Barevné principy absorpce a fluorescence Ctirad Hofr Fluorescenční metody ve vědách o živé přírodě 1 Světlo je elektromagnetické vlnění • Skládá se z elektrické složky a magnetické složky, které kmitají ve fázi v na sebe kolmých rovinách • Světlo je charakterizováno frekvencí f a vlnovou délkou λ • Frekvence f určuje kolikrát za sekundu vlnění kmitne, udává se v Hz = s-1 • Vlnová délka udává délku, kterou za jeden kmit světlo urazí, udává se v nanometrech nm = 10-9 m • Frekvence f a vlnová délka λ jsou spojeny vztahem c = λ f kde c je rychlost světla -vlnění (c=299 792 458 m s-1 ve vakuu) • Energie E = h f, kde h je Planckova konstanta (6.626 10-34 J s) 2 3 λ Animace elektromagnetického vlnění http://www.edumedia-sciences.com/a185_l2-transverse-electromagnetic-wave.html Elektromagnetická vlna z xy c = λ f c je konstanta, pak jestliže se zvýší vlnová délka, musí se snížit frekvence, aby byl součin konstantní. Vlnová délka λ je nepřímo úměrná frekvenci f E = h f Čím je větší frekvence, tím je větší energie záření. Čím je vetší vlnová délka λ, tím je menší energie záření. B E 4 Viditelné spektrum Z celého spektra záření je pouze malá část viditelná. Viditelné spektrum je ohraničeno vlnovými délkami 400 nm a 700 nm. http://science.hq.nasa.gov/kids/imagers/ems/visible.html 400 nm 7.5 1014 Hz 700 nm 4.3 1014 Hz 5 Intenzita Intenzita – počet fotonů procházejících v daném směru jednotkovou plochou za jednotku času 6 Absorpce • Látka pohlcuje světlo • Pro absorpci monochromatického světla • Lambert-Beerův zákon: Absorbance je přímo úměrná koncentraci a tloušťce vrstvy roztoku lc II ⋅⋅− ⋅= ε 100 I I lcA 0 10log=⋅⋅= ε ε=molární extinční koeficient látky, c-koncentrace, l-délka optické dráhy 7 Závislost absorbance na poměrné intenzitě dopad. a prošlého světla 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 I0/I Abs 8 Luminiscence • Emise světla z nějaké látky; nastává z elektronových excitovaných stavů Luminiscence se dělí na: 1.fluorescenci 2.fosforescenci Podle původu dělíme luminiscenci na 1.fotoluminiscenci 2. chemiluminiscenci 9 Fluorescence • Emise z excitovaných singletových stavů • Prakticky: fluorescenci pozorujeme během buzení a po jeho vypnutí rychle mizí • Doba dohasínání τ (Lifetime) je průměrný čas, který uplyne od excitace po emisi – je řádově 1 – 10 nanosekund • pozn. : světlo urazí za 1 ns 30 cm 10 Fosforescence • Emise z excitovaných (zakázaných) tripletových stavů • Prakticky: fosforescence má mnohem delší dobu dohasínání než fluorescence Doba dohasínání řádově milisekundy až sekundy pozn. : světlo urazí za tu dobu 300 až 300 000 km Komentovaný úvod -fluorofor 11 Jak poznáme flouorofor? • molekula je planární • aromatická: obsahuje konjugované vazby 12 13 Frank-Condonův princip o „lenosti jader“ při absorpci Absorpce fotonu elektronem (excitace molekuly) je velmi rychlý proces v řádu femtosekund (10-15s). Protože atomové jádro je mnohem těžší než elektron, během absorpce fotonu se nepohybuje. Po absorpci fotonu - excitaci se celá molekula nachází v nestabilním stavu („je horká“) a vibruje, aby se zbavila energie (a „ochladila se“). 14 Absorpce a emise energie molekulou Energie 0 1 2 0 1 2 Vzdálenost Základní stav Excitovaný stav 15 Zářivé a nezářivé přechody mezi elektronově vibračními stavy molekuly absorpce fluorescence fosforescence λ τ ≈ 10-15 s τ ≈ 10-8 s τ ≈ 10-3-100 s absorpce fluorescence fosforescence T1 S2 vnitřní konverze mezisystémová konverze S1 vibrační relaxace EnergieE=hf Vznik absorpčního=excitačního spektra 16 Výukový materiál společnosti Invitrogen Absorpční=excitační spektrum znázorňuje pravděpodobnost, že při dané vlnové délce dojde k excitaci fluoroforu dopadajícím světlem. Vznik emisního spektra 17 Výukový materiál společnosti Invitrogen Emisní spektrum,určuje pravděpodobnost, že dojde k emisi fluorescence o dané vlnové délce = barvě. Závisí na fluoroforu a je jeho charakteristikou. Závislost intenzity emise na excitační vlnové délce 18 Výukový materiál společnosti Invitrogen 19 Stokesův posun Emitované světlo má vždy menší energii (větší vlnovou délku) než je energie absorbovaného světla (menší λ). Rozdíl mezi maximem absorpčního a maximem fluorescenčního emisního spektra