Osnova 2. přednášky • Základní charakteristiky kvasinek -Taxonomie, evoluce - Podmínky růstu, růstové formy, sporulace ... • Morfologie buněk, kolonií... sekrece -Amoniak - Aglutininy, flokulace -Adhesiny, invasiny - Killer toxiny Srovnání mikroorganismů Mikroskopické jednobuněčné organizmy... Bakterie Kvasinka Četnost v lidském mikrobiomu 99% <1% Velikost buňky 1um 10um Buněčná stěna peptidoglykan, LPS, LTA chitin, mannan (PPM, PLM), glukan pH 6,5-7,5 4,5-6,5 Teplota 10-80 20-30 Rezistence na antibiotika Ne Ano Přenos genetického materiálu Jádro Ano Ne Ne Ano LPS - lipopolysacharid, LTA - lipoteichoová kyselina PPM -fosfopeptidomannan, PLM - fosfolipomannan Taxonomie kvasinek - Kvasinky se řadí do domény (nadříše) Eukarvota, říše hub (ačkoliv jsou to mikroskopické jednobuněčné organizmy) - netvoří žádnou přirozenou taxonomickou skupinu (nemožné je jednotně definovat) - roztroušeny ve dvou odděleních hub: houby vřeckovvtrusné nebo stopkovvtrusné (asko-, basidio- a deuteromycetes + kvasinkové mikroorganismy) - 1500 identifikovaných (odhad o několik řádů vyssi) Saccharomyces cerevisiae: nadříše > Eukaryota říše_> Funai (houbv)_ oddělení > Ascomycota (vřeckovýtrusé) pododdělení > Ascomycotina třída řád čeleď rod druh („laboratorní kmen") ■ir.iV.t-: i. II photosynShĚSiie norwnotile sexual iTiyi!i(wiiu:ai , i ingest V>- sexual multicsílular aňsůrí) ntnrnot>le sexual (hemi) Ascomycetes > Saccharomycetales (kvas i n kotva > Saccharomycetaceae > Saccharomyces > Saccharomyces cerevisiae 4 wikipedie Hedges, Nat Rev Genet, 2002 Kvasinky netvoří žádnou přirozenou taxonomickou skupinu - jsou roztroušeny ve dvou odděleních hub, buď jako houby vřeckovvtrusné nebo stopkovvtrusné pododdělení/třída: oddělení i—Pezizomycotina (47,000 spp.) jJl— Saccharomycotina {300 spp.) '— Taphrinomycotina (120 spp.) _ j—Urediniomycetes (8,000 spp.) \r" Ustilaginomycetes (1,500 spp.) I tymenomycetes (20,000 spp.)_ -Glomates (160 spp.) Zygomycetes/Mucorales (700 spp.) Chitridiomycota (900 spp.) říše hub: Ascomycota (47,420 spp.) Basidiomycota (29.500 spp.) r-C 670 i 70 1,090± SO Většina využívaných kvasinek je z třídy (hemi)ascomycetes 1.140± V210± na Aspergillus nidulans (aspergillus) Eurotiornycetes (plettomycetesí Ipyrenomycetes) PentciWum cnrysogenum (penicillin fungus) Coccidtoides immAis (cctcckJioidomycosis fungus) Fusarium graminearurn Sordariomycetes (head scab fungus) Neurospora crassa (orange bread mould) Magnaponhe grisea (rice blast fungus) Yanowia lipoidica (yarrowia yeast) Saccharomycotina (Hemiascomycetes) Saccnaromyces cerevisiae — 340 ± (baker's yeast) Candida albicans (patfiogenic yeast) Co .Q70± BO 03 C ■t—' O o >, E o N N CD CL Hedges, Nat Rev Genet, 2002 Schizosaccharomyces Ta p hrin om y c otina pombe (fission yeast) (Archiascomycetes) Pneumocystis carmii (pneumonia fungus) Mcrobotryum violaceum Urediniomycetes (anther smut fungus) UsMago maydis Ustilaginomycetes (com smut fungus) Phanerochaele Hymenomycetes chrysosporium (wftiEe rot fungus) Aqaricus bisporus Cryptococcus neoformans Tremellomycetes < 6 Taxonomie kvasinek Většina rodů využívaných kvasinek je z třídy (hemi)ascomycetes mezidruhová vzdálenost Dujon, TiG, 2006 ■ I B o o o Ü co < I r n I tí EuascoDT/cetes Archiascornycetes Basidiomycota Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces paradoxus