Tomáš Bárta tbarta@med.muni.cz Zapojení buněčných adhezí do regulace vývoje. Obsah přednášky * Úvod * Obecné principy kontaktu mezi buňkami * Cadheriny * Nectiny * Selectiny * Ephriny * Shrnutí * * 2 Buněčná adheze •Jak jsou z populací buněk vytvořeny oddělené tkáně? •Jak se tvoří orgány na konkrétních místech a migrující buňky se dostanou do svých cílů? •Co udržuje mezoderm odděleně od ektodermu, takže pokožka má dermis i epidermis? •Jak některé buňky - například prekurzory našich pigmentových buněk a zárodečných buněk - cestují na dlouhé vzdálenosti, aby dosáhly svých konečných cílů? 3 Může být tento termodynamický model použit i na buňky v embryu? Buněčná adheze 4 •Evolučně spjata s vývojem mnohobuněčných organismů. •Regulace buněčné adheze v čase i prostoru je klíčová pro správný embryonální vývoj. (Epidermolysis bullosa) •Adhezivní molekuly nejsou jen proteiny, které lepí k sobě buňky, ale mají také nějakou další funkci – buněčná signalizace. Obsahují extracelulární, membránovou a intracelulární domény -> signalizace (buňka má přehled o sousedních buňkách a interakcí s ECM). Buněčná adheze v komunikaci •V embryu spolu buňky komunikují na krátkou vzdálenost: •Přímým kontaktem (juxtakrinní) •Sekrecí do ECM (parakrinní) 5 •Důležitá při komunikaci buňka-buňka •Proteiny, které jsou sekretovány z buňky (nebo jsou na povrchu buňky) a slouží ke komunikaci jsou signální molekuly (ligandy) •Proteiny zabudované v membráně, které vážou ligandy (volné nebo vázané) jsou receptory. •Homofilní x heterofilní vazba při juxtakrinní signalizaci. •Po vazbě dojde ke konformační změně, která vede ke změně vlastností intracelulární domény receptoru. Buněčná adheze – pojmy se kterými budeme pracovat 6 Molekuly zprostředkovávající buněčnou adhezi 7 +Nectin +Efrin Cadheriny 8 Buněčná adheze - Cadheriny •calcium-dependent adhesion molecules •Klíčové pro mezibuněčné spoje •Intracelulárně se vážou na cytoskelet (Cateniny) •Komplex Cadherinů a Cateninů představuje adhézní spoje (adherens junctions) – typické pro epitel. •Cateniny pak slouží pro signaling do jádra (kanonický Wnt signaling) •Blokace cadherinů (protilátky, RNAi) vede k desintegraci epitelu. Cadheriny 9 Buněčná adheze – Cadheriny -Funkce •Vnější doména Cadherinů slouží k adhezi buněk •Cadheriny se vážou na cytoskeletární aktin -> pomáhají ke tvorbě cytoskeletu -> poskytují mechanickou sílu pro formování tkáňových struktur. •Slouží k signálování do jádra -> změna genové exprese. 10 11 Buněčná adheze – Cadheriny - Typy E-Cadherin •Exprimován v epitelu Link na předchozí přednášku: R-Cadherin •Exprimován v retině •Retinal Cadherin Protocadheriny •Postrádají vazbu na cytoskelet. P-Cadherin •Exprimován v placentě •Placental Cadherin 12 N-Cadherin •Exprimován v průběhu vývoje nervové soustavy •Neural Cadherin Buněčná adheze – E-Cadherin E-Cadherin (E-cadherin, Cadherin-1(CDH1), L-CAM, ARC-1, uvomorulin) •Exprimován na všech savčích embryonálních buňkách, později ve vývoji jen v epitelu. •Evolučně konzervován •Esenciální glykoprotein ve vývoji, diferenciaci buněk a v udržování tkáňové homeostáze •Důležitý pro ustanovení a udržování epiteliální polarity. •Zprostředkovává homofilní interakce buňka-buňka Link na předchozí přednášku: 13 Obsah obrázku škeble, rostlina, zelená Popis byl vytvořen automaticky Střevní krypty Buněčná adheze – E-Cadherin 14 Buněčná adheze – E-Cadherin 15 •Myši KO pro CDH1: letální ještě před implantací, buňky moruly disociují - žádná adheze. Embrya neformují epitel, např. trofektoderm. •Proto se CDH1 zkoumá při tkáňově specifickém KO. Např. CRE rekombinázou. •RIP-Cre - Rat insulin promoter -> Cre rekombináza je exprimována pouze v pankreatu. Mandelbaum et al., 2012 Cdh1 Cdh1 * Tkáňově specifický KO E-cadherinu ve střevě. 