Mechanismy regulace genové exprese na epigenetické úrovni Vývojová genetika 2022 Rozdílnost jednobuněčných dvojčat – mechanismus? • Jednobuněčná dvojčata vznikají během ranného vývoje embrya (jeho rozdělením), jsou tvořeny tedy stejným genetickým materiálem (spermie i vajíčko) • Často rozdíly ve vzhledu a vlastnostech (např. 30% výšky) • Jak? Genotyp x Fenotyp? • Proč? Prostředí? • Conrad Waddington, 1942 – epigenetika (asimilace, krajinný model), vznik fenotypu(ů) na základě jednoho genotypu • Robin Holliday, 1990 – časová a prostorová kontrola genové aktivity během vývoje komplexního organismu Modely ke studiu epigenetických jevů Epigenetická kontrola chromatinu Genové umlčování Epigenetické obranné mechanismy Meiotické umlčování RNAi DNA a histonová methylace Chromatin v somatických a generativních buňkách Imprinting Paramutace TE genové umlčování RNAi DNA a histonové epigenetické regulace Epigenetická regulace zárodečné linie Poziční efekt (PEV) Polycomb Umlčení X chromozomů Epigenetická informace jako „epigenetický“ krajinný model DNA methylace Buněčná diferenciace Genově specifická exprese Gregor Mendel (1822-1884) EPIGENETICKÉ JEVY PŘEDSTAVUJÍ VÝJIMKY Z MENDELOVÝCH ZÁKONŮ • Samostatnost alel. Genotyp je soubor samostatných genů určujících znaky. Každý je znak je určen dvojicí samostatných alel. • Segregace alel. Princip NEZÁVISLÉ SEGREGACE ALEL : dvojice samostatných alel se při meióze rozcházejí a každá gameta dostává jednu z obou alel • Nezávislá kombinace alel. (s výjimkou alel ve vazbě) • IDENTITA RECIPROKÝCH KŘÍŽENÍ. (při vzájemném křížení homozygotních rodičů (P) vzniká první filiální generace (F1) potomků, kteří jsou genotypově i fenotypově jednotní. • Zákon o štěpení v potomstvu hybridů. Gregor Mendel (1822-1884) EPIGENETICKÉ JEVY PŘEDSTAVUJÍ VÝJIMKY Z MENDELOVÝCH ZÁKONŮ Alely se mohou podrobovat vzájemným interakcím, které mají za následek dědičnou změnu jejich exprese : PARAMUTACE, TRANSVEKCE Některé genomy, chromosomy či lokusy jsou v průběhu gametogeneze sex-specificky reverzibilně modifikovány, což vede k jejich umlčení ve filiální generaci : PARENTÁLNÍ IMPRINTING Paramutace a její funkce Paramutagenní alela – umlčená alela, která je schopna ovlivnit (umlčet) druhou alelu Paramutabilní alela – alela, která je exprimována Paramutace a její demonstrace u různých modelových organismů Akumulace anthocyaninu v obilce kukuřice v případě r1 lokusu (paramutabilní R-r a paramutagenní R-st) v případě celé rostliny lokusu b1 (paramutabilní B-I a paramutagenní B´) Sulf lokus způsobující nedostatek chlorofylu (paramutabilní + a paramutagenní sulf) Kit lokus (tyrosine kináza receptor) – paramutabilní + a paramutegenní Kittm1Alf nebo Pilu 2011 Transvekce – funkce a definice • Edward Butts Lewis • získal Nobelovu cena 1995 za práci na modelu Drosophila a objevení transvekce na bithorax komplexu "Operationally, transvection is occurring if the phenotype of a given genotype can be altered solely by disruption of somatic (or meiotic) pairing. Such disruption can generally be accomplished by introduction of a heterozygous rearrangement that disrupts pairing in the relevant region but has no position effect of its own on the phenotype" • Popsána u lidí, myší, rostlin, nematod, hmyzu a hub Viets et al. 2019 Trasnvekce – molekulární mechanismus Viets et al. 2019 DNA methylace Methylace DNA • CH3 skupiny jsou umístěny na velké jamce dsDNA • Proteiny jako transkripční faktory, které se mohou vázat na DNA