Saccharomyces mikatae Saccharomyces kudnavzevii Saccharomyces bayanus Saccňaronr/ces etigjos Saccharomyces servazzii Saccharomyces castellii Candida giabraia Zygosaccharomyces rouxii Kluyveronryces thermotolerans KUiyveromyces waM 1 Saccharoniyces kluyven Kluweromvces lactis Kkjyveromyces marxianus -4 Ashbya goasypii { i Pichia arygusta Debaryornyces hansenn Pichia sorbitophila Candida guilliernrondii Candida hmitaniae Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida albicans Candida dubliniensis Yarrowia lipolytics Pivo, víno Chleba Lidský Patogen Xerotolerant Využívá laktózu Rostlinný Patogen Halotolerant Lidský Patogen Využívá alkany rody: Saccharomyces Kazachstania Naumovia Nakaseomyces Zygosaccharomyces Lachancea Kluyveronryces Eremothecium Clade 2 Clade 1 (Neurospora. Magnaporthe, Aspergillus. Podospora, etc) Schizosaccharomyces pombe Pivo Cryptococcus neoformans Lidský patOgeil Srovnání průměrná^% shody sekvence proteinů v taxonech Hemiascomycotina a Chordata Vychází převážně z analýzy rDNA; nověji srovnáním rozdílů sekvencí aminokyselin v ortologních proteinech. Přes velkou morfologickou ^ podobnost vykazují kvasinky velké rozdíly v genomech Genomy (sekvence) kvasinek g ze vzdálenějších větví fylogenetického stromu se srovnávají těžko Yanowia lipolytics Debaryomyces — hansenn Kluyveromyces lactis ■ Ciona intestinalis Candida glabrata ■ 60 70 Saccharomyces uvarum-*- 80 90 Saccharomyces paradoxus 3 Saccharomyces cerevisiae Takifugu rubripes Tetraodon negrovihdis ■ Gallus gallus 100- -Mus muscutus Homo sapiens Dujon, TiG, 2006 % odlišnost sekvence proteinu: - S. cerevisiae a C. glabrata ~ člověk a ryba - mezi druhy S. sensu stricto ~ mezi řády savců - proteiny člověka a hlodavců jsou si více podobné (lze rekonstruovat změny, jimiž genomy během evoluce od společného předka prošly) než proteiny druhů ze skupiny sensu stricto, mezi nimiž mohou vznikat životaschopné hybridy! rozdí| mezj s c a & je cca 300MYA Potřebují vodné prostředí, kyslík a živiny volná voda (nikoli chemicky vázaná) - Vodní aktivita = volně přístupná voda/fyziologicky využitelná voda = available water (aw) aw = poměr tlaku vodních par nad substrátem a tlaku par destilované vody Bakterie vyžadují vyšší hodnoty a^ (víc dostupné vody) než kvasinky a plísně (z toho důvodu např. chléb napadají plísně, nikoliv bakterie) Aktivitu vody lze snížit proslazováním nebo solením (marmelády, nasolování masa - lze takto potlačovat i bakteriální kontaminace v kvasinkových kulturách) Xerotolerantní kvasinky rostou i za zvýšeného osmotického tlaku - (aw=0.65), rod Zygosaccharomyces (rouxii, bailii, bisporus) - rostou přednostně v potravinách s vysokým obsahem cukru či solí; ostatní (S. pombe, Debaryomyces hensenii, Hansenula anomala) vyšší osmotický tlak tolerují, ale lépe rostou za standardních podmínek (více polyolu, ATPázove pumpy), Lipomyces mají pouzdro - při zvýšené koncentraci solí upravují jeho složení Test: schopnost růstu na 50-70% glukose (většina pouze do 40 %) nebo na 10% NaCI - 0,95: Pseudomonas, Escherichia,..., většin a bakterií - 0,85: kvasinky (Candida, Toru lops is, Hansenula) - 0,75: většina halofilních mikroorganismů - 0,65: xerofilní plísně {Aspergillus) - 0,4: potlačení růstu veškeré mikroflóry Debaryomyces hensenii Podmínky růstu - kyslík - Většina kvasinek je obligatórne