4 1 Ctirad Hofr Ustálená fluorescence Steady State Fluorescence Fluorescenční metody ve vědách o živé přírodě 4 2 Ustálená fluorescence 1. Definice 2. Citlivost fluorescence na okolí 3. Vlivy na fluorescenční spektrum 4. Zhášení fluorescence 4 3 Ustálená a časově rozlišená fluorescence • Ustálená fluorescence (Steady State) se měří při buzení kontinuálním zářením a dostáváme potom časově průměrnou střední hodnotu intenzity nebo polarizace fluorescence. • Časově rozlišená fluorescence se měří pomocí pulzní excitace (délka pulzu je obvykle kratší než doba dohasínání fluorescence vzorku) nebo fázově modulovaného budícího záření a umožňuje analyzovat časové závislosti měřených parametrů, především anizotropie fluorescence. 4 4 Vliv prostředí na absorpční a emisní spektra V roztocích dochází vlivem elektrostatických interakcí dipól-dipól, nebo dipól-indukovaný dipól mezi molekulami fluoroforu a rozpouštědla k solvataci fluoreskujících molekul. Protože molekuly mají v základním a v excitovaném stavu obecně různé dipólové momenty i polarizovatelnosti, dochází při měření fluorescence v roztocích ke změnám v optických spektrech vlivem různé solvatace molekul. Doba potřebná pro molekulární relaxace (10-10s) je mnohem delší, než je rychlost elektronového přechodu - absorpce (10-15s) , ale obvykle kratší, než doba života excitovaného stavu (10-8s) . K emisi proto dochází ze stavu, kdy již bylo dosaženo rovnovážné konfigurace. Protože část absorbované energie se spotřebuje na relaxaci molekul rozpouštědla kolem molekuly fluoroforu v excitovaném i základním stavu, je energie emitovaného fluorescenčního záření menší, než by odpovídalo čistě elektronovému přechodu. Z. Fišar: http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm 4 5 Elektrický dipól • Je tvořen dvojicí nábojů o opačné polaritě ve vzdálenosti l • Dipólový moment µ = q . l vektor směřující od záporného náboje ke kladnému náboji Jednotkou je Debye; 1D = 3.3 x 10-30 C.m q+ q- µ l 4 6 Molekulové dipóly • Molekula je dipólem, když se rozložení kladného a záporného náboje nepřekrývá. V případě, kdy není molekula zrcadlově symetrická je rozložení náboje nepravidelné a molekula je dipólem. • Molekula, která má dipólový moment je polarizovaná. • Molekuly (zpravidla zrcadlově symetrické – CO2), které nejsou dipóly se jimi mohou stát, když se molekula nachází v elektrickém poli – vzniká indukovaný dipól. 7 Dipólový moment molekul Physical Chemistry Atkins and de Paula, Chapter 17 V případě, kdy není molekula zrcadlově symetrická je rozložení náboje nepravidelné a molekula je dipólem. 4 8 Interakce dipólů Polarizované molekuly upřednostňují uspořádání s minimální energií dipólů (head to tail) 4 9 Polarizovatelnost molekul • Schopnost molekul vytvořit indukovaný dipól vlivem elektrického pole • Velikost indukovaného dipólu je přímo úměrná intenzitě elektrického pole E • Indukovaný dipól µ∗ µ* = α E α je polarizovatelnost molekul Čím větší je polarizovatelnost molekuly, tím větší vliv elektrického pole na molekulu. 4 10 Změna dipólu při interakci molekul http://www.theochem.ruhr-uni-bochum.de/~axel.kohlmeyer/cpmd-vmd/part3.html 4 11 Interakční energie dvou dipólů • Interakce mezi dvěma dipóly µ1 a µ2 3 0 2 21 4 )cos31( r V πε θµµ − −= q2 q1 rl1 θ Pro dipól-dipólovou interakci je potenciální energie V závislá na vzájemné orientaci. Minimální energie je při θ = 0° přitažlivé interakce (opačné náboje jsou u sebe) θ < 54.7 ° Maximální energie je při θ = 90° odpudivé interakce (stejné náboje jsou u sebe) θ > 54.7 ° Nulová potenciální energie je při „magickém“ úhlu θ = 54.7° l2 -q2 -q1 Závislost potenciální energie na poloze dipólů 4 12 ve stupních 0 45 90 135 180 1-(cosx)^2 -2 -1 0 1 + - + - + + - + - + - 4 13 Interakce dipól-indukovaný dipól • Polární molekula s dipólovým momentem µ1 může indukovat dipólový moment v polarizovatelné molekule • Indukovaný dipól interaguje s permanentním dipólem první molekuly a dochází k vzájemnému přitahování • Indukovaný dipól (modré šipky) následuje změny v orientaci permanentního dipólu (žluté šipky) 6 0 2 2 1 r V πε αµ −= Co se stane s fluoroforem, když je v roztoku? 