Protokol 1 Model HeLa 8 Fucci cells – měření a analýza buněčného cyklu pomocí fluorescenčních proteinů Cíl - cílem experimentu je seznámit se s modelovou buněčnou linií HeLa 8 Fucci, která umožňuje analýzu buněčného cyklu na živých buňkách bez potřeby fixace a značení - měření proběhne na přístroji BD FACS Verse - ukázka vyhodnocení dat bude provedena pomocí programu FlowJo - analýza buněk na konfokálním mikroskopu po ovlivnění různými látkami Teorie Buněčná linie HeLa 8 Fucci - buněčná linie HeLa – lidská permanentní buněčná linie odvozená z karcinomu děložního čípku - nejstarší a jedna z nejčastěji používaných lidských buněčných linií - Fucci próba (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) – umožňuje vizualizovat progresi buněčného cyklu u živých buněk - buňky s Fucci ve fázi G1 emitují červené světlo, ve fázi S/G2/M zelené světlo - více – viz pdf. souboru uložené ve studijních materiálech (Sakaue-Sawano et al., 2008; viz studijní materiály) 1) ANALÝZA NA PRŮTOKOVÉM CYTOMETRU Materiál - připravená buněčná line HeLa 8 Fucci - roztok PBS+EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová). EDTA je chelatační činidlo, které mimo jiné vychytává Ca^2+ ionty, čímž rozrušuje mezibuněčné spoje - trypsin - pankreatický enzym (serinová proteáza), štěpí amidové a esterové vazby argininu a lysinu. Působení trypsinu uvolňuje adherentní buňky od kultivačního povrchu - nesterilní médium se sérem – inaktivace trypsinu - PBS – oplach buněčné suspenze Postup: Sběr a příprava vzorků - odsát médium z buněk - přidat 2 ml PBS+EDTA – 1-2 minuty nechat působit - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – nechat inkubovat v termostatu (37^oC) dokud se buňky neuvolní (cca 1-2 minuty) - přidat 2,5 ml média se sérem (inaktivace trypsinu) - misku opláchnout 1 ml PBS, přenést do zkumavky k buněčné suspenzi - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat v 1 ml PBS - stočit 200g 5 min - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat v 300 ml PBS a měřit Výsledky Popište postup měření buněčného cyklu u této linie + přiložte výsledky měření získané vyhodnocením v programu FlowJo 2) ANALÝZA NA KONFOKÁLNÍM MIKROSKOPU Postup: den 1: Výsev buněk HeLa 8 Fucci na mikroskopickou analýzu den 2: Ovlivnění látkami MLN-4924 (zásobní koncentrace 10 mM, výsledná koncentrace 1 µM) TRAIL (100 ug/ml zásobní koncentrace, 50 ng/ml výsledná koncentrace) Mitomycin (zásobní koncentrace 1 mg/ml, výsledná koncentrace 1 µg/ml) Doplňte poznámky k látkám TRAIL a Mitomycin (co to je za látky, co způsobují a k čemu se používají), viz poznámky u MLN-4924 v protokolu č. 2) Dopočtěte množství látek, které se bude k buňkám přidávat (V celk.