aerobní (vyžadují aspoň stopová množství kyslíku nezbytného pro syntézu některých esenciálních metabolitů -ergosterol, nenasycené mastné kyseliny) - fermentativní typy {Saccharomyces c, S. p.) - pro fermentaci jsou vhodnější anaerobní podmínky, ale S.c. i v aerobních podmínkách fermentují - respirativní typy - převládá energeticky výhodnější respirace nad fermentací - nefermentativní typy (nemají alkoholdehydrogenásu -neprodukují ethanol) - rody Lipomyces, Cryptococcus, Saccharomycopsis - teploty, při nichž mohou kvasinky růst: - mezofilní (0 - 48 °C) - většina druhů - psychrofilní (-2 - 20 °C) - voda, půda v Antarktidě (některé Leucosporidium, Cryptococcus) - termofilní (ne méně než 20 °C) - potenciální patogeny {Candida, Cyniclomyceš) Maximální teploty, které (některé) kvasinky přežívají, se pohybují kolem 57-59 °C Laboratorní podmínky 25-30 °C (S.c. i S.p. - rostou i při 15°C a přežívají krátkodobě 50°C), teplotně senzitivní mutanty (ts, 37°C), chladově sensitivní mutanty (cs, 20°C) Živiny • Nejčastějším zdrojem uhlíku a energie jsou mono-, di- a oligosacharidy (některé jsou schopny hydrolyzovat i polysacharidy jako škrob, xylany či celulózu ... nebo methanol (Pichiapastoris). alkany (Y lipolytica) apod. • Nepreferovanějším cukrem S.c. je glukóza (represe ostatních) • Zdrojem dusíku jsou amonné ionty a aminokyseliny Laboratorní podmínky: YPD/YES - bohaté médium = 10g/I yeast extract, 20g/l pepton, 20g/l dextrose (2%glukosa)/ S. pombe supplements: A, U, H, L, K Sabouraudův agar (1892) = 10g/I pepton, 40g/l dextrose (4%glukosa), 20g/l agar, pH 5.6 Syntetické SD médium = 6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids (aminokyseliny se přidávají dle potřeby), 20g/l dextrose (2% glukosa) - např. SD-L,T pro Y2H system Minimální agarová půda = 5g/l (NH4)2S04, 1 g/l KHS04, 0,5g/l MgS04 x7H20, 10g/I glukosa, 1 ml/l Wickerhamův roztok, 20g/l agar Wickerhamův roztok: 0.2mg biotin, 200mg inositol, 20mg riboflavin, 40mg thiamin, 40mg pyridoxin, 20mg kyselina p-aminobenzoová, 40mg kyselina nikotinová, 0,2mg kyselina listová (na 100ml vody) Forsburg and Rhind, Yeast, 2006 Carbon Rich Poor c c CL Pseudohyphal Grq,y$ŕ .ti** Vy Ji v rab Sporulation &4 B Sporulace/meiosa Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) V - Živiny ovlivňují morfologii/ buněčnou formu - kvasinková nebo houbová (pseudohyfy) nebo sporulace ... - limitování klíčových živin spouští různé vývojové odpovědi - zdroje uhlíku a dusíku jsou monitorovány signálními dráhami Mutant Phenotype Gain of CCM Loss of CCM í Glucose Elongator i Nitroc MAP Kinase cAMP-PKA Nitrogen Discrimination Ira2p Ras2p Tpk2p Tpk3p G,n3p Flo11p Rim15p Complex Colony Morphology Rim15p CCM = complex colony morphology Kvasinková forma - morfologie - za běžných podmínek (bohaté C i N zdroje) převládá kvasinková f. - rotační elipsoid, kulaté, protáhlé - rod Dipodascus až 130 mikrometrů - 3-15 mikrometrů (bakterie30% buněk v populaci) LP = low penetrance (<30% buněk v populaci) Kvasinková forma - morfologie visualní analýza kvasinek deleční knihovny -3500 kmenů (1. genome-wide) - např. delece genů regulujících buněčnou polaritu S. pombe způsobovaly oválný tvar buněk rounded buněčná stěna (a> miss E miss V miss weak V long HP long LP long Br rounded stubby curved small skittle ZU o - • ^ stubby buněčná stěna