mají často kontakt právě ve velké jamce DNA Prokhortchouk a Defossez 2008 Mechanismus DNA methylace – de novo methylace a udržovací methylace Chen et al. 2005 De novo methylace, u živočichů DNMT3a Udržovací methylace, DNMT1 Přímý vztah mezi metabolismem a DNA methylací (metabolom x epigenom) • SAM je prekurzor všech epigenetických modifikací vyžadující methylovou skupinu • DNA methylace • Methylace lysinových residuí • Methylace argininových residuí SAM cyklus – cyklus produkující, „konzumující“ a regenerující SAM molekuly Folátový cyklus – produkce vitamínu B, regenerace DNA a genetického materiálu Důkaz vztahu mezi DNA methylací a metabolismem – Agouti Specifita DNA methyltransferáz – divergence rostlin a živočichů • DOMAINS REARRANGED METHYL TRANSFERASE (DRM) – methylace CHH • METHYLTRANSFERASE 1 (MET) – methylace CG • CHROMOMETHYLASE (CMT) – methylace CG • DNA methyl transferase (DNMT) – methylace CG(?) Chen et al. 2005 =Specifická pouze pro rostliny Methylace cytosinu se liší u eukaryotických genomů Nedetekovatelná 5mC methylace, výskyt 6mA Nedetekovatelná 5mC methylace, výskyt na cytosinu 38 tRNA-Asp a tRNA-Glu Ortholog TET enzymů, pouze malé procento genomu (0.01%) Evoluce DNA methyltransferáz u rostlin a živočichů Ueda 2020 Yaari et al. 2019 Plavuně KapraďorostyMechorosty • Komplexita 5mC regulace a epxrese se liší mezi vyššími a nižšími rostlinami • Ztráta DNMT3 a duplikace CMT a DRM genů pro CG methylaci Rozdíly DNA methylace koreluje se strukturou genomů a jejich velikostí • CpG ostrůvky – většinou nemethylovány (u rostlin v malé míře) • Mezigenové oblasti – většinou methylovány • Repetitivní oblasti – většinou methylovány Množství repetic Genomově specifická methylace (např. X inaktivace) Udržení genomové integrity • Dnmt1 linie vykazují vysokou genomovou instabilitu • Umlčení nejenom repetitivních elementů, ale i kryptických promotorů a alternativních míst sestřihu • Mutace v místě repetic (meC = T) jako prevence transpozice • Umlčení repetic a jejich transkripční interference • Potlačení ilegitimní rekombinace „Genome defense model“ – DNA methylace je mutagenní, proto musí mít pozitivní vliv na stabilitu (prof. Timothy Bestro) DNA methylace se liší mezi geny a transpozony Rozdíly DNA methylace koreluje se strukturou genomů a jejich velikostí • S větší procentem repetitivní DNA roste úměrně množství inaktivního chromatinu (dříve fakultativní heterochromatin) a tím se mění i chromozomální distribuce epigenetických značek Umlčení repetic = stabilita genomu a potlačení škodlivých inzercí DNA demethylace (TET – methylcytosin dioxygenáza) • Pasivní DNA demethylace • Rozvolnění „hustoty“ methylace s každým buněčným dělením (nizká aktivita DNMT1) • Aktivní DNA demethylace • -C-C vazba je velmi silná, odstranění přes intermediáty, používající různé systémy (TET enzymy – rodina 10 enzymů) • Především ve vyvíjejících se embryích a zárodečných buňkách, rakovinné buňky, mozkové buňky • 5hmC • 5fC (→BER) • 5caC (→BER) • U rostlin MEDEA, ROS1 (TET orthology prozatím neposány, ALE! Modifikace se v genomu vyskytují-jiné enzymatické dráhy?) BER – „base excision repeair“ TDG – „thymine DNA glycosylase“ AID – „activation induced deaminase“ nebo APOBEC (5mC → T+thymine glycosylase MB4 → BER) Hydroxylace oxidace oxidace An et al. 2017 Proč je DNA methylace dědičná? • DNA methylace je dědičná, protože DNMT1 rozpoznává hemi-methylovanou DNA na obou řetězcích • TET enzymy jsou specificky demethylovány pouze během