Tomáš Bárta tbarta@med.muni.cz Regulace velikosti buněk a orgánů ve vývoji a příklady jejich nezbytnosti Obsah přednášky •Úvod •Velikost embrya •Signální dráhy v regulaci velikosti jedince/orgánů •Aspekty regulace Growth rate/duration •Příklady – Drosofila, Člověk •Regulace velikosti orgánů Regulace velikosti - food for thought •Základní otázka vývojové biologie •Stále neznáme jasnou odpověď Suncus etruscus vs ? Balaenoptera musculus Stejný plán těla (musí být zachovány propozice), liší se velikosti tkání a orgánů Regulace velikosti - food for thought •Nesprávná regulace vede u organismů ke dwarfismu, gigantismu a/nebo hypo- nebo hyperplazii u orgánů. •Velikost je nejzákladnějším fenotypem •Zasahuje do mnoha aspektů biologie živočichů: anatomie, fyziologie, chování… •Proto je kontrola velikosti těla/orgánů klíčovým vývojovým procesem, který zajišťuje, že živočich doroste do velikosti, která je pro jeho druh typická. Regulace velikosti - food for thought Regulace počtu buněk Regulace velikosti buněk Jak se reguluje velikost embrya? Lewis and Rossant 1982 „Size regulation appeared to be brought about by alteration in cell cycle length. There was no obvious increase in cell death in the double embryos nor an increase in the non-dividing cell population.„ Pokud agregujeme dvě embrya dohromady - vznikne normální jedinec •Jak embryo pozná, že má mít správný počet buněk? •Jakým způsobem a kdy upraví počet buněk? Prodloužením buněčného cyklu se upraví počet buněk. Dochází k tomu po implantaci, ale ještě před gastrulací Pokud buňky nadbývají: Jak se reguluje velikost embrya? Pokud agregujeme dvě embrya dohromady - vznikne normální jedinec V double embryi apoptózu indukují jen buňky epiblastu (žádné jiné), které nejsou v kontaktu s bazální membránou a jen v brzkém emryonálním stádiu. Orietti, 2020 Pokud buňky nadbývají: Jak se reguluje velikost embrya? Zopakováno na izolovaném epiblastu in vitro - bez přispění trofektodermu Orietti, 2020 Pokud buňky nadbývají: Jak se reguluje velikost embrya? Zopakováno na ESC Inhibice apoptózy Inhibice apoptózy nevedla k utvoření epitelu. Orietti, 2020 Pokud buňky nadbývají: Jak se reguluje velikost embrya? Apoptóza ALE nereguluje velikost embrya! Embrya s inhibovanou apoptózou dokázaly upravit svou velikost Orietti, 2020 Pokud buňky nadbývají: Jak se reguluje velikost embrya? Souhrn: •Zvýšený počet buněk embryo kompenzuje prodloužením buněčného cyklu nikoliv apoptózou. •Apoptóza je nicméně nutná ke správnému vytvoření epitelu epiblastu. •Dva rozdílné mechanismy: apoptóza x zpomalení proliferace Apoptóza je nutná k uspořádání epitelu epiblastu u „double“ embryí Zpomalení buněčného cyklu Pokud chybí buňky: Jak se reguluje velikost embrya? Existuje tedy ve vývoji nějaký kontrolní bod, kdy embryo „kontroluje“ svou velikost? ► Poloviční embrya mají stejné načasování vývoje jako normální embrya, ale jejich vývojový potenciál je snížen. ► aby byl vývoj zachován, je nutná přítomnost aspoň 4 pluripotentních buněk. ► Fgf/Wnt modulace vede k nápravě vývoje polovičního embrya Morris, 2012 Pokud chybí buňky: Jak se reguluje velikost embrya? Morris, 2012 Pokud chybí buňky: Jak se reguluje velikost embrya? Souhrn: •Poloviční embrya dokončí svůj vývoj (ne všechna) •Žádné ¼ embryo nedokončí svůj vývoj - chybí mu buňky. •Možno kompenzovat modulací FGF, Wnt signalingu. Známé signální dráhy, které jsou zapojeny do regulace velikosti Insulin/IGF-, RAS/RAF/MAPK-, TOR, Hippo, and JNK pathways •Crosstalk mezi nimi • • •Rychlost růstu •Délku růstu •Velikost (tkáně orgánu) •Koordinaci růstu Zahrnují: •Geny •Signální dráhy •Hormony • •Dohromady zajišťují správně proporcionální a přiměřeně velké tělo Známé signální dráhy, které jsou zapojeny do regulace velikosti Velikost – signální dráhy – Insulin/IGF1 Insulin/Insulin-like growth factor (IGF) Signaling (IIS) pathway •Množství IGF v závislosti na výživě/nutrientech Velikost – signální dráhy – Insulin/IGF1 Insulin/Insulin-like growth factor (IGF) Signaling (IIS) pathway •Množství IGF v závislosti na výživě/nutrientech