Fluorescenční značení
molekul
Pokročilé biofyzikálni metody v experimentální biologii
Ctirad Hofr
Oddělení funkční genomiky a proteomiky
Masarykova univerzita. Přírodovědecká fakulta Brno, Česká republika
5.12.2007
1
Nevlastní fluorofory
fluorescenční značky - přidávají se ke studovanému vzorku a vážou se na něj kovalentně. Vážou na proteiny a nukleové kyseliny přes aminové, sulfhydrylové nebo histidinové boční řetězce a thiolové skupiny.
fluorescenční sondy - vážou se na studovaný vzorek nekovalentně a po vazbě mění svoje fluorescenční vlastnosti (např. intenzitu, polohu em. maxima)
Kovalentní vazba
využívá se chemické reakce derivátu fluoroforu, během které se vytváří kovalentní vazba s biomolekulou
Nekovalentní vazba
fluorofor s váže na biomolekulu prostřednicvím nekovalentních (např. elektrostatických) interakcí
Fluorogenní reakce
využívá se chemické reakce, při které se nefluorescenční prekurzor mění na fluorofor
Vznikají reakcí karboxylové kyseliny a alkoholu
R-c'       +   R'-OH -►  R-c'      + H2°
O-H O-R'
karboxylová kyselina        alkohol ester
11
4
Amidy vznikají reakcí esteru s aminem
R-C
O
+ H2N-R"
R-C
O
O-R'
N-R"
ester
amin
amid
11
5
eakce esterů při kovalentím značení molekul s NH2 skupinou
11
STP Ester Ri"-C-N
SuccInimkJyl Ester
O i11
O
i" 2
HO
SO,
Carboxamide
O
R1C—NHFt2
Carbuxamide
Využívá se reakce esteru s aminem za vzniku amidu
TFP Ester
eakce karboxylové kyseliny značky Alexa 488
s NH2 skupinou proteinu
Jak přidat NH2 skupinu k DNA?
Rovnou při syntéze oligonukleotidu se připojí alyfatický řetězec zakončený NH2 skupinou (amino-linker)
o
o
Modifikace 5' konce amino linkerem o=p-o°h
Značení DNA přes NH2 skupinu
Rhodamine Red™-X, succinimidyl ester
DNA s „amino-linkerem"
DNA značená Rhodaminem Red-X a
Reakce isothiokyanátu s primárním aminem
s
R1N=C=S    +   R2NH2 -^ R1NH-C-NHR2
Isolh iocy anate Thiourea
Reakce chloridu sulfonové kyseliny s aminem
R1S02CI      +      R2NH2 -R1^—NHR2    + HCI
Su IfonyI chloride Su Itonamicte
11
11
Připojení přes SH thiolovou kupinu za vzniku thioether
Rl' XR2
• Thioether je podobný esteru, jenom je O nahrazen S
• Thioether vzniká reakcí alkylačních činidel (např.halogenů, maleimidů) s thioly (obsahují SH skupinu)
12
Reakce při kovalentím značení s
Reakce thiolové skupiny s maleimidem za vzniku thioetheru
Dvojná vazba maleimidu reaguje s thiolovou SH skupinou za vzniku thioetheru
,1
o
K
r-n i
o
o
+ ftsh
r1-n
sr
O
Maleimide
Thioether
11
13
Další reakce pro značení molekul
se skupinou S
Disulfidy
R1S-SR1  + R2SH
R1S-SR2  + R1SH
Symmetric disulfide
Mixed disulfide
lodoacetamidy ?
