Fluorescenční metody
ve vědách o životě
Ctirad Hofr
NÁRODNÍ CENTRUM VÝZKUMU BIOMOLEKUL
lablifeB.org
1. Co je náplní přednášek?
2. Jaké budou praktické úlohy
v cvičení?
3. Kde se dají získané poznatky
využít?
4. Jaká bude organizace výuky?
První setkání v rámci předmětu
1/2
Proč spektroskopické metody?
• Poskytují kvantitativní údaje, což usnadňuje
srovnávání různých biologických systémů
Proč fluorescence?
• Umožňuje nám vidět pouhým okem,
co bychom jinak neviděli
1/3
1.Obsah přednášek I
• Absorbční a fluorescenční
spektroskopie v biologické
analýze molekul
• Vlastní fluorescence proteinů
• Časově ustálená a časově
rozlišená fluorescence
(Steady state,
Time-resolved) 1/4
Obsah přednášek II
• Zhášení fluorescence,
fluorescenční rezonanční přenos
energie - použití při sledování
interakce a strukturních změn
molekul
• Anizotropie fluorescence a její
změna při interakci makromolekul
1/5
Obsah přednášek III
• Nevlastní fluorescence fluorescenční
značky, sondy a
indikátory
• Fluorescenční značení DNA a
proteinů
• Analytické použití fluorescence
pro stanovení koncentrace
molekul
1/6
1/7http://is.muni.cz/el/1431/podzim2015/C7230/um/6053971/PBMEBuvod.html
5 8
Literatura
• Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence
Spectroscopy. Third Edition, Springer +
Business Media, New York, 2006.
• Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE
V NEUROVĚDÁCH
http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm
Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta
profesorem J.R. Lakowitzem.
Poděkování
2. Praktické úlohy
• Měření spektrálních charakteristik proteinů a nukleových kyselin
• Stanovení koncentrace nukleových kyselin a proteinů za použití fluorescence
a absorbční spektroskopie (kolorimetrie)
• Vliv pH a teploty na spektrální vlastnosti fluorescenčních sond
• Měření vlastní fluorescence proteinů
• Příprava fluorescenčně značeného proteinu
• Vizualizace makromolekul při elektroforetické separaci
• Využití fluorescenčního rezonančního přenosu energie (FRET) při
sledování hybridizace komplementárních řetězců nukleových kyselin
• Sledování změny intenzity fluorescence po relaxaci vlásenkové struktury
fluorescenčně značené DNA
• Fluorescenční mikroskopie (fluorescenční in situ hybridizace)
• Studium interakce molekul za pomocí anizotropie fluorescence –
vazba proteinu a fluorescenčně značené DNA
1/9
Fluorescenční metody ve vědách o životě
Schematické znázornění metodických přístupů použitých při praktické výuce předmětu
Příprava fluorescenčně značené DNA Při přípravě fluorescenčně
značené DNA se používá
gelová filtrace pro separaci
nenavázaného fluoroforu po
značení fragmentu DNA
Studium vazby DNA a proteinu
Anizotropie fluorescence
EmiseEmiseEmise
detektor
⊥
⊥
+
−
=
2II
II
r
ΙΙ
ΙΙpolarizátor
analyzátor
Snížení pohyblivosti po vazbě proteinu => pomalejší změna
uspořádání molekul => zvýšení anizotropie fluorescence r
Excitace
t~ns
0 5 10 15
0,20
0,25
0,30
F.Anisotropie
Protein c (M)
Vazebná
konstanta
K -> ΔG
nízká
anizotropie
vysoká
anizotropie
Experimentální uspořádání při měření
anizotropie fluorescence r
Záznam změny anizotropie
fluorescence r po vzájemné
vazbě proteinu a DNA
Fluorescenční mikroskopie
sledování hybridizace in situ
Metafazové chromozómy
po fluorescenční in situ
hybridizaci (FISH)
Fluorescenční emisní (A) a UV/Vis absorbční
spektrum (B) fluorescenčně značené DNA
Spektroskopická charakterizace
fluorescenčně značené DNA
A B
Real-time PCR
detekce amplifikace DNA
Emitor
Zhášedlo
F primer
R primer
Intenzita emitovaného záření je přímo
úměrná množství amplifikované DNA.