Velikost – signální dráhy – Insulin/IGF1 Velikost – signální dráhy - Ras/Raf/MAPK Aktivována IGF – viz předchozí slides receptor tyrosine kinases EGF/FGF/VEGF Velikost – signální dráhy - TOR •Podobně jako IGF, také reguluje růst na základě přítomnosti živin, energie, kyslíku •Konzervován od kvasinek až po člověka •IGF a TOR jsou hlavními hráči podílejícími se na předávání informací o přítomnosti živin za účelem koordinace růstu. TOR = target of rapamycin Velikost – signální dráhy - TOR Velikost – signální dráhy - Hippo Drosophila vs. Savci Hippo = Mst1/2 Salvador = Sav1 Warts = Lats1/2 Mats = Mob1A/B Velikost – signální dráhy - JNK •Stresová pathway, reguluje buněčnou smrt, regeneraci tkání, hojení ran Velikost – signální dráhy - Ostatní •Signální dráhy, které kontrolují patterning •Kontrolují tvar a uspořádání orgánu - změny v buněčném růstu a proliferaci •Hh, Wnt, TGF-β Velikost – signální dráhy – Závěr a Otázky •Znát základní signální dráhy, které regulují velikost. • Aspekty kontroly velikosti – Drosophila Imaginal discs – model systém Velikost disku determinuje velikost orgánu Aspekty kontroly velikosti – Drosophila Engrailed GAL4 GFP UAS Aspects of Size Control – Drosophila GAL4/UAS system: a geneticist's Swiss army knife Aspekty kontroly velikosti – Drosophila Aspekty kontroly velikosti •Výše zmíněné signální dráhy regulují růst a proliferaci, to ale nevysvětluje samotnou podstatu kontroly velikosti. •Velikost tkáně/orgánu/jedince určuje tempo (rate) růstu a doba (duration) růstu. Tempo růstu Řízeno signálními drahami, které regulují proliferaci a růst buněk Doba/délka růstu Je regulována systémovými hormonálními signály, které koordinují zastavení růstu v celém těle, a také orgánově autonomními procesy, které zajišťují, že orgány přestanou růst, jakmile dosáhnou své konečné velikosti. Aspekty kontroly velikosti Tempo růstu Řízeno signálními drahami, které regulují proliferaci a růst buněk Aspekty kontroly velikosti – Tempo růstu •Regulováno růstem buněk a jejich proliferací => více větších buněk/čas = větší orgán/jedinec •Růst a proliferace jsou regulovány různými drahami. Růst buněk: •75% buňky je tvořeno vodou, ionty a malými molekulami •18% je tvořeno proteiny => růst závisí na syntéze proteinu. Aspekty kontroly velikosti – Tempo růstu S6K (S6 kinase) je ribozomální 40S protein => kontroluje syntézu ribozomálních proteinů •Deficience S6K (I-1/I-1) – opožděný vývoj, menší jedinec, ale stejný počet buněk Aspekty kontroly velikosti – Tempo růstu S6K je ribozomální 40S protein => kontroluje syntézu proteinů •Deficience S6K (I-1/I-1) – opožděný vývoj, menší jedinec, menší orgány, ale stejný počet buněk Montagne et al., 1999 Aspekty kontroly velikosti – Tempo růstu S6K je ribozomální 40S protein => kontroluje syntézu ribozomálních proteinů •dS6K (overexprese) – větší buňky Montagne et al., 1999 Aspekty kontroly velikosti – Tempo růstu - Insulin/Insulin-like growth factor (IGF) Puig et al, 2006 •FOXO reguluje velikost orgánu prostřednictvím kontroly počtu buněk •Vyšší exprese FOXO, míň buněk Aspekty kontroly velikosti – Tempo růstu - Insulin/Insulin-like growth factor (IGF) Puig et al, 2006 •FOXO reguluje velikost orgánu prostřednictvím kontroly počtu buněk •Vyšší exprese FOXO, míň buněk •Rescue fenotyp prostřednictvím overexprese dAkt (inhibice inhibitoru růstu) Aspekty kontroly velikosti – Tempo růstu – buněčný cycklus Aspekty kontroly velikosti – Tempo růstu – buněčný cycklus - MYC •Onkoprotein •Indukuje expresi mnoha růstových faktorů •Pozitivně reguluje biogenezi ribozomů a tím také syntézu proteinů Aspekty kontroly velikosti – Tempo růstu – buněčný cycklus - MYC Buňky v blízkém kontaktu s dMyc klonem mají růstovou nevýhodu. Claire de la Cova, Cell, 2004 Myc overexprese Is a difference in growth rates between populations of cells sufficient to induce competition? Aspekty kontroly velikosti – Tempo růstu – buněčný cycklus - MYC Myc overexprese Aspekty kontroly velikosti – Tempo růstu – buněčný cycklus - MYC Johnston et al., 1999 Myc deficience Wnt kontroluje velikost Aspekty kontroly velikosti – Tempo růstu – buněčný cycklus - MYC Shrnutí MYC Myc overexprese = více větších buňek, rychlejší proliferace, větší jedinec, ztráta kontroly velikosti Myc deficience = menší buňky, menší jedinec Velikost křídla je kontrolována Wnt (Wg) Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) Doba/délka růstu Je regulována systémovými hormonálními signály, které koordinují zastavení růstu v celém těle, a také orgánově autonomními procesy, které zajišťují, že orgány přestanou růst, jakmile dosáhnou své konečné velikosti. Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) •Regulace tempa růstu a proliferace (Growth rate) nestačí k plné kontrole růstu •Rozdíly mezi jedinci (a také mezi jednotlivými druhy) jsou způsobeny rozdílnou velikostí a počtem buněk -> také regulováno dobou růstu •Mnoho signálních drah a molekulárních mechanismů, které regulují tempo růstu, jsou také zapojeny do regulace doby růstu. •Drosophila – 3 larvální stádia •Velikost jedince je dána: tuhým exoskeletem – nedochází k dalšímu růstu, velikostí larvy ve stádiu kdy přestává přijímat potravu, před stádiem kukly (larval wandering). •Rozhodnutí se zakuklit je ale v mnohem dřívějším stádiu (začátek 3. instaru) a je asociováno s nabytím určité velikosti (critical size) Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) - IGF •Rozhodnutí se zakuklit je ale v mnohem dřívějším stádiu (začátek 3. instaru) a je asociováno s nabytím určité velikosti (critical size), což je doprovázeno syntézou hormonu ekdyson •Ekdyson je syntetizován v narůstajících pulzech a každý pulz je asociován s konkrétní událostí ve vývoji (metamorfózou). Growth rate and duration TGP = Terminal Growth Period •Critical size chybí u člověka. Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) - IGF IGF reguluje growth rate během TGP Shingleton et al., 2005 Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) Lin et al., 2011 Prodloužení doby růstu vede k „záchraně“ fenotypu cycE hypomorfní mutace Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) – syntéza proteinů Lin et al., 2011 Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) Přesný mechanismus jak larvy zaznamenají svou critical size není jasný… Here we show that this size-sensing mechanism depends on the limited ability of a fixed tracheal system to sustain the oxygen supply to a growing individual. As body mass increases, the demand for oxygen also increases, but the fixed tracheal system does not allow a corresponding increase in oxygen supply. We show that interinstar molting has the same size-related oxygendependent mechanism of regulation as metamorphosis. We show that low oxygen tension induces molting at smaller body size, consistent with the hypothesis that under normal growth conditions, body size is regulated by a mechanism that senses oxygen limitation. ale… Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) Přesný mechanismus jak larvy zaznamenají svou critical size není jasný, ale jsou známy signální dráhy regulující syntézu Ekdysonu a tím reagují na dosažení critical size IIS, TOR, RAS/RAF/MAPK Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) - člověk A co člověk? Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) - člověk •Zastavení růstu je asociováno s koncem puberty -> načasování puberty je důležitý faktor v regulaci velikosti •Hormonální změny v pubertě jsou známy, ALE mechanismy, které řídí, kdy jsou tyto hormonální změny zahájeny, jsou mnohem méně pochopeny. A co člověk? •Vyšší BMI, dříve puberta •To naznačuje, že načasování puberty a zastavení růstu u lidí, stejně jako u Drosofily, jsou regulovány stavem (množstvím) výživy a velikostí těla mladistvých. „For example, children displaying precocious puberty are typically tall for their age because of an advanced adolescent growth spurt, but generally become shorter adults because they enter maturation and, therefore, adulthood earlier. Conversely, delayed puberty commonly leads to individuals with high stature.“ Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) - člověk study for age at menarche in 4,714 women independent replication studies in 16,373 women „This allele was also associated with earlier breast development in girls; earlier voice breaking and more advanced pubic hair development in boys; a faster tempo of height growth in girls and boys; and shorter adult height in women and men in keeping with earlier growth cessation.“ LIN28B the first genetic determinant regulating the timing of human pubertal growth Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) – LIN28 •Důležitý v mikroRNA processingu (inhibuje Let-7). •Kontroluje růst a metabolismus. Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) – LIN28 •Zpět k mouchám •Deficience lin-28 vede k dřívějšímu zakuklení, menším a lehčím jedincům Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) – LIN28 •Zpět k mouchám •Overexprese lin-28 vede k větším jedincům a problémům při líhnutí (problémy v průběhu metamorfozy) Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) – LIN28 Let-7 deficience Caygill et al., 2008 Larval wandering pupation Buňky nejsou schopny „vystoupit“ z buněčného cyklu. Aspekty kontroly velikosti – Doba růstu (Growth duration) – LIN28B Let-7 overexpresse vede k zastavení vývoje v L1, L2 a vysoké letalitě => overexprese miRNA ve vestigial (vg) – wing-specific Caygill et al., 2008 Negativní regulace růstu * Apoptóza White et al., 1994 Aspekty kontroly velikosti – Velikost orgánů Orgány „vědí“ jakou velikost mají mít. A taky „vědí“, kdy mají přestat růst => autonomie co se velikosti orgánu týče. Koncept představen již v 70. letech. Silber, 1976 Aspekty kontroly velikosti – Velikost orgánů To samé platí pro octomilku. Imaginální disk křídla Ten stejný disk, kultivovaný in vivo v dospělci Bryant, Levinson, 1985 Aspekty kontroly velikosti – Velikost orgánů •Savci mají podobný tělní plán, ale velikost orgánů se dramaticky liší •Velikost není náhodná, ale je výsledkem důkladné regulace •Velikost orgánu se také musí přizpůsobit fyziologickým potřebám (při odebrání ledviny, ta druhá hypertrofuje) •Koordinace proliferace a buněčné smrti je klíčová pro správnou velikost orgánu. • Size was determined by integration of a limb-intrinsic “potential,” which was greater in tigrinum, and a systemic “regulator” more active in punctatum •Každý orgán má autonomní kontrolu velikosti (částěčně však podléhá i systémové kontrole) •Zdá se, že growth duration/timing je tím klíčovým Aspects of size control - Size of organs Aspekty kontroly velikosti – Velikost orgánů •Každý orgán má autonomní kontrolu velikosti •Link na minulou přednášku Aspekty kontroly velikosti – Velikost orgánů Koordinace proliferace a buněčné smrti je klíčová pro správnou velikost orgánu. Hippo Aspekty kontroly velikosti – Velikost orgánů - Hippo YkiS168A Dong et al., 2007 Aspekty kontroly velikosti – Velikost orgánů - Hippo A u savců? Dong et al., 2007 Aspekty kontroly velikosti – Velikost orgánů - Hippo Hippo a buněčná smrt BrdU TUNEL Overexprese YAP Aspekty kontroly velikosti – Velikost orgánů - Hippo BONUS: Hippo a rakovina Aspekty kontroly velikosti – Velikost orgánů – Hippo - závěr BONUS: Zpět k přednášce regulace velikosti •ARHGAP11B je pouze u lidí •Vznikl před cca 5 miliony let částečnou duplikací genu ARHGAP11A (Rho-GAP v jádře) •ARHGAP11B ale díky point mutaci ztratil tuto aktivitu a je lokalizován v mitochondriích, kde se účastní metabolismu glutaminu • •Zvýšené množství radiálních glií, neurálních prekurzorů neokortexu •Etika? •Opravdu tento gen oddělil člověka od primátů? “The cells amplified upon ARHGAP11B expression in fetal marmoset neocortex exhibited a marker signature consistent with the identity of basal radial glia.” 77 Závěr a otázky 78 •Kontrola růstu/velikosti Growth rate vs Growth duration + příklady (ne detaily) •Kontrola růstu/velikosti orgánů (Hippo) •Vědět, že existuje i negativní regulace. Děkuji za pozornost 79 Tomáš Bárta tbarta@med.muni.cz Tempo růstu Doba/délka růstu Regulace počtu buněk Regulace velikosti buněk X X