Tomáš Bárta tbarta@med.muni.cz Úloha extracelulární matrix ve vývoji Obsah přednášky * Úvod * Funkce ECM * Role ve vývoji * Složení, Komponenty * Remodelace * Receptory * Anoikis * * • 2 Úvod - Extracelulární matrix (ECM) Buňka Tkáň Orgán Jedinec ? ECM – ExtraCelulární Matrix 3 •Co drží buňky dohromady, aby utvořily tkáň? •Jak spolu buňky a tkáně interagují, koordinují se, aby utvořily celého jedince? Co je extracelulární matrix (ECM)? •Je to trojrozměrná nerozpustná síť extracelulárních makromolekul, jako je kolagen, enzymy a glykoproteiny atp., které poskytují strukturální a biochemickou podporu okolním buňkám. •Zprostředkovává buněčnou adhezi, komunikaci mezi buňkami a diferenciaci. •Podává instrukce buňkám „kdy růst, kdy se dělit, kdy produkovat různé molekuly, kdy zemřít“. •Skládá se asi z 300 proteinů, převážně: kolagen, proteoglykany, elastin, glykoproteiny (fibronektin and laminin). Každá složka má určité fyzikální a biochemické vlastnosti. 4 5 •Určitá analogie mezi cytoskeletem a ECM •Podobně jako cytoskelet určuje vnitřní strukturu buňky, podílí se na pohybu, transportu atp., tak podobnou funkci má ECM ale vně buňky a na úrovni tkání a orgánů. •ECM je složena z mnoha typů makromolekul, vláken, proteinů, glykoproteinů, nejvíce ale Kolagen (cca 30% všech proteinů). Úvod - Extracelulární matrix (ECM) 6 •Všechny komponenty ECM napomáhají přichycovat buňky a strukturovat buňky do tkání. •Ale také dávají buňkám signál, kdy růst, kdy se dělit, kdy produkovat určité molekuly a dokonce i kdy umřít. Obsah obrázku laserová, scéna Popis byl vytvořen automaticky Úvod - Extracelulární matrix (ECM) Extracelulární matrix (ECM) •Glykoproteiny •Proteoglykany •Vláknité proteiny •Polysacharidy • • • • Nejvíce zastoupen je Kolagen (~30% všech proteinů u savců) 7 Integriny „propojují“ cytoskelet s ECM Návaznost na předchozí přednášku – co už víte 8 Co je extracelulární matrix (ECM) - Funkce 9 Co je extracelulární matrix (ECM) - Funkce 10 Jak buňká „vnímá“ ECM 11 Složky ECM – jak se v tom vyznat? Kusindarta, 2018 Proteoglykany Složky ECM Glykoproteiny Heparan sulfát Chondroitin sulfát Fibronektiny Laminin Polysacharidy Hyaluronová kys. Proteiny Kolageny 12 Složky ECM - Proteoglykany * Klíčová úloha při transportu parakrinních signálů. * Velké molekuly, které se skládají z centrálního proteinu a kovalentně vázané polysacharidové řetězce. * Příkladem mohou být: Heparan Sulfát, Chondroitin Sulfát. 13 Složky ECM – Proteoglykany – Heparan sulfát (HS) * Lineární polysacharid, který se vyskytuje ve formě proteoglykanu (protein s kovalentně navázanými řetězci HS) – téměř ve všech živočišných tkáních * Klíčová úloha při vazbě ligandů na receptory -> bez něj nemusí probíhat vazba! * Mutace, které blokují syntézu Heparan sulfátu způsobují různé defekty v migraci buněk, morfogenezi a diferenciaci. * Různé orgány a tkáně v průběhu vývoje produkují různé složení HS ÞHS se mění v průběhu vývoje => důležitý pro správný vývoj. •Tyto poznatky vedly k „sugar code“ hypotéze – specifické HS •modifikace řídí jednotlivé události v průběhu vývoje prostřednictvím •interakcí se signálními dráhami. •mnoho orgánů, včetně hematopoetické, skeletální systémy a játra, • plíce a ledviny, se netvoří správně, pokud chybí HS. Poulain, 2015 Heparan sulfát (HS) 14 Složky ECM – Proteoglykany – Heparan sulfát Poulain, 2015 Obecná struktura •Proteiny mají různý počet míst pro vazbu sacharidu •Některé ještě navíc mohou obsahovat chondroitin sulfát •HS je syntetizován v Golgi aparátu 15 Složky ECM – Proteoglykany – Heparan sulfát - funkce Funkce 16 Složky ECM – Proteoglykany – Heparan sulfát - funkce Funkce •Jako receptory/koreceptory (Wnt, FGF, Shh) •Zvýšení koncentrace ligandu, nebo receptoru na povrchu buněk v lipidových raftech •Regulace přenosu receptoru •Kontrola sekrece ligandů •Přímo jako signální molekuly •Kontrola distribuce gradientů signálu. •Komponenta ECM 17 Složky ECM – Proteoglykany – Heparan sulfát - funkce Ext1 -/- Exostosin Glycosyltransferase 1 This defect is due to a failure in the production of heparan sulfate to which Hedgehog binds and uses as part of its diffusion mechanism Lin et al., 2000 18 Inhibice syntézy HS -> narušení gastrulace Složky ECM – Proteoglykany – Heparan sulfát * Návaznost na předchozí přednášku * => Heparan sulfát je klíčový pro FGF signaling 19 * Izme = mutace v genu Ugdh – UDP-glucose dehydrogenase, která je potřebná pro syntézu bočních glycosaminoglykanových (GAG) řetězců proteoglykanů. Ciruna and Rossant, 2001 Garcia-Garcia and Anderson, 2003 Fenotypy mutací v genů pro proteoglykany často mimikují mutace v receptorech pro růstové faktory Bez Heparan sulfátu nebo FGF signalingu nemigruje mezoderm Složky ECM – Proteoglykany – Heparan sulfát 20 Složky ECM – Proteoglykany – Heparan sulfát 21 Složky ECM – Proteoglykany – Heparan sulfát Pravo-levá symetrie Kupffer’s vesicle - is a ciliated organ that controls left-right (LR) patterning Ferreira et al., 2017 22 Složky ECM – Proteoglykany – Heparan sulfát Pravo-levá symetrie – Sdc2 MO Arrington et al., 2013 23 Složky ECM – Proteoglykany – Heparan sulfát 24 Složky ECM – jak se v tom vyznat? Kusindarta, 2018 Proteoglykany Složky ECM Glykoproteiny Heparan sulfát Chondroitin sulfát Fibronektiny Laminin Polysacharidy Hyaluronová kys. Proteiny Kolageny 25 Složky ECM – Glykoproteiny •Fibronektin, Laminin •Odpovědné za samotnou organizaci ECM a buněk do uspořádaných struktur 26 Složky ECM – Glykoproteiny - Fibronektiny •Velké glykoproteiny (cca 460 kDa) – heterodimery složené z 2 podjenotek spojených disulfidickou vazbou •Dvě skupiny fibronektinů: •Rozpustný fibronektin (plasmatický – 300 µg/ml) – vyrábí ho hepatocyty •Nerozpustný, buněčný fibronektin •Váže se na: kolagen, fibrin, heparin, DNA, aktin, integriny. „Link mezi buňkou (integrinem) a složkami ECM“ •Funkce: buněčná adheze (kontakt buňka-buňka a také zprostředkovává kontakt buňka-kolagen, proteoglykan), udržování tvaru buněk => vývoj a morfogeneze •Má několik odlišných vazebných míst a jejich interakce s příslušnými molekulami vede ke správnému uspořádání buněk v rámci ECM. 27 Složky ECM – Glykoproteiny - Fibronektiny •Důležitá úloha v migraci buněk •Fibronektin označuje cesty kudy migrují buňky – např. migrace zárodečných buněk do gonád, migrace srdečních buněk do střední části embrya. Linask, Lash, 1988 28 Složky ECM – Glykoproteiny - Fibronektiny •Důležitá úloha v migraci buněk •Fibronektin označuje cesty kudy migrují buňky – v průběhu gastrulace je klíčový pro migraci buněk mezodermu. 29 30 M. Marsden and D. W. DeSimone, 2001 Components of ECM – Glycoproteins - Fibronectins 31 Intra-blastocoelar injection of anti-FN mAbs disrupts gastrulation. (A-C,G) Embryos injected at stage 9.5 with mAb 4H2 show normal development at stage 10.5, as indicated by dorsal lip formation (A, arrowhead). (B) At stage 11.5 the blastopore is almost closed (arrowhead) and embryos go onto develop into tadpoles (C,G). mAb 1F7-injected embryos (D-F,H) develop a normal blastopore at stage 10.5 (D, arrowhead). (E) By stage 11.5, there is a significant delay in blastopore closure and little movement of the blastopore lip is apparent (arrowhead). (F) mAb 1F7-injected embryos are truncated along the AP axis and bent ventrally. The blastocoel is retained and displaced ventrally (arrowhead). (H) Blastulae injected with mAb 1F7 develop into tadpoles that have small eyes, display head edema, and lack gut (arrowheads), heart, blood vessels and blood. M. Marsden and D. W. DeSimone, 2001 Components of ECM – Glycoproteins - Fibronectins Složky ECM – Glykoproteiny - Fibronektiny 32 Složky ECM – Glykoproteiny - Laminin •Spolu s kolagenem je základní složkou basální laminy Vazba na ostaní lamininy a složky ECM Vazba na buňku Přes integriny, dystroglykan 33 Složky ECM – Glykoproteiny - Laminin •Nomenklatura: Laminin-521 