je specifická charakteristika daného fluoroforu. Vznik Stokesova posunu 20 Výukový materiál společnosti Invitrogen 21 Stokesův zákon Vlnová délka emitovaného světla je větší nebo rovna vlnové délce excitačního světla λem ≥ λex To je dáno tím, že po absorpci záření často dochází k částečné ztrátě energie (tepla) při přechodu z vyšších excitovaných elektronových stavů do metastabilního nejnižšího excitovaného stavu. λEx 520 nm λEm 560 nm 22 Stokesův posun Emise má vždy menší energii (větší vlnovou délku) než je energie absorbovaná (menší λ). Rozdíl mezi maximem absorpčního a maximem fluorescenčního emisního spektra je specifická charakteristika daného fluoroforu. 23 Experiment G. G. Stokese Slunce Modré sklo okna v kostele Propouští světlo s λ < 400 nm Excitační filtr Roztok chininu Sklenice vína Propouští světlo s λ > 400 nm Emisní filtr G.G. Stokes 1852, Cambridge 24 Po záměně filtrů – fluorescence mizí Při záměně filtrů , tj. jestliže dáme sklenici vína do dráhy slunečních paprsků, procházející světlo již nemůže roztok chininu excitovat. 25 Barevný animovaný úvod do principu fluorescence https://www.youtube.com/watch?v=SGFlr1jFNBM 26 Typické fluorofory Fluorofory nebo fluoreoscenční barviva jsou molekuly, které fluoreskují. Fluorescenci vykazují zejména aromatické sloučeniny (polyaromatické uhlovodíky nebo heterocykly). Typickými flourofory jsou například: •chinin (tonik) •fluorescein, rhodamin B (nemrznoucí směsi pro chlazení motoru, fluorescenční značení brzdové kapaliny) •POPOP (scintilátory) •Acridinová oranž, ethidium bromid (DNA) •umbeliferon (ELISA) •antracén, perylén (znečištění životního prostředí oleji) 27 Využití fluorescence v geografii 28J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition,Springer, 2006 29 Kvantový výtěžek Kvantový výtěžek Q je poměr počtu emitovaných a absorbovaných fotonů. Udává účinnost s jakou budící fotony vyvolávají fluorescenci. Kvantový výtěžek může být maximálně 1. Ve skutečnosti je nižší díky nezářivým přechodům molekul z excitovaného stavu. Největší kvantové výtěžky mají rhodaminové flourofory (~1) a fluorescein (0.95) http://www.iss.com/resources/reference/data_tables/FL_QuantumYieldStandards.html Charakteristické je snižování kvantového výtěžku s teplotouteplotní zhášení luminiscence 30 Excitační spektrum Závislost intenzity fluorescence na excitační vlnové délce při konstantní vlnové délce emitovaného záření λEm= konst.λEx scan 31 Emisní spektrum Závislost intenzity fluorescence na vlnové délce při konstantní excitační vlnové délce λEx= konst. λEm scan Spectraviewer 32 Neměnnost tvaru emisního spektra Tvar emisního spektra je nezávislý na vlnové délce excitace. Tento jev je důsledkem toho, že doba trvání excitovaného stavu a kvantový výtěžek složitých molekul v roztoku nezávisí na vlnové délce budícího záření NEzávislost tvaru emisního spektra na excitační vlnové délce 33Výukový materiál společnosti Invitrogen 34 Zákon zrcadlové symetrie mezi absorpčním a emisním spektrem Struktura vibračních hladin u základního a excitovaného stavu je stejná, proto absorpce a emise z odpovídajících si vibračních hladin může nastat se stejnou pravděpodobností. To má za následek zrcadlovou symetrii absorpčního spektra a emisního fluorescenčního spektra. Prakticky: při velmi malé koncentraci vzorku můžeme z flourescenčního emisního spektra zjistit jak vypadá absorpční spektrum, aniž by se použilo o několik řádů větší množství vzorku 35 Zrcadlová symetrie absorpčního a excitačního spektra Energie 0 2 0 2 0 1 2 0 1 2 Vzdálenost Abs Emis. 0 2 0 10 1 0 2 0 0 Vlnová délka λ Základ. stav Excit. stav 250 300 350 400 450 500 550 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Excitation Emission FluorescenceIntensity λ Quinine Solution 36 Flourescenční excitační a emisní spektrum reálného roztoku Při měření reálných vzorků se zrcadlová symetrie narušuje vlivem ionizace fluoforu při různém pH, komplexace fluoroforu s dalšími molekulami v roztoku, nebo jednoduchým příspěvkem dalších nefluorescenčních molekul k absorpčnímu (excitačnímu) spektru. 37 Literatura • Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. • Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem. Poděkování