= 300uL) den 3: Analýza buněk na mikroskopu Popište postup analýzy na mikroskopu a změny, které jste pozorovali u buněk ovlivněných látkami Protokol 2 Detekce proliferace, buněčného cyklu a buněčné životnosti po ovlivnění buněk DU-145 inhibitorem neddylace Cíle - cílem experimentu je ovlivnit buněčnou linii DU-145 inhibitorem neddylace (MLN-4924 – 0,11uM) a vyšetřit účinky jeho působení - působení MLN-4924 po dobu 24 hodin vede k deregulaci buněčného cyklu - měření proběhne na přístroji Attune Flow Cytometer Teorie MLN-4924 * ATP kompetitivní inhibitor * I. fáze klinického testování pro lymfom, mnohočetný myelom, AML, ALL, melanom a další nehematologické nádory * Tvoří velmi stabilní adukt mezi NEDD8 a MLN-4924 vede k zastavení dráhy neddylace (viz obrázek). Dráha nedylace je nezbytná pro aktivitu ubikvitin ligázy Skp2^SCF, která se účastní regulace různých buněčných pochodů. Mezi její významné substráty patří proteiny řídící procesy, jako jsou buněčný cyklus (p27^Kip1, p21^cip1), buněčné replikace (Cdt1) a další. Figure 1: Struktura inhibitoru MLN-4924. (Soucy et al., 2009 Nature) Figure 2: Schema blokování neddylace a proliferace inhibitorem MLN-4924. (Wenjuan Zhang et. al., 2018, Cell proliferation) MĚŘENÍ PROLIFERACE A BUNĚČNÉHO CYKLU Materiál - buněčná linie DU-145 (kontrola a ovlivněné buňky) - roztok PBS+EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová) - trypsin - nesterilní médium se sérem – inaktivace trypsinu - nesterilní FACS zkumavky, špičky, pipety - PBS + 1% BSA - Live Dead Fixable stain kit Red - Edu click-iT AF488 kit (Molecular Probes C10420) - Fx cycle Violet (Theromofisher Scientific F10347) Figure 3: Design experimentu a časy ovlivnění buněk inhibitorem MLN-4924. Postup 1. Sběr a příprava vzorků - odsát médium z buněk - přidat 3 ml PBS+EDTA – nechat 2 minuty působit - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – nechat inkubovat v termostatu (37^oC) dokud se buňky neuvolní (cca 2 minuty) - přidat 2,5 ml média se sérem (inaktivace trypsinu) - stočit 200g 5 minut, odsát supernatant 2. Značení viability – LD Green/LD Yellow - naředit značku pro viabilitu v PBS (1:1000) - přidat 100 µl/vzorek, inkubovat 15 min, 4°C - přidat 1 ml PBS + 1% BSA, stočit (200g, 5 min), odsát supernatant 3. Fixace - rozsuspendovat buňky ve 100 µl 4% PFA - inkubovat 15 min, RT - přidat 1 ml PBS + 1% BSA, stočit (200g, 5 min), odsát supernatant 4. Permeabilizace - rozsuspendovat buňky ve 100 µl 0,15% Tritonu X-100 - inkubovat 15 min, RT - přidat 1 ml PBS + 1% BSA - odpipetovat 250 µl z každého vzorku do nové zkumavky a nadepsat jako ISO kontrola - stočit (200g, 5 min), odsát supernatant 5. Click-iT reakce - připravit click-iT reakční směs dle rozpisu - přidat 125 µl click iT směsi/vzorek nebo 125 µl PBS/ ISO kontrolu - inkubovat 30 min, RT ve tmě - do obou zkumavek přidat 1 ml PBS + 1% BSA, stočit (200g, 5 min), odsát supernatant 1 reakce PBS 109,5 μl CuSO4 2,5 μl Fluorescent dye azide 0,625 μl Reaction buffer additive (diluted 10x) 12,5 μl Total reaction volume 125 μl 6. Značení buněčného cyklu - naředit značku Fx cycle Violet v PBS (1:1000) a RNAse (1:1000) - přidat 500 µl/vzorek - inkubovat 30 min, RT ve tmě Výsledky Popište postup měření a vyhodnocování buněk na průtokovém cytometru + přiložte výsledky měření získané vyhodnocením v programu FlowJo Protokol 3 Imunofenotypizace lidské krve Cíl - Cílem experimentu je stanovit zastoupení jednotlivých populací buněk v krvi na