a aktin krátké/tlusté mikrotubuly 400 morfologii kvasinek určují různé procesy: cytoskelet ... (více v dalších přednáškách) co o CM O CD i Ca_th8ti Ca_m1g1&t Ca_m(gib . . i > "l • • ■ □ » f\ t, 1 Iv* •» ' l'i'> , « / » f f í • > . '"V • " A V ■ 'i i B Pseudohyp hal Grow • ni • Bio H film a □ • • • • n O □ • • o s o: :o Phenotypic Score 3S2 SIS Phenotypic Score -7 0 10 -26 0 26 - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (invasivní růst, pseudohyfy, biofilm, flokulace) - FL011 = adhesin (glykoprotein - faktor důležitý pro uchycení) - Flo8, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Flo11, FI08, Mfg1 faktory jsou konzervovány . a podílí se na invasivních vlastnostech (virulenci) patogenních kvasinek C. albicans Ryan et al, Science (2012) Invasion 190 FL011 RIM101 RPD3 FLOS SIN3 TEC1 RXT2 MSS11 MIT1 MFG1 SPE1 SPE2 "* SPE3 SPE4 Biofilm Pseudohyphal F ✓ wt • • • • • • • * □ • • • • digit i • • • • • • ♦HE • • • • Score 10 I. -7 adhesin Relative FZ.OÍ ipr-GFP expression o ca o.e o.* 1.2 1.5 i.a - Flo8, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Dig1 je represor transkripce Flo11 - FL011 = adhesin (glykoprotein - faktor důležitý pro uchycení - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (... biofilm, flokulace) Ryan et al, Science (2012) 1 "i'',-<;,", i i ■.■Tijfiri ^^^B ■ .■cřťíů ^2^1 H P 1—1 Flokulace reverzibilní schopnost kvasinek shlukovat se, tvořit větší celky (vločky, f loky); odpověď na stres flokulace je významná vlastnost využívaná např. při produkci piva (snižuje náklady na filtraci Diva) flo1 FLOl -ovlivněno složením média, genetickou výbavou kmene (skupina FLO genů), teplotou, stavbou a morfologií buňky ... - Flolp váže manany na povrchu buněk stejného druhu (S.c.) => agregace - NewFlo váže manosu i glukosu => glukosa v mediu inhibuje agregaci -teprve po přeměně cukrů na etanol se važe na buněčnou stěnu ostatních buněk a dochází k vločkování Smukallaa kol., 2008, Cell Verstrepen, 2006, Mol. Microbiol Yeast surface display - His-His-His-His-His-His (chelatuje Ni, Cu, Co kovy) -GTS1 transkripční faktor spouštějící aglutinaci pod CUP1 promotorem (další přednášky) - biosorbce & sedimentace (100 uM CuS04) (without C11SO4) - hybrid Aga2 (aglutininy nebo Flo1 ...) s testovaným proteinem - exprese eukaryotních proteinů v kvasince (podobné mechanismy ... posttranslační modifikace) - knihovny lidských cDNA (i protilátek z pacientů) - využití i pro biotechnologie - vychytávání těžkých kovů (dekontaminace) Kuroda et al, Appl Microbiol Biotechnol (2002) Pepper et al, CCHTS (2008) YSD - testy antigen/protilátka - v kvasince je exprimována knihovna (např. IgG klonů) - na kuličkách je navázán antigen (fluorescenčně značený) - opakováním vychytávání dojde k nabohacení (i slabších interakcí) Boder et a!j Arch Bioch Bipnys (2012) Pseudohyfy, adhesiny ... a candidalysin Kvasinky C. albicans jsou schopny se přichytit k epiteliálním buňkám hostitele (pomocí adhesinů - Hwp1) - invasiny (Als3 a Ssa3 mohou interagovat s receptory) se podílí na vnoření pseudohyfy do buněčné membrány hostitele - Ece1 je rozštěpen Kex2/Kex1 proteasami na peptidy (Golgi), které jsou sekretovány a vytváří (peptid III) póry v cytoplasmatické membráně (jako bakteriální toxiny) Mitchell, Nature, 2016; Moyes et al., Nature, 2016; Los et al, MMBR, 2013 Killer