4 14 2015 Dyeing the Chicago River Green for St. Patricks Day - Time-lapse 4 15 Solvatace fluoroforu při absorpci a emisi v roztocích. V roztocích dochází vlivem elektrostatických interakcí dipól-dipól, nebo dipól-indukovaný dipól mezi molekulami fluoroforu a rozpouštědla k solvataci fluoreskujících molekul. Protože molekuly mají v základním a v excitovaném stavu obecně různé dipólové momenty i polarizovatelnosti, dochází při měření fluorescence v roztocích ke změnám v optických spektrech vlivem různé solvatace molekul. Doba potřebná pro molekulární relaxace (10-10s) je mnohem delší, než je rychlost elektronového přechodu - absorpce (10-15s) , ale obvykle kratší, než doba života excitovaného stavu (10-8s) . K emisi proto dochází ze stavu, kdy již bylo dosaženo rovnovážné konfigurace. Protože část absorbované energie se spotřebuje na relaxaci molekul rozpouštědla kolem molekuly fluoroforu v excitovaném i základním stavu, je energie emitovaného fluorescenčního záření menší, než by odpovídalo čistě elektronovému přechodu. 4 16 Faktory ovlivňující emisní spektrum a kvantový výtěžek • Polarita a viskozita prostředí (rozpouštědla) • Rychlost relaxace molekul rozpouštědla • Konformační změny flourescenční sondy • Neměnnost lokálního prostředí molekuly • Vnitřní přenos náboje (uvnitř molekuly) • Protonový přenos a reakce excitovaných stavů • Interakce sonda – sonda • Změny v rychlostech zářivých a nezářivých procesů 4 17 Vliv polarity rozpouštědla • Dipólový moment molekuly v excitovaném stavu µE je větší než v základním stavu µG • Po excitaci se molekuly rozpouštědla orientují (relaxují) okolo µE, což snižuje energii excitovaného stavu Čím větší je polarita rozpouštědla, tím větší je vliv orientace dipólů a tím větší energie se spotřebuje na jejich orientaci a zbude pak menší energie na emitované světlo, tj. tím vetší je jeho vlnová délka. 18 Interakce excitovaného fluoroforu a rozpouštědla Čím větší je polarita rozpouštědla, tím větší je vliv orientace dipólů, tím menší je energie emitovaného záření a tím větší je posun λ emitovaného světla. Nejcitlivější na polaritu rozpouštědla jsou fluorofory, které jsou samy polární. Nepolární fluorofory jsou méně citlivé. http://olympusmicro.com/primer/java/ jablonski/solventeffects/index.html 4 19 Závislost dipólového momentu na tvaru molekul Změna dipólového momentu je větší u delších fluoroforů Aminonaftalenové deriváty s fenylovou skupinou vykazují větší citlivost na rozpouštědlo a větší dipólové momenty v excitovaném stavu pravděpodobně díky větší separaci náboje podél delšího aromatického systému. Změna dipólového momentu po excitaci je větší u delších molekul. 4 20 Rozdíl vlivu polarity rozpouštědla na absorpční a emisní spektrum Se zvyšující se polaritou rozpouštědla se mění fluorescenční spektrum mnohem více než absorpční spektrum. ABS Zvyšování molární koncentrace metanolu v hexanu v rozsahu 0-340 mM (0 -> 6) Absorpční spektrum 2-acetylantracenu v čistém hexanu (0), 200mM roztoku metanolu v hexanu (1) a čistém metanolu (2). 2-acetylantracen 4 21 Sondy na sledování polarity okolí • Přidání polárních skupin k fluoroforu zvyšuje jeho citlivost na polaritu rozpouštědla • Přidání polárnějších skupin také zvyšuje Stokesův posun Deriváty DOP (2,5-difenyloxazolu) a jejich emisní spektra Větší vzdálenost polárních skupin způsobuje posun emisního spektra do červena. 