specifického období během vývoje Aktivní methylace x aktivní demethylace Úloha DNA methylace ve významných procesech a rozdílná úloha v podobných orgánech u rostlin Tang et al. 2020 X inaktivace jako příklad mitotické dědičnosti DNA methylace • X inaktivace je epigenetický mechanismus dávkové kompenzace u savců (samci a i samice mají stejnou dávku genové exprese X chromozomu) • Během vývoje dochází k náhodné X inaktivaci v období gastrulace v embryu, tento jev je posléze předáván do dceřiných buněk The Walter and Elizabeth Hall Institute of Medical Research Výskyt a diverzita malých RNA Waititu et al. 2020 Klíčové momenty RNAi a genového umlčování • Prekurzor - dsRNA • Štěpení proteinovým komplexem DICER nebo DICER-like • Sestavení RISC komplexu, vazba sRNA ARGONAUTE proteiny • Vazba RISC na základě homologie • Umlčení Carthew, Sontheimer 2009 RISC komplex • PAZ • PIWI • AGO • sRNA Původ a rozdíl siRNA vs. miRNA • siRNA • Deriváty nezávislé na genomu (obsaženy vzácně)mRNA, transponovatelné elementy, viry • Vznik z dlouhých molekul RNA a jejich prodloužených sekund. RNA struktur • Nespecifická produkce siRNA molekul (nespecifický prekurzor) • Konzervativní oblasti poměrně vzácné, siRNA „autosilecing“ efekt • miRNA • Deriváty genomické RNA (obsaženy v genomu) • Vznik z lokálních transkribovaných sekund. RNA struktur (vlásenka) • Syntéza miRNA:miRNA duplexů • Konzervativní genové oblasti příbuzných organismů • miRNA „hetero-silencing“ efekt Biogeneze miRNA • Autonomní miRNA zahrnují ve svých produktech elementy potřebné pro regulaci a iniciaci transkripce • Ostatní miRNA jsou závislé na svých pri-mRNA, u kterých probíhá „parazitický“ proces • Syntézy nových krátkých úseků katalyzovány RNA polymerázou II a III • Většina miRNA katalyzovaných pol RNA II a rovněž většina živočišných miRNA nemá typický signál pro polyadenylaci Základní rozdíl syntézy miRNA u rostlin a živočichů Bartel 2004 Diverzita funkce sRNA Bartel 2004 RostlinyŽivočichové • Funkce v různých vývojových procesech, „micromanagement“ exprese Specifikace exprese miRNA • Různé hladiny regulace genové exprese miRNA zajišťující dokonalý systém kontroly denovo vzniklých transkripčních jednotek • Zavislá na druhu buňky, momentální úlohy a vývojového stádia • Počet jednotlivých miRNA v daném stavu buňky ovlivněn mírou exprese daného lokusu a tvorby pri-/pre-mRNA (50 000 molekul miR-2, miR-52 x 800 molekul miR-124) • Vysoká x nízká úroveň exprese na počet buněk (vysoká exprese důsledkem specializace pouze několika málo buněk, nízká produkce na úrovni např. celého organismu) Molekulární mechanismus funkce RISC - dvě cesty regulace genové exprese • Na úrovni mRNA – RISC komplex a štěpení RNA nebo regulace na úrovni translace (neúplná komplementarita) • Na úrovni DNA – methylace DNA, inaktivace chromatinu Bartel 2004 mRNA specifické štěpení regulace na úrovni translace vazba na DNA (methylace) Histonové modifikace Chromatin a DNA - struktura • DNA+histony (H2A, H2B, H3, H4)= chromatin • Chromatin umožňuje svinutí DNA do jádra • Vyšší organizace chromatinu ovlivňuje regulaci genové exprese a přístupnost transkripčních nebo DNA reparačních proteinů DNA Histonový oktamer N-aminokyselinový konec Vyšší organizace chromatinu Vyšší organizace chromozomu záleží kromě dalších faktorů na kontaktech H1 ? Struktura chromatinu ovlivňuje transckripci • Více sbalený chromatin – DNA je méně přístupná transkripčním faktorům • Volný chromatin – DNA je dostupná pro