toxiny Některé kmeny S.cerevisiae produkují tzv. killer toxiny (proteiny a glykoproteiny sekretované do prostředí), které jsou letální pro citlivé kvasinky i bakterie; ekologická výhoda (výhoda pro vinaře - nepřerostou je cizorodé kmeny) - Poprvé analyzováno v roce 1963 (Makower a Bevan) kvasinky zabíjí podkladový kmen (K1=laboratorní, K2 a K3=vinařské kvasinky) - Kvasinky ze stejné skupiny se navzájem nezabíjí (preprotoxin ...) - Geny jsou kódovány na dsRNA obalené ve „virus-like particles (VLP, připomínají savčí dsRNA viry) - kódují obalové, replikační proteiny (ale potřebují buňku k replikaci ...), transkripční sekvence a toxin - Samotné VLP nejsou infekční (nejsou uvolňovány z buněk - lze je přenést konjugací buněk nebo fůzí protoplastů) ani toxické (preprotoxin v původní buňce interaguje/inaktivuje maturovane/sekretované toxiny) - Toxin je sekretován a váže se na buněčné stěny (p-1,6-glukany) -způsobuje perforace/póry v cytoplasmatické membráně - ztráta iontů, potenciálu ... buňka hyne - Kluyveromyces lactis, Píchla membranifaciens - lineární dsDNA (v cytoplasmě, pGK11), bez kapsidy, toxin se váže na chitin (chitinásová aktivita) - Hansenula mrakii... - geny na chromosomech, toxin inhibuje syntézu p-1,3-glukanu (v místě růstu pupenu) Table 2. Killer activity of P. membranifaciens CYC 1 086 and CYC 1106 against yeasts and fungi of biotechnological interest Sensitive strain K i Ik i ii\ Sensitive strain Killer activity Sensitive strain Killer activity 1086 1106 1086 1 106 1086 1106 S. cerevisiae SGV — — B. bnixeilensis 1D007 3 + — Pidiia anomala 11141 — — S. cerevisiae CEG - - B. bnixeilensis D013 1 + - Pichia membranifaciens CYC 1070 2 + S. cerevisiae VRB - 3 + B. bnixeilensis DO 14 1 + - Aspergillus spp. 27 - - 5. cerevisiae NEM - - B. bnixeilensis D015 1 + - A, carbonarhis B MUM - .S". cerevisiae 2056 - 2 + B. bnixeilensis DO 17 2 + - A. orchraceus - S. cerevisUie BM45 - 3 + B. bnixeilensis DO 18 1 + - A. oryzae - S. cerevisiae 2323 - - B. bnixeilensis DO 19 1-F - A. tubingensis - S. cereviswe ALB — 3 + B. bnixeilensis D027 1 + - Fusarium culmorum — - S. cerevisiae SLO - 4 + B. bnixeilensis D028 1 + - F. gramineantm NRRL 28525 - - S. cerevisiae VN - - ß. bnixeilensis D029 2 + - F. graminearum NRRL 29020 - S. cerevisiae 71B - 4 + B. bnixeilensis D031 1 + - F. pone - S. cerevisiae CS2 - 1 + B. bnixeilensis D032 1 + - F. proliferatum MM 1-2 2 + S. cerevisiae CM - - B. bnixeilensis D033 1 + - F. proliferatum MM 3-1 2 + S. cerevisiae HAY - - B. bnixeilensis D035 2 + - F. proliferatum MM 6-2 - - S. cerevisiae FS - 3 + B. bnixeilensis D036 1 • - F. retiatlloides MM 6-3 - - S. cerevisiae 16 - - B. bnixeilensis D038 1 + - F. retiatlloides MM 7-3 - S. cerevisiae 17 - 3 + Debaryomyces hansenii 1021 - - F. sporotrichohles ITEM 550 - S. cerevisiae 18 - 3 + D. hansenii 1244 - - Botrytis cinerea 20003 3 + S. cerewsiae 19 - - D. hansenii 10388 - - ß. cinerea 20004 1 + S. cerewwc SCI — 4 + D. hansenii 10386 — — ß. cinerea 20005 24- ■ f ff ' O v 1 f . - Kontaminace vinných kultur kmenem Brettanomyces bruxellensis může být potlačena Pichií membranifaciens - Význam při ochraně průmyslových kmenů (proti kontaminaci - odolné vůči toxinu a zabijí kontaminanty) - v léčbě (některé S.c. killer kmeny zabíjí kmeny Ca., C. podzolicus zabíjí Santos et al., 2009, Microbiology