11
14
DNA může být kovalentně značena bez připojení NH2 skupiny při syntéze
Využívá se reaktivity N7 guaninu s platinovými komplexy
Platinový komplex obsahuje fluorescenční značku, která je po reakci kovalentně připojena ke guaninu
15
Chromatografie (protein) gelová filtrace
Srážení (DNA)
•   A)Receptor-protein -
fluorescenční značka nebo sonda je připojena k moleklule, která má vysokou afinitu k receptoru (avidin - biotin)
B) Vazba zprostředkovaná enzymem - fluorofor je připojen k substrátu, který může být kovalentně navázán na peptidový „tag" proteinu prostřednictvím dalšího proteinu -enzymu
C) Značka původně nefluoreskuje. Po její vazbě k „tágu" dochází k aktivaci fluorescence (fluorogenní reakce)
http://www3jnterscience.wilev.com/cqi-bin/fulltext/114262216/HTMLSTART
17
uoroaenní detekce
on™
o
Donor
HO
In vivo labeling of (3-gal by a fluorogenic probe with spectral change. The labeling is proposed to take place in two steps. The first step involves O-galactoside bond cleavage, which generates an active intermediate quinone methide. This intermediate is susceptible to nucleophilic attack by a nearby amino acid residue, which leads to covalent attachment of the FRET donor (D) to the enzyme and displacement of the acceptor (A).
11
http://www3.interscience.wilev.com/cgi-bin/fulltext/114262216/HTMLSTART
18
- Target DNA
Sequence complementary to
target DNA
-n.....n.....r—
Hybrid
Ruorophore Quencher
Beacon zn. angl.signální oheň, lampa (ne slanina)
DNA beacon sestává z molekuly DNA, která je schopna tvořit vlásenkovou strukturu
DNA má na jednom konci připojen fluorofor a na druhém jeho zhášedlo
Při hybridizaci s komplementární DNA dochází k oddálení zhášedla a následné emisi fluorescence
11
19
Struktura a vlastnosti „DNA beacon"
100
EDANS
25   35  45 55   65 75 Temperature l°C)
Při zvyšování teploty dochází k tání struktury vlásenky, což se projevuje vzrůstem intenzity fluorescence
Pozn. V případě Dabcylu byla zjištěna neočekávaná schopnost zhášet široké spektrum fluoroforů bez ohledu na míru překryvu spekter. Důvodem pro toto univerzální zhášení je pravděpodobně vytváření nefluorescenčního komplexu Dabcylu s fluoroforem. Každopádně je to výhodné, protože jedno zhášedlo může být použito pro celou řadu fluoroforů.
Použití Dabcyl-Fluorescein páru na „DNA beacon" ke sledování PCR
cycle number
11
21
"5-   T 6GTCTT CTT-3'
5-C T GGTGTT CTT-3'
5-C T GGT-TT CTT-3' _i_i_
5 10 TIME Iminutes)
15
• V případě, že dojde k hybridizaci s DNA, která se liší i pouze v jednom nukleotidu, nedochází k nárůstu signálu fluorescence
• Vysoká citlivost a poměr on/off signálu v přítomnosti / nepřítomonsti komplementární DNA
22
Hybridizace v sousedních oblastech
Donor beacon
Acceptor beacon
ExonS Target        Ex an 7
5 -TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATGACCACAGTCCATGCCATCAC TGCC ACCC A -3' ,NA(: '. TGAG GGT
Oobeyl
Cy3 FAM
Acceptor Beacon
Donor Beaton
Y* E' Dobcyl
500      525     550     575     600 625 EMISSION  WAVELENGTH (nm)
650
Výhodné uspořádání ke snížení falešně pozitivních výsledků
Používají se dvě vlásenky
Jedna vlásenka obsahuje donor a druhá akceptor FRET
Bez cílové DNA jsou oba fluorofory ve vlásence zhášeny
V případě, že dochází ke správné hybridizaci s cílovou DNA, je pozorován FRET
Když se hybridizuje pouze jedna vlásenka, dochází sice ke zvýšení intenzity, ale nezvyšuje se FRET
Tak se zvyšuje specifita analýzy
23
11
Optické a fluorescenční zobrazení ledvinových buňek
Zvyšování intenzity fluorescence „DNA beacon" proti mRNA pro ß-actin prokázalo zvýšení koncentrace mRNA a tedy zvýšení produkce ß-actin u
24
11
FISH (fluorescence in situ
ybridization)
Metaphase chromosomes
DNA Probes
glass slide
Hybridization
M //J L n
Fluorescence detection
DNA ve formě metafázových chromozomů je vystavena hybridizaci s fluorescenčně značenou DNA sondou
DNA sonda má sekvenci komplementární k cílové DNA na chromozomu
Po hybridizaci je část obsahující cílovou DNA lokalizována na základě fluorescence
25
Fluorescenční deoxyribonukleotidy
FISH příklady
Chromozomy, které byly hybridizovány s fluorescenčně značenými sondami
Chromozomální DNA byla nespecificky obarvena DAPI
Radioaktivní sekvenování
T N J
g' ssDNA of Unknown Sequence 3'
I    I    I   I    I   I   I    I   I   ]   I   I    I    I   I I
G   C   G   G   T       CCG       A   G   C   G C
G C
I    I   I I
DNA   polymerase 1 3' S .
