 nm 1 min  A/min Dělení testů dle principu • Imunochemické – sledování reakce antigenu s protilátkou • aglutinace • LIA • ELISA • EID Aglutinační metody • sledování aglutinace viditelných částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigenu • odečítání makroskopicky – pozitivní( +, ++, +++)/negativní – semikvantitativní metody (udaná mez detekce) • metody – latexaglutinační (např. FDP, D-Di) – hemaglutinační (např. FM) Antigen Latex + Příklad vyšetření D-Dimerů – semikvantitativní výsledek Mez detekce = 0,5 mg/l Neředěný vzorek Vzorek ředěný 1:6 Výsledek aglutinace - - < 0,5 mg/l aglutinace + > 0,5 mg/l a < 3,0 mg/l aglutinace + + > 3,0 mg/l Liquid immunoassay - LIA metody • sledování aglutinace mikrolatexových částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigenu • odečítání optickým systémem koagulometru – Změna zakalení (A/min) • kvantitativní metody (např. D-Di, vWF:Ag…) • Limitace – Chylozita vzorku – Hookův jev (vysycení protilátky antigenem) LIA testy • Provedení (STA© Liatest© D-Dimer) 100 ml pufru 50 ml vzorku inkubace 240 s 150 ml latexového činidla měříme změnu absorbance mezi 12 s – 140 s LIA testy • Kalibrace – Sigmoidní – Křivka 3. řádu – Minimálně 5 bodů – Platí pro celou šarži 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0 2 4 6 A mg/l LIA kalibrace ELISA metody • Stanovení antigenu(Ag)pomocí protilátky (Ab) značené enzymem (AbE) - kvantitativní – inkubace vzorku v mikrotitračních jamkách s navázanou Ab proti vyš. Ag - vazba Ag na Ab – odsátí vzorku + promytí – inkubace AbE v jamkách - vazba na Ag – odsátí AbE a promytí – detekce enzymatické aktivity komplexu Ab-Ag -AbE po přídavku chromogenního substrátu + + Elektroimunodifúze - EID metody • vyšetřovaný antigen reaguje s protilátkou přítomnou v agarózovém gelu při elektroforéze za vzniku precipitačního píku • délka píku je přímo úměrná koncentraci antigenu • kvantitativní metoda Princip EID kalibrace vzorky pacientů Vyšetření plazmatických proteinů • Vyšetření funkční aktivity – koagulační metody – fotometrické metody • Vyšetření antigenu – imunochemické metody – umožňují odlišení defektů • kvalitativních • kvantitativních