4 22 Proč je emisníní spektrum citlivější na polaritu prostředí než absorpční spektrum? • Protože absorpce je rychlejší než emise a ta je zase pomalejší než relaxace molekul • časová posloupnost: Absorpce (10-15s) -> relaxace okolí (10-10s) ->emise (10-8s) • absorpce nemůže zachytit změny v lokálním prostředí molekuly, protože proběhne rychleji než k nim dojde • před absorpci a po ní je okolí molekuly stejné • naproti tomu při emisi už je molekula fluoroforu obklopena relaxovaným (změněným) prostředím 4 23 Závislost emisního spektra na polaritě rozpouštědla Podle zvyšující se polarity: H – hexan CH- cyklohexan T- toluen EA – etylacetát Bu – n-butanol polarita 4 24 Praktická ukázka • Prodan (N,N-Dimethyl-6-propionyl-2-naphthylamine) O CH3 N CH3 CH3 C - Cyklohexan D - dimetylformamid E - Etanol CH3CH2OH V - Voda H2O Bu - n- Butanol CH3CH2CH2CH2OH G – Glycerol OH OH OH N CH3 CH3 O H polarita 4 25 Změna emisního spektra po vazbě molekul ANS na HSA Prodan na protein DAPI na DNA EtBr na DNA Citlivosti fluorescenčních sond na okolní prostředí se využívá při sledování vazby a kvantifikaci množství biologických molekul. Kvantový výtěžek se často zvyšuje při vazbě fluoroforů na proteiny nebo DNA. Toho se využívá při sledování vazby. 4 26 Zvýšení intenzity fluorescence ANS po vazbě na lidský sérový albumin ANS (1-anilinonaftalén-8-sulfonát sodný): • MW = 321,33 • rozpouštědlo pro zásobní roztok: dimetylformamid (DMF) • rozpouštědlo pro spektroskopická měření: metanol (MeOH) • dlouhovlnné absorpční maximum v metanolu: λexmax = 372 nm (molární extinkční koeficient: 7800 cm-1M-1) • fluorescenční emisní maximum v metanolu: λemmax = 480 nm • kvantový výtěžek fluorescence je závislý na okolním prostředí a je zvláště citlivý na přítomnost vody; emise je závislá na rozpouštědle • podrobný popis vlastností ANS lze nalézt v práci [Slavík J.: Anilinonaphthalene sulfonate as a probe of membrane composition and function. Biochim. Biophys. Acta 694, 1-25 (1982)] Změna polarity prostředí se projeví změnou intenzity emise ve viditelné oblasti spektra 4 27 Co se stane, když se naváže PRODAN na BSA? Posune se maximum vlnové délky z 520 nm na 460 a přesto, že se zvýší intenzita emise, nepozorujeme ji, protože oko má nižší citlivost na světlo s λ=460 nm. Postupnou vazbu PRODANu na BSA lze lépe sledovat jako úbytek emise volného fluoroforu 460 nm 520 nm Samotný PRODAN PRODAN + BSA Citlivost oka 4 28 Vazba DAPI na DNA • DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole ) • Ex. 355 nm / Em. 461 nm • Vazba do malého žlábku • Největší nárust intenzity při vazbě v blízkosti AT bohatých oblastí • Použití při značení DNA u preparátů pro fluorescenční mikroskopii (citlivost řádově ng DNA) 4 29 Vazba EtBr na DNA Vlastnosti sondy • MW = 394,31 • dobře rozpustný ve vodě • ve vodě fluoreskuje málo, po navázání k DNA se fluorescence zvyšuje asi 30 krát • doba dohasínání fluorescence ve vodě je asi 1,7 ns, po vazbě k dvouřetězcové DNA se zvyšuje na 20 ns • vazba k DNA se uskutečňuje interkalací (vmezeřováním) rovinného aromatického kruhu mezi páry bazí dvouřetězcové DNA • absorpční maximum v DNA: λexmax = 523 nm • fluorescenční emisní maximum v DNA: λemmax = 604 nm • citlivost: na gelu lze detekovat řádově ng DNA 4 30 Další mechanismy spektrálního posunu • Vodíkové můstky v rozpouštědle • Vnitřní přenos náboje (uvnitř molekuly) • Rychlost relaxace molekul rozpouštědla • Interakce sonda – sonda • Konformační změny flourescenční sondy • Změny v rychlostech zářivých a nezářivých procesů Čárkované šipky znamenají, že přechody mohou být zářivé nebo nezářivé 4 31 Vliv teploty na emisní spektrum • Snížení teploty zpravidla způsobuje zvyšování viskozity rozpouštědla a tím se zvyšuje také čas potřebný k orientaci molekul rozpouštědla • Čím nižší je teplota, tím méně molekul se vrací do základního stavu s relaxovanými okolními molekulami rozpouštědla – tím méně se energie spotřebovává a tím je posun menší 4 32 Závislost emisního spektra na teplotě Snížení teploty prodlužuje čas potřebný k relaxaci rozpouštědla. Snížení teploty má podobný vliv jako snížení polarity rozpouštědla. 