Vizualizace molekul při
elektroforetické separaci
Příprava fluorescenčně značeného proteinu
Při fluorescenčním značení se používá
gelová filtrace pro separaci
nenavázaného fluoroforu od značené
biomolekuly.
Výhody fluorescenčního
značení molekul
• není nutno pracovat s
radioaktivitou
• dlouhá životnost značení
• možnost kvantitativního
vyhodnocení množství DNA
• vysoká citlivost
1/11
UV/Vis absorbční spektrum (-)
Spektroskopická charakterizace
fluorescenčně značené DNA
fluorescenční emisní spektrum (-)
1/12
Vizualizace molekul při
elektroforetické separaci
Změna rychlosti putování v PA
gelu po vazbě proteinu na DNA
Jenom
DNA
protein
+ DNA
protein
fluorescenceCoomasiepřekryv 1/13
Real-time PCR
detekce amplifikace DNA
Zhášedlo
Emitor
F primer
R primer
1.Značená sonda se hybridizuje s komplementární
sekvencí. Záření Emitoru je zhášeno a není pozorováno.
2.Při polymerizaci dochází k nahrazení sondy novým řetězcem.
3.Při každém amplifikačním cyklu odštěpuje polymeráza
Emitor, jehož záření je detekováno
4.Polymerizace je dokončena. Intenzita emitovaného
záření je přímo úměrná množství amplifikované DNA.
1/14
Fluorescenční mikroskopie
sledování hybridizace in situ
Metafázové chromozómy po fluorescenční
in situ hybridizaci (FISH) 1/15
Fluorescenční anizotropie
polarizátor
analyzátor detektor
1/16
Princip sledování vazby
makromolekul
Excitace
nízká
anizotropie
vysoká
anizotropie
t ~ ns
Emise
1/17
Vazba proteinu na DNA
0,17
0,22
0,27
0,32
0 5 10 15
protein (M)
Anizotropie
K = 2 . 10-6 M
1/18
3.Kde se dají využít získané znalosti?
• Všude tam, kde se setkáte v praxi
s fluorescencí a fluorescenční spektroskopií
• Když máte vzorku málo pro klasické metody
detekce, zviditelníte si ho pomocí
fluorescence
• V každodenní laboratorní praxi
např. vizualizace biomakromolekul v gelu a pod mikroskopem
• V navazujících cvičeních C7235 !
1/19
Multicolor Detection:
Image
Stain Target Color
DAPI Nucleii Blue
BODIPY® FL phallacidin F-actin Green
MitoTracker® Red CMXRos Mitochondria Orange 1/20
Průtoková cytometrie - Flow Cytometry
Detekce každé buňky zvlášť
Rozdělení populace buněk podle
jejich velikosti a přítomnosti
fluorescenčních sond
1/21
Spektroskopie kolem nás
1/22
Fluorescence, kde bychom ji nečekali
Je tato fluorescence přírodního nebo syntetického původu?
1/23
Úlohy = případové studie
• Celkově 4 úlohy
• Za úlohy lze získat body, které se připočítávají
k testu u zkoušky
• V případě úspěšného splnění všech úloh
dostatek bodů pro vykonání ústní zkoušky
• Omezená doba možnosti řešení úloh 48 h
Datum praktického cvičení
Návrh termínu pro cvičení
14.-16.1.2019
1/26
Příště: Co všechno svítí na diskotéce?
1/27
Domácí úkol
• Naučit se komentovat video od 0:42 do 3:00
Introduction to Fluorescence
https://www.youtube.com/watch?v=SGFlr1jFNB
M&feature=youtu.be&t=42
1/28