transkripční faktory = genová exprese Transkripční faktory Chromatin Heterochromatin vs. euchromatin • Euchromatin – otevřený, méně kondenzovaný • Heterochromatin – kondenzovaný, nízká nebo žádná genová exprese • Fakultativní – liší se na typu buňky nebo časové organizace (X inaktivace, specifické geny aj.) • Konstitutivní – kondenzovaný chromatin ve všech buňkách • Centromery, telomery, část Y chromozomu • Genové umlčování, udržení integrity genomu (5mC, represivní histonové modifikace) • Centromery, telomery, část Y chromozomu →Nedostatečná nomenklatura z hlediska epigenetiky a významu jednotlivých modifikací! Synapse epigenetických modifikací a organizace chromatinu • Thomas a Christoph Cremer – 2020 „ functional nuclear organization depends on still unexplored movements of genes and regulatory sequences between ANC and INC“ Cremer et al. 2020 ANC – aktivní jaderné komponenty INC – inaktivní jaderné komponenty Vztah mezi organizací chromatinu a epigenetickými modifikacemi • 3D rekonstrukce DAPI barvených jader a intezita ve vztahu k aktivním a represivním modifikacím Cremer et al. 2020 Úloha histonových modifikací • Většina modifikací na Nterminálních koncích • Více než 50 AA může být modifikováno, více než jedním typem modifikace (me1/me2/me3) • Převážně H3, H4 (nejvíce prostudovány), méně H2A a H2B • Kombinace umocněny kombinatoriální komplexitou = histonový kόd The Walter and Elizabeth Hall Institute of Medical Research Histonové modifikace tvoří významnou část genové regulační dráhy Ueada and Seki 2020 Druhově specifická funkce a distribuce a Histone (lysine) methylation H3K4me • aktivní modifikace • Promotorová oblast a exony H3K9me • Inaktivující modifikace • v genových oblastech nebo konstitutivní heterochromatin H3K27me • Inaktivující modifikace, • V genových oblastech nebo konstitutivní heterochromatin • H3K27me3 důležitá pro regulace vývojových genů u rostlin i živočichů Methylace H3 závisí na velikosti genomu a druhové diverzitě H3K4me =všechny kombinace mají u rostlin i živočichů většinově aktivující charakter H3K9me1, H3K9me2, H3K27me1 =značky inaktivního chromatinu H3K27me2/me3 =druhově specifické, spíše inaktivující charakter •Velikost genomu>500 Mb vede ke změně distribuce aktivních a represivních modifikací! hetrochromatin euchromatin Small genome plant Large genome plant H3K9me H3K4me Houban et. al. 2003 1C=290 Mbp 1C=16 6640 Mbp 1C=515Mbp 1C=490 Mbp Cardamine amara Triticum aestivum Ricinus communis Orzya sativa Acetylace lysinových reziduí • Koreluje spíše s genovou aktivitou (např. H3K9ac) • Redukuje pozitivní náboj histonových aminokyselin = DNA je více dostupná pro další enzymy • Spekulativní jako epigenetická modifikace, spíše chromatinová modifikace • Některé ac-skupiny postrádají mitotickou dědičnost, závislé na např. na cirkadiánní rytmu • Velice proměnlivé Fosforylace serinu, threoninu a tyrosinu • Nejvíce prostudovaná modifikace, z hlediska centromer • V závislosti na umístění=rozličná funkce • Závislá na buněčné cyklu, důležitá pro kondenzaci chromatinu • H3S10ph(+H3S28ph) • V oblasti pericentromer (opak u živočichů - H3T3ph and H3T11ph) • H3At108(120)ph • Vnitřní část centromery Neumann et. al. 2016 Fuchs et. al. 2012 Diverzita histonových modifikací a jejich funkce Molekulární evidence kombinatoriální komplexity Nízká exprese Vysoká exprese Nízký afinita Vysoká afinita Nízký afinitaVysoká afinita Nízká exprese Vysoká exprese A - H3K4me3 B - H3K16Ac B - H3S10phA - H3K9me3 