Epigenetika 16 Úloha epigenetiky v lidských chorobách Metody Obsah • ÚLOHA EPIGENETIKY V LIDSKÝCH CHOROBÁCH • METODY Hlavní epigenetické mechanismy odpovědné za chromatin-asociované vývojové poruchy • Narušení DNA methylace nebo chromatinu na imprintovaných lokusech • Ztráta chromatin-regulujících faktorů vede ke změně struktury chromatinu a změně exprese • Změna DNA a změna chromatinu jako zdroj variabilní exprese Monoalelická exprese Změna DNA a/nebo chromatinu=změna exprese MeCP2 – vazba na meCpG, represor i aktivátor Opakování maternální/paternální (UDP) alelické disomie Zoghbi et al. 2016 2x vyšší exprese pouze jedné alelyKaždá alela je exprimována pouze jednou! • Bi-alelická exprese je důsledkem správného maternálního a paternálního imprintingu Prader-Willi a Angelman syndrom • Oba syndromy mohou být způsobeny delecí části lokusu, změnou chromatinu nebo kombinací genetiky a epigenetiky Zoghbi et al. 2016 Prader-Willi a Angelman syndrom Monoalelická paternální expreseMonoalelická maternální exprese Zoghbi et al. 2016 Přehled chorob související s imprintingem Přehled chorob související se změnou chromatinu in trans Vals et al. 2014 Přehled chorob související se změnou chromatinu in cis Syndrom fragilního X (Martin-Bell syndrom) • normální X má 6-60 tripletů CGG v 5'UTR genu FMR1 (CGG)10AGG(CGG)9AGG(CGG)9 • muži-přenašeči nesou premutaci mezi 60 and 200 kopiemi • M-B pacienti mají přes 200 kopií repetice C Zoghbi et al. 2016 Facioscapulohumeral dystrophy (FSHD) • Změna počtu repetic D4Z4 vede k zpřístupnění lokusu pro chromatin-remodelující faktory, změna na aktivní chromatin a expresi genů s myopathickým potenciálem Zoghbi et al. 2016 Úloha epigenetické regulace v nádorovém bujení • DNA methylace • Histonové modifikace • „Writers“ • „Readers“ • Histonové varianty • Histon-remodelující komplexy • RNA-interference Baylin et al. 2016 Chromatinové změny při nádorovém bujení • Změna chromatinu zahrnuje hypomethylaci a hypermethylace specifických genů, vazba histone-modifikujících enzymů navozujících in/aktivovaný stav • Změna chromatinu je vidět po barvení hematoxylinu-rakovinné buňky mají větší jádra a více granulovaná Baylin et al. 2016 Úloha DNA methylace v nádorovém bujení • Hypomethylace onkogenaktivujících genů • Hypermethylace tumorsupresujících genů • Mutageneze • C-T tranzice • Vyšší vazba meCpG pro karcinogeny • meCpG UV mutageneze Baylin et al. 2016 Úloha DNA methylace v nádorovém bujení a progrese kolorektálního karcinomu Baylin et al. 2016 Příklad povolených léčiv - chemoterapie Zoghbi et al. 2016 Inhibice DNA methyltransfáraz (vazba na DNA) Inhibice HDAT • Vliv chemoterapeutik na globální úrovni • Aktivně proliferující buňky akumulují více látek nebo lokálně dodávané Obsah • ÚLOHA EPIGENETIKY V LIDSKÝCH CHOROBÁCH • METODY Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika Bisulfitové sekvenování • Působení hydrogensiřičitanu na cytosin=konverze na U (methylované C zůstávájí stejné) • Nutné porovnání proti referenční sekvenci, kterou analyzujeme • Pro detekci ostatních modifikací (hmC, caC, fC) jsou nutné specifické reakce-konvenční bisulfitové sekvenování nerozlišuje mC a hmC a caC/fC od nemethylovaného C Výstup bisulfitového sekvenování Vytváření methylomových map MSAP • Pre-selektivní PCR amplifikace • Ligace se specifickými primery • Selektivní PCR amplifikace • Amplifikace specifických produktů • PCR produkt screening • PAA nebo kapilárová elektroforéza • Výsledek • Získání DNA methylace analyzovaných vzorků MSAP+NGS technologie • Identifikace regionů s odlišnou methylací (DMRs) • Nutnost specifických softwarů • Po specifické PCR-preamplifikaci • Tvorba NGS knihovny • Sekvenování • Analýza produktů Methyl-sensitivní PCR Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika BSA, případný enzymatický treatment Příprava vzorku Fixace Permeabilizace membrány Blokace aj. Inkubace protilátky Vizualizace Pletivo/tkáň, buněčné útvary aj. PFAM, Glutaraldehyd, EtOH… Detergent Monoklonální vs. polyklonální Mikroskopie Princip imunolokalizace Přímé a nepřímé barvení Monoklonální protilátky • Ve srovnání s pAbs draší • Rozpoznají jeden epitop (váže se na specifické místo) • Tvořeno jednou protilátkou Polyklonální protilátky • Levné pro produkci • Mix různých protilátek • Váží se na různé oblasti jedné molekuly • Tolerantní na malé změny v epitopu cílené molekuly Bártová et al. 2019 Chip-seq analýza Nakato et al. 2014 Koncentrační řada pro Mnasové štěpení Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika ATAC-seq („assay for transposase-accessible chromatin“ • Nukleozomové mapování • Vazba transkripčních faktorů • Detekce faktorů související s nemocemi • Komparativní epigenomika • Regulace buněčné specifikace gDNA je exponována vysoce aktivní transposáze → fragmentace DNA v otevřených oblastech → tagování se sekvenčními primery Illumina official website MNase-seq („micrococcal nuclease digestion“) Wikipedia commons Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika Chemická genetika • Aplikace chemických látek pro studium fenotypu nebo genové regulační dráhy • Chemická epigenetika neinterferuje s DNA (ne primárně) Kawasumi 2007 Chemické látky ovlivňující DNA Liu 2014 Chemické látky ovlivňující chromatin a DNA methylaci Liu 2014 Momme – kombinace chemické genetiky a NGS metod Momme – hledání genů odpovědných za epigenetické reprogramování ENU • vysoce toxický mutagen působící 1 mutaci/700 různých oblastí • Účinky hlavně ve spermatocytech Momme – genetické mapování kauzálních mutací • Mutantní potomstvo s různou úrovní transgenní exprese je použito pro genetické mapování • Bodová mutace je analyzována pomocí exomového čtení (myší DNA exonové sekvence jako proby pro odhalení lokusu v kombinaci s NGS) Blewitt et al. 2013 Výsledek Momme mutantní linie Seznam kandidátních mutací Wild-type varianty jsou aktivující Wild-type varianty jsou represivní Doporučená literatura/online kurzy Dostupné kurzy pro začínající vědce • ACADEMIC WRITING SKILLS • January to March 2022 • 2-hour seminars, 6 seminars total, intervals 2 weeks • On-line using ZOOM platform, the host: Premedix Academy • BIOMEDICAL RESEARCH COURSE • January to March 2022 • On-line using ZOOM platform, the host: Premedix Academy 50 euro: if paid by the participant 100 euro: if paid by the university, research institute or hospital 150 euro: if paid by a company/ sponsor prof. Eric Leo Eisenstein IRIS 2020 Dostupné kurzy pro začínající vědce • Kurzy se liší náročností, délkou-cena dle kurzu Děkuji za pozornost!