obsahuje α5, β2, γ1 řetězce. Vazba na ostaní lamininy a složky ECM Vazba na buňku Přes integriny, dystroglykan 34 Složky ECM – jak se v tom vyznat? Kusindarta, 2018 Proteoglykany Složky ECM Glykoproteiny Heparan sulfát Chondroitin sulfát Fibronektiny Laminin Polysacharidy Hyaluronová kys. Proteiny Kolageny 35 Složky ECM – Proteiny - Kolageny •Hlavní strukturální protein ECM (cca 30% všech proteinů u savců) •Produkován převážně fibroblasty •Želatina je v podstatě hydrolyzovaný kolagen. •90% kolagenu tvoří Kolagen I, celkem cca 30 typů kolagenu •Kolagen je glykosilován prostřednictvím prolyl-4-hydroxylázy and lysyl-hydroxylázy – potřebuji Vitamín C jako kofaktor. Nedostatek vitamínu C pak vede ke Kurdějím • 36 37 ECM - remodelace •Štěpení ECM komponent je klíčovým procesem v průběhu ECM remodelace. •Regulace množství ECM •Regulace složení ECM •Regulace struktury •Uvolnění růstových faktorů (a dalších regulačních molekul) •Matrix metaloproteinázy (MMP) •Hlavní enzymy, které degradují ECM •Volné (sekretované) nebo vázané na buněčnou membránu. •Sekretované v podobě zymogenu – aktivace až v ECM (jinou MMP nebo oxidací thiol. skupiny). •Adamalysins (ADAMTS), Meprins 38 ECM - remodelace 39 ECM - remodelace 40 ECM – remodelace - apoptóza 41 ADAMTS - a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs •Degradace interdigitální (mezi prsty) tkáně zahrnuje intensivní remodelaci ECM. •Remodelace pomocí ADAMTS5 a jejího substrátu – složky ECM versicanu. •Produkt štěpení versicanu indukuje apoptózu •V případě absence ADAMTS5 dochází k syndaktylii. ECM – remodelace - apoptóza 42 Při absenci ADAMTS5 dochází k syndaktylii… ….Protože nedochází k apoptóze ECM – remodelace - apoptóza 43 Samotná přítomnost štěpené formy Versicanu je schopna indukovat apoptózu ECM - remodelace 44 ECM - remodelace 45 Složky ECM – Závěr 46 •Znát základní složky ECM, skladba, funkce + uvést funkční příklady •Znát principy remodelace ECM + uvést příklady Složky ECM – Receptory Buňka musí nějak „vnímat“ jestli a jak je ukotvena v ECM => je to pro ni důležitý zdroj signálů a informací 47 Složky ECM – Receptory - Integriny •Schopnost buňky vázat adhesivní glykoproteiny ECM (laminin, fibronektin) závisí na expresi membránový receptorů. •Integriny = integrují extracelulární a intracelulární matrix, tak aby spolu pracovaly. •V ECM se vážou na arginine-glycine-aspartate (RGD) motiv – přítomen u adhesivních proteinů ECM – fibronektin, laminin, vitronektin. Uvnitř buňky se vždy váže na cytoskelet. 48 Složky ECM – Receptory - Integriny •Mají schopnost signalizovat z vnějšku buňky dovnitř, což vede ke změně genové exprese. •Vnímat napětí (tlak, tuhost) ECM, aktivují/deaktivují různé signální dráhy. •Klíčový k řízení exprese genů v průběhu vývoje tkání (mléčná žláza - schopen signalizovat expresi genů estrogenového receptoru a kaseinového proteinu) • 49 Obsah obrázku text, barevné Popis byl vytvořen automaticky Složky ECM – Receptory - Integriny •Aktivace integrinů může: •Stimulovat proliferaci •Inhibovat apoptózu •Aktivovat procesy nutné ke změně tvaru buňky, nebo polarity •Změnit motilitu buňky 50 Složky ECM – Receptory - Integriny •Příklad: •Které geny jsou regulovány? • 51 Anoikis •Pokud se buňka oddělí od epitelu (nebo od ECM), je potenciálně nebezpečná – ztrácí důležitou regulační složku (basální laminu/ECM). •Proto existuje anoikis = programovaná buněčnou smrt, pokud se buňka oddělí od ECM, dochází ke spuštění signální dráhy, která vede k programované buněčné smrti. •Vazba integrinů na složky ECM zabraňuje Anoikis – stále neznámý mechanismus. 52 Integriny - Signalling 53 ECM receptory - závěr 54 •Znát základní složky ECM •CO se stane, když některá složka ECM chybí. •Vědět co jsou to Integriny, jejich strukturu a funkci. •Jak buňka „vnímá“ kontakt s ECM. •ANOIKIS – i apoptóza je důležitá v průběhu vývoje. ECM – Dotazy? 55 Děkuji za pozornost 56 Tomáš Bárta tbarta@med.muni.cz