základě granularity, velikosti či exprese, pro tyto buňky typických, povrchových markerů. - Dále u neutrofilních granulocytů bude stanovena míra aktivace po stimulaci s G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), prozánětlivých cytokinem, který aktivuje buňky myeloidní řady. - Měření proběhne na průtokovém cytometru SONY SP6800 s následným vyhodnocení ve FlowJo. Teorie - Pojem imunofenotypizace představuje analýzu heterogenních populací buněk v krvi za účelem identifikace přítomnosti a podílu různých buněčných subpopulací. - Identifikace probíhá na základě exprese vybraných povrchových CD antigenů (markerů), a to s použitím fluorescenčně značených monoklonálních protilátek proti těmto antigenům. CD antigeny jsou většinou receptory nezbytné pro funkci dané buňky (buněčná komunikace, adheze, metabolismus apod.). - Na základě rozptylu světla mohou být hlavní populace rozděleny dle velikosti a granularity (Obr. 1). - Tato metoda se využívá jak ve výzkumu, tak v klinických laboratořích při diagnostice hematologických malignit. Tab. 1: Frekvence lidských buněk v periferní krvi člověka. Buněčný typ Množství (%) T lymfocyty 10-25 B lymfocyty 3-10 Granulocyty (eos, bas, neu) 45-65 Monocyty 3-10 NK buňky 2-5 Dendritické buňky (DC) 0,5-1 Kmenové buňky 0,01-0,05 Obr. 1: FSC a SSC leukocytů získaných z plné krve po lyzaci erytrocytů Postup 1. krev zdravého dobrovolníka bude odebrána zdravotní sestrou do antikoagulačního činidla (40 μL heparinu/1 mL krve) 2. krev rozdělit na dva vzorky, přičemž jeden vzorek stimulovat pomocí G-CSF minimálně 120 min (1 μg/mL) 3. připravit si mix protilátek – viz Tab. 2 4. po uplynulé době přidat do každé flow zkumavky po 100 μL suspenze (2x zkumavka nebarvená + 1x izotyp + 2x barvená) 5. buňky ve zkumavce zafixovat 3,2% formaldehydem 1:1 na 10 min, RT 6. následně zlyzovat erytrocyty 4 mL [d]H[2]0, 5 min, RT 7. takto připravené suspenze stočit (350 x g, RT, 5 min) a resuspendovat ve 120 μL PBS s 1% FBS 8. přidat mix protilátek do zkumavek 2, 3 a 4 - inkubovat 15-20 min na ledu 9. přidat 4 mL PBS na promytí 10. stočit (350 x g, RT, 5 min) a resuspendovat ve 150 μL PBS, uchovat na ledě 11. analýza na FACS zkumavka č. CD marker Fluoro-chrom populace buňek řědění Kat. č. excitace/emise (nm) 1A (bez G-CSF) nebarvená ctrl --- --- --- --- --- 1B (G-CSF) nebarvená ctrl --- --- --- --- --- 2 (bez G-CSF) Izotyp PerCP --- 1:40 2603150 482/675 Izotyp PE --- 1:50 2600565 496/578 Izotyp PE/Cy7 --- 1:50 2600630 496/785 Izotyp APC/Cy7 --- 1:50 2600635 650/785 Izotyp APC --- 1:50 2600705 650/660 3 (bez G-CSF) CD11b PerCP Neutrofil - aktivace 1:40 1106150 482/675 CD3 PE T-lymfocyt 1:50 2324030 496/578 CD4 PE/Cy7 Pomocný T lymfocyt 1:50 2102560 496/785 CD8 APC/Cy7 Cytotoxický T lymfocyt 1:50 2323570 650/785 CD19 APC B-lymfocyt 1:50 2111060 650/660 4 (G-CSF) CD11b PerCP Neutrofil - aktivace 1:40 1106150 482/675 Tab. 2: Protilátky pro FACS (všechny od SONY Biotechnology). Výsledky Popište postup měření a „gatování“ jednotlivých populací + přiložte výsledky měření vyhodnocených pomocí programu FlowJo.