BPTF („Nucleosomeremodeling factor subunit“) HP1 (heterochromatin protein, důležitý pro vazbu DNMT1) U Arabidopsis, CMT3 (CHH methylace) se preferenčně váže k dimeru H3K9me3H3K27m3. Rando 2012 Histon-rozpoznávající domény histonmethylace, -acetylace a -fosforylace • Příklady proteinů obsahující chromodoménu • CHD1 – ATP-chromatinový remodeler • HP1 – protein typický pro inaktivní heterochromatin, vazba DNMT1 • CBX2 – část PrC proteinu, ubiquitinace H2AK119 Histon-rozpoznávající domény pro např. H3-K4Me, K9-Ac, S10ph Neznámá hierarchie jednotlivých faktorů • HP1 vazba na H3K9me3 • HP1 vazba s DNMT • HP1 vazba HMT a šíření H3K9me3 • DNMT může vázat HDAC =není jasné, které elementy jsou na vyšší regulační úrovni Histonové modifikace jsou odlišně distribuovány mezi geny a TEs Lippamn et al. 2004 Distribuce histonových modifikací v genových oblastech • H3K27me3 – modifikace typická pro genovou inaktivitu (vývojové důležité geny) • H3K4me2/me3 a H3K9ac – značky typické pro genovou expresi a aktivitu (promotor) • H3K36me3 – značka typická pro genovou expresi (exony) Bart et al. 2010 Diverzita histonových variant a změna struktury chromatinu • Různé varianty H2A, H3, H4 • Každá varianta obsahuje specifické AA, měnící jejich funkci • Zvýšená stabilita • Výskyt AA, které mohou být modifikovány • Úloha v reparačních mechanismech, funkce centromer Euchromatin vs. Heterochromatin vs. centromere Rozdíl genů a repetic Identita centromery a její funkce • Pro většinu eukaryotických genomů je centromera definována chromatinovými a epigenetickými značkami • Aktivita centromery definována zejména H3-specifickou variantou (CENH3, Cse4, CENP-A) • Historicky definována jako konstitutivní heterochromatin, dnes zejména aktivní a represivní modifikace s jasnou hierarchií =centromerické satelity částečně nutné pro vazbu histonové varianty, druhově specifická DNA sekvence (speciace?) Funkční diferenciace centromerické histonové varianty AA konzervovaná doménaAA-specific CENH3 N-konec • Největší variability centromerického histonu v AA N-terminálním konci S. latifolia H. lupulus Epigenetika a neurogeneze • Determinující faktory jsou regulovány mozaikou epigenetických modifikací • Methylace genu před promotorem (Dlx2) chrání gen před PcG umlčování, • Úloha TrxG přes bivalentní methylací H3K4me3K27me3, odstranění H3K27me3 aktivuje genovou oblast Lomvardas et al. 2016 Epigenetika a neurogeneze • meCpG se vyskytují na „house-keeping“ genech v neurogenních buňkách, během ranného vývoje jsou umlčeny H3K4me3K27me3 • Neurogenní geny umlčeny během determinace přes inaktivující modifikace (H3K9me) • Neuronální geny uvolněny v pozdním vývoji nebo finální determinaci (geny nutné pro finální funkci-odstranění H3K27me3 x H3K4me3 zůstává a aktivuje) • ESC nemají meCpG v promotorech, aktivní faktory během ranného vývoje, umlčeny během determinace Lomvardas et al. 2016 Úloha histonové varianty H2be při dozrávání feromon-detekujících chemoreceptorů • Olfaktorické neurony jsou smyslové buňky v nose vnímající pachy a čich (v membráně neuronů jsou čichové receptory citlivé na pachy)-umístěné v olfaktorickém epitheliu v čichové sliznici • H2be se liší 5 AA od H2b (není methylován/acetylován na K5) • Aktivace neuoronů vede ke snížení exprese H2be a prodlužuje životnost (aktivované buňky mají nízkou hladinu exprese této histonové varianty) • H2be mimo jiné aktivuje apoptózu a tedy determinuje životnost neuronů Lomvardas et al. 2016 Děkuji za pozornost!