16 Buněčná adheze – E-Cadherin Buněčná adheze – N-Cadherin 17 Burke-Kleinman Buňky hladké svaloviny •N-Cadherin, Cadherin-2 (CDH2) nebo neural cadherin (NCAD) •V srdečním svalu je N-cadherin integrální složkou v adhezivních spojeních umístěných na interkalačních disků, které fungují tak, že mechanicky a elektricky spojují sousední kardiomyocyty. Buněčná adheze – N-Cadherin 18 •Myší KO: letalita v E10, abnormální tvar somitů, menší, abnormality srdce. N-Cad -/- Barvení wt na N-Cad Radice et al., 1997 N-Cadherin vs E-Cadherin 19 Buněčná adheze – Cadheriny - Signalling 20 •Zprostředkovávají nejen fyzický kontakt mezi buňkami, ale také signaling do jádra. Např přes cateniny – crosstalk s Wnt signalingem. Buněčná adheze – Cadheriny - Signaling 21 22 Buněčná adheze - rozdílná (selektivní) buněčná afinita Townes and Holtfreter, 1955 23 Epidermální buňky z pigmentovaných embryí a buňky neurální plotny z nepigmentovaných embryí byly disociovány a smíchány dohromady. Buňky se znovu agregovaly tak, epidermis zakryl nervovou tkáň. Buněčná adheze differential adhesion hypothesis „According to this hypothesis, the early embryo can be viewed as existing in an equilibrium state until some change in the adhesive properties of the cell’s plasma membrane changes. The movements that result seek to restore the cells to a new equilibrium configuration.“ „Hranice mezi tkáněmi je tak tvořena různými typy buněk, které mají na svém povrchu různé adhesivní molekuly v různém množství.“ 24 Buněčná adheze Selektivní afinita •Vnitřní povrch ektodermu má pozitivní afinitu k mesodermu a negativní k endodermu. Mesoderm má pozitivní afinitu k endo- i ektodermu. „Somehow, the cells are able to sort out into their proper embryonic positions.“ Townes and Holtfreter, 1955 •Selektivní afinita se v průběhu vývoje mění. •Buňky musí interagovat rozdílně s ostatními buňkami/tkáněmi v konkrétním čase a měnících se podmínkách. •Klíčové pro morfogenezi. 25 Buněčná adheze – Cadheriny Buněčná adheze je dána množstvím Cadherinu na bunčné membráně. Dokonce i když buňky exprimují rozdílné Cadheriny 26 Buněčná adheze 27 Cadheriny v ustavení P/L asymetrie 28 Cadheriny v ustavení P/L asymetrie 29 •Vysoká exprese N-Cadherinu v pravé polovině vede k sekvestraci β-cateninu, který by jinak byl přístupný pro Wnt signaling, tím je Wnt v pravé polovině inhibován. Cadheriny v EMT a gastrulaci: link na předchozí přednášku 30 Cadheriny a asymetrické dělení: link na první přednášku 31 Drosophila ovarian stem cell niche Symetrical cell division Cytoplasmatic determinants distributed evenly to both daughter cells, generating the same cells Asymetrical cell division Cytoplasmatic determinants distributed unevenly, generating two different cells Cadheriny a asymetrické dělení: link na první přednášku 32 •Zkrácená varianta E-cadherinu, vedla k indukci asymetrického dělení Gloerich et al., 2016 Cadheriny shrnutí * Ca-dependentní vazba * Vážou se na aktin - vazba na cytoskelet * Signaling přes cateniny (kanonický Wnt signaling) * N- a E-cadherin link na EMT a MET * KO na N- a E-Cadherin * * 33 Nectiny 34 Nectiny * Rodina proteinů (4 členové - nectin-1 až 4) * Geny pro nectiny jsou PVRL1-4 (Poliovirus receptor-like), váže také alphahepesviry * Ig-like proteiny, Ca2+ nezávislá adheze * Zprostředkovávají homo ale převážně heterofilní mezibuněčné trans interakce 35 Nectiny * Cadheriny upředňostňují homofilní interakce * Nectiny upřednostňují heterofilní