Labeled '
+ k dNTPs primer + 4ttdNTPs
dd TP.
ti
o
<
ddTTP.I   í d TP
dd TP
S'
G G T
1/1
3'
Prvotní sekvenování používalo radioakativně značený primer
Primer byl prodlužován podle sekvenovaného řetězce DNA polymerázou
Ve směsi normálních nukleotidů (dNTP) byl přidán vždy jeden typ (ddNTP), který zabraňuje dalšímu prodlužování syntetizovaného řetězce
Takto vzniká směs řetězců DNA s proměnlivou délkou končící vždy daným ddNTP
Každá reakční směs pro daný ddNTP byla analyzována v jedné elektroforetické jamce (celkově ve 4 jamkách)
Sekvence byla stanovena z polohy pásu příslušného ddNTP na gelu
O"      O" O"
I      I I
"O- P- O- P - O- P - O- CH2
5'
O O
Phosphate group
Not available for -phosphodiester bond formation
4*
H
3'
3'
Fluorescent Probe 1
Pyrimidine or Purine base
H
1*
H 2'
Pentose sugar
ddNTP
H
dNTP Hydroxy I group in DNA
OH
Dideoxynukleotid-trifosfát ddNTP
v poloze 3' u ribózy je zaměněna OH skupina za H, což zamezuje dalšímu prodlužování řetězce DNA
11
29
Fluorescenční značení zrychli
, ssDNA of Unknown Sequence , i   I   I   I   I   I   I   I   I   I   1   I   I   I   I 1
G  C   Ď  G T
C   C G
DNA polymerase I + 4 ddNTPs + 4 fluorescent ddNTPs
OJ
O
V
TJ
E
<
G   C   G C G  C   G T
I    [   1 I
3' 5' Unlabeled primer
5'
I G-505
I C-519
T-526
"O
c a i_
a c
'5i i.
o
o c
Použití 4 fluorescenčních značek umožnilo použít pouze jednu dráhu v gelu k identifikaci všech nukleotidů
Fluorescenční skenování umožnilo dokončit projekty sekvenace genomu celých organismů ve výrazně kratší době
3'
Fluorescenční značky pro
sekvenaci
h3c
ch3 l-l
T-526
■'ho.PjO-i^oJ
CH,0 K\
-n
4Q0
G-505
POT
1.0
u
u
u
0,2
iteo
440
480
520
560
i \ TERMINATORS
S20 560 WAVELENGTH í flíYll
Připojení značky přes acetylénovou trojnou vazbu Všechny značky se excitují jedním laserem (488nm)
A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides
JM Prober, GL Trainor, RJ Dam, FW Hobbs, CW Robertson, RJ Zagursky, AJ Cocuzza, MA Jensen, and K Baumeister Science 16 October 1987 238: 336-341
Sekvenování DNA
Nejčastější sekvenační primer M13:
5'- gTA AAA CgA Cgg CCA gTg -3,
http://www.wilev.com/college/pratt/0471393878/stu dent/animations/dna sequencing/index.html
Literatura
Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006.
Fišar Z.: fluorescenční spektroskopie
v neurovědách
http://www1 .If1 .cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm
oděkování
Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem.
11
34