4 33 Interakce sonda-sonda excimerová fluorescence Molekuly fluoroforu mohou se sebou vzájemně vytvářet excitovaný komplex excimer. Excimer je zkráceně excitovaný dimer. V případě dvou různých molekul se jedná o exiplex. Pro vytvoření excimeru je nutné, aby byly molekuly v kontaktu. Emisní pás excimerové fluorescence je posunut k delším vlnovým délkám ve srovnání s fluorescencí izolovaných molekul. 4 34 Použití excimerů při detekci inserčních mutací DNA •Oligonukleotid s připojenými pyrenovými zbytky na místě jedné báze •Když se váže na WT nemutovanou DNA, jeden pyrenový zbytek se interkaluje, druhý je vně dvoušroubovice •Když se váže na DNA s mutací, která obsahuje jednu bázi navíc, dojde k vytvoření excimeru. •Excimerová emise ukazuje, že se jedná o inserčního mutanta 4 35 Zhášení fluorescence • Zhášení fluorescence lze definovat jako bimolekulární proces, který snižuje kvantový výtěžek fluorescence (tzn. intenzitu fluorescence) beze změny fluorescenčního emisního spektra. Může být důsledkem různých procesů. • Srážkové (dynamické) zhášení nastává, když je fluorofor v excitovaném stavu deaktivován (tj. navrací se nezářivě do základního stavu) při srážce s molekulou zhášedla. Molekuly nejsou při tomto procesu chemicky změněny na rozdíl od • statického zhášení, kdy se po kontaktu fluoroforu a zhášedla vytváří nefluorescenční komplex. • Samozhášení je zhášení fluoroforu jím samotným; nastává při jeho vysokých koncentracích nebo při vysoké hustotě značení. 4 36 Dynamické zhášení Snížení intenzity fluorescence dynamickým zhášením je popsáno Sternovou-Volmerovou rovnicí: F0/F = τ0/τ = 1 + kq τ0 Cq kde je F0 – kvantový výtěžek fluorescence za nepřítomnosti zhášedla, F - totéž za přítomnosti zhášedla o koncentraci Cq, τ0 – doba dohasínání fluorescence bez zhášedla, τ - doba dohasínání za přítomnosti zhášedla, kq – bimolekulární zhášecí konstanta (= bimolekulární rychlostní konstanta určená difúzí vynásobená účinností zhášení). Hodnota kq udává koncentraci zhášedla, při které se sníží intenzita fluorescence na polovinu. Nejčastějším zhášedlem fluorescence i fosforescence je molekulární kyslík (O2). Dále fluorescenci zhášejí (v důsledku mezisystémové konverze) atomy halogenů jako je bróm a jód. Často používaným zhášedlem je také akrylamid. 4 37 Statické zhášení • Vytváří se komplex fluoroforu a zhášedla, který už nefluoreskuje • Platí pro něj také Sternova-Volmerova rovnice: F0/F = 1 + Ka τ0 Cq Kde Ka je asociační konstanta fluoroforu a zhášedla Typickými statickými zhášedly jsou: Báze nukleových kyselin Nikotinamid Těžké kovy Guanin 4 38 Rozdílná závislost dynamického a statického zhášení • Oba druhy zhášení ukazují stejnou závislost na koncentraci zhášedla. • Při statickém zhášení se pouze „zneviditelní“ část fluoroforů, které vytvoří komplexy. Nemění se doba dohasínání fluorescence τ. • Při dynamickém zhášení se doba dohasínání mění τ0>τ Statické zhášeníDynamické zhášení 4 39 Závislost obou druhů zhášení na teplotě • Dynamické zhášení se s rostoucí teplotou zvyšuje. Zvyšuje se pohyblivost molekul zhášedla, které takto za stejný čas „uhasí“ více molekul fluoroforu. • Statické zhášení se s rostoucí teplotou snižuje, protože dochází snadněji k disociaci slabě vázaných komplexů flouroforu a zhášedla. Statické zhášeníDynamické zhášení 4 40 Využití zhášení při lokalizaci fluoroforu V membráně • Jestliže je fluorofor P1 zanořen v membráně, je pro zhášedlo Q nedostupný a ke zhášení téměř nedochází. • S rostoucí koncentrací zhášedla se intenzita fluorescence téměř nemění. Na povrchu • Jesltiže je fluorofor P2 na povrchu, dochází k účinnému zhášení. • S rostoucí koncentrací zhášedla intenzita fluorescence velmi výrazně klesá. Zanořen v membráně Vystaven na povrchu 4 41 Literatura • Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. • Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R.Lakowitzem. Poděkování