trans interakce -> způsobuje mozaiku, často je najdeme tam kde je zapotřebí mozaika buněk (např. sluchové ústrojí – kombinace podpůrných buněk a vláskových buněk) * Na adhezi mohou participovat s Cadheriny, nebo samostatně 36 Nectiny 37 * Nectiny jsou tam, kde je zapotřebí heterotypické spojení, nebo mozaika * Například v nervových synapsích Nectiny ve vývoji oka 38 * Nectiny jsou tam, kde je zapotřebí heterotypické spojení, nebo mozaika * Například v kontaktu mezi epitely v oku Myši s deficientním nectinem1 - mikroophthalmie wt Nectin1 -/- Inagaki et al., 2005 Nectiny 39 •Například v zubech Nectiny ve vývoji 40 •Ektodermální dysplazie rozštěpu patra mutace v genu PVRL1 (nectin-1) •Vede ke zkrácené verzi proteinu, který postrádá intracelulární a transmembránovou doménu Nectiny ve vývoji 41 •Onemocnění je autozomálně recesivní, rodiče jsou většinou heterozygoti •Vysoký výskyt na Margarita Island..PROČ? •Rezistence heterozygotů k alfa herpesvirům (plané neštovice) -> evoluční výhoda? Nectiny ve vývoji 42 •Protože nectin-1 s nectinem-4 často tvoří heterofilní vazbu, tak mutace v nectinu-4 jsou často fenokopíí mutací netctinu-1 Mutace v nectinu-4 Nectiny ve vývoji sluchového ústrojí Sluchové ústrojí tvoří „mozaika“ buněk - několik různých buněčných typů Suspenze buněk, které exprimují různé nectiny Togashi et al., 2011 Nectiny ve vývoji sluchového ústrojí Deficience nectinů vede k porušení mozaiky Togashi et al., 2011 Nectiny a signaling •Nectiny spolupracují s cadheriny. Nectiny iniciují spojení buňka-buňka a následně rekrutují cadheriny - klíčové pro tvorbu adherens junctions •Tím, že spolupracují s Cadheriny, tak také regulují kanonickou Wnt signalizaci Nectiny souhrn •Ig-like proteiny, vazba nezávislá na Ca2+ •Důležité pro heterofilní trans interakci mezi buňkama •Často esenciální pro tvorbu mozaiky Selectiny 47 Selectiny * Membránové glykoproteiny * Rozeznávají molekuly sacharidů na povrchu sousední buňky – nejde tedy o interakci dvou stejných typů molekul, jako v případě cadherinů, nebo nectinů. * Vazba je závislá na přítomnosti Ca2+ * Uplatňují se při vazbě imunitních buněk k endotelu. * 48 Selectiny v průběhu implantace embrya * Hrají úlohu nejen v „leukocyte rolling/homing“, ale také v průběhu implantace embrya. * Mechanismus implantace zahrnuje přechodnou interakci blastocysty a děložního povrchového epitelu předtím, než buňky trofoblastového epitelu proniknou do děložní stěny. 49 Selectiny v průběhu implantace embrya 50 Iniciace implantace embrya •L-selectin je exprimován na povrchu trofoblastu •Jeho ligandy jsou exprimovány na povrchu endometria •Mechanismus pro infertilitu? Selectiny v průběhu implantace embrya 51 •Po implantaci trofoblast prorůstá do endometria •Interakce s endotelem je zajištěna prostřednictvím P- a E-selectinu Selectiny a signalizace 52 Cytoplazmatická doména interaguje s Calmodulinem - Ca2+ dependentní signaling a s actinem Selectiny shrnutí * Ca-dependentní vazba na polysacharid * Popsány ve vazbě imunitních buněk k endotelu * Důležité při implantaci embrya - interakce trofektodermu s endotelem matky * Signalují do jádra přes calmodulin * 53 Ephriny 54 Ephriny * Ephriny (Eph receptor-interacting proteins) jsou ligandy Eph receptorů (erythropoietin-producing human hepatocellular receptors). * Jak Eph receptory, tak ephriny jsou membránové proteiny – vázané na buňku. * Pro aktivaci receptoru je nutná interakce buňka-buňka * Eph receptory: patří mezi tyrozinkinázové receptory -> signalizace * Hrajou roli ve vývoji, navádění •axonů, formování tkání, migraci •buněk a segmentaci těla. • 55 Ephriny - signaling * U savců: 16 typů receptorů (2 skupiny EphA, EphB), 14 ligandů (opět ve dvou skupinách EphA/B). * Zajímavost: obousměrný signaling – klasicky může signalizovat receptor („forward signaling“), ale i ligand („reverse signaling“). * 56 Ephriny a segmentace * Je základní proces embryogeneze probíhající u většiny bezobratlých a všech obratlovců, kterým je tělo zpočátku rozděleno na funkční jednotky. * K čemu vlastně je ta segmentace? * Segmentované oblasti embrya představujou hranice pro různé biochemické a morfologické pochody - chování buněk drasticky odlišné – životně důležité pro budoucí diferenciaci a funkci orgánu/organismu. * Link na přednášku EMT a MET: * 57 Ephriny a segmentace 58 Denans et al., 2015 Ephriny a segmentace 59 Overexprese ephrin-B2 wt Overexprese DN forem ephrinů a jejich receptorů vede k chybám při tvorbě somitů Ephriny a navádění axonů 60 •Miliardy neuronů spolu potřebují komunikovat přes synapse. •Spojení neuronů se netvoří jen v průběhu embryonálního vývoje, ale také po narození. •Nesprávné napojení nebo počet neuronů vede k závažným problémům ve vývoji nervové soustavy. •Jak mohou miliardy buněk spolu správně komunikovat? •Jak každá buňka ví, kde a na kterou buňku se má napojit? Ephriny a navádění axonů 61 62 Ephriny a navádění axonů 63 •Neuronová spojení jsou zprostředována molekulárními průvodci, kteří řídí axony (navádění axonů). •Eph/ephrin signalizace reguluje migraci axonů do jejich cílových destinací z velké části tím, že inhibuje růst axonálních růstových kuželů a odpuzuje migrující axon pryč z místa aktivace Eph/ephrin. • •Tento mechanismus závisí na relativních úrovních exprese Eph a efrinu a umožňuje gradientům exprese Eph a efrinu v cílových buňkách řídit migraci růstových kuželů axonů na základě jejich vlastních relativních úrovní exprese Eph a efrinu. • •Např. „forward signaling“ EphA a EphB receptory zprostředkovávají kolaps růstových vrcholů, zatímco „reverse signaling“ prostřednictvím ephrin-A a ephrin-B indukuje přežití růstových vrcholů. Ephriny a navádění axonů 64 Jak se to dá studovat? Např. micropatterning. Ephriny a navádění axonů: příklad Chiasma opticum 65 •Jednotlivé neurony sítnice (cca milióny retinálních gangliových buněk) posílají své axony do oblastí mozku, kde se procesuje zrakový vjem (zrakové tectum). •Místo křížení optických nervů je definováno repulzí mezi jednotlivými Ephriny a jejich receptory (+semaforiny). •Eph receptory jsou na rostoucích axonech, ligandy na okolích buňkách. Ephriny a navádění axonů: příklad Chiasma opticum 66 Demonstrace křížení optických nervů prostřednictvím barev vpravených do retiny Jak vzniká neporušený obraz? •Když je skupina buněk v retině aktivována (např. posteriorní část retiny), podobná skupina v optickém tectu (např. kaudální) je taktéž aktivována. •To demonstruje napojení jednotlivých retinálních buněk k jejich odpovídajícím buňkám v tectu. •Jak se ale přesně napojí? Ephriny a navádění axonů: příklad Chiasma opticum 67 Gradientem Eprinů (v tectu) a jejich receptorů (na naváděném axonu) Buněčná adheze – Spermie a oocyt 68 Buněčná adheze – Spermie a oocyt 69 Integriny 70 Integriny * Většinou mají funkci v interakci buňka-ECM - budeme probírat příště * Ale také v interakci buňka-buňka 71 Buněčná adheze - závěr 72 •Juxtakrinní signalizace •Principy adheze •Co to jsou cadheriny, princip vazby, základy signálování cadherinů •Síla adheze závisí na množství canderinů na povrchu buňky •Differential adhesion hypothesis •Ostatní molekuly, které účastní na mezibuněčném kontaktu • • Děkuji za pozornost 73 Tomáš Bárta tbarta@med.muni.cz