1 PŘENOS KYSLÍKU V BIOTECHNOLOGII Při aerobních procesech katalyzovaných buňkami nebo enzymy je nutné zabezpečit dostatečný přívod kyslíku do fermentačního média bioreaktoru. U některých organismů i krátkodobá limitace metabolismu kyslíkem může způsobit nevratné změny v respiračním systému. Každopádně dochází ke snížení rychlosti tvorby produktů (a růstu biomasy v kulturách organismů). Limitace kyslíkem má proto negativní nejen biochemické, ale i ekonomické dopady. Samotný proces aerace zvyšuje ekonomickou náročnost bioprocesu z důvodu zvýšené spotřeby energie, zejména ve větším měřítku. Výsledkem proto musí být průnik takových podmínek dodávky a biochemické spotřeby kyslíku, aby se aplikovala co nejnižší intenzita aerace, ale přitom se vyloučila biochemická limitace kyslíkem. Ukazatel účinnosti systému vzdušnění a míchání (viz kLa níže) je jedním z nejdůležitějších parametrů bioreaktoru v laboratorním i provozním a jeho určení je náplní této úlohy. Úvod Limitace metabolismu kyslíkem Důvody limitace respirace a růstu buněk kyslíkem vyplývají z následujících vztahů. Při aplikaci kinetiky Michaelise a Mentenové platí: Q = Qm c/(Km + c) (1) Q celková (objemová) rychlost spotřeby kyslíku (Qm je maximální hodnota) Km Michaelisova konstanta pro kyslík (v případě celých buněk jde o zdánlivou hodnotu) c koncentrace kyslíku v kapalném médiu. V uzavřeném systému (bez dodávky kyslíku) lze určit Q z poklesu koncentrace kyslíku v čase (t): Q = - dc/dt (2) Vliv koncentrace kyslíku na metabolismus růstových kultur organismů lze po zanedbání energie udržování vyjádřit: Q = (1/YX/O)(dX/dt) (3) YX/O výtěžek biomasy na kyslík X koncentrace biomasy t čas Uvedené vztahy demonstrují úzkou souvislost mezi koncentrací kyslíku (a tedy jeho dodávkou) a respirační (příp. růstovou) aktivitou organismů. 2 Objemový koeficient přestupu kyslíku (kLa) Pro rychlost přestupu kyslíku z plynné do kapalné fáze lze odvodit následující vztah: dc/dt = kLa(cs-c) (4) c aktuální koncentrace kyslíku v kapalině cs nasycená (rovnovážná) koncentrace kyslíku v kapalině kLa objemový koeficient přestupu kyslíku z plynu do kapaliny kLa představuje součin koeficientu přestupu kyslíku z fázového rozhraní do kapalné fáze (kL) a specifického povrchu mezifázového rozhraní (a). Je konstantní pouze pro konstantní fyzikální podmínky aerace. Hodnota kLa je nejen ukazatelem účinnosti aeračního systému bioreaktoru, ale i důležitým parametrem pro přenos podmínek aerace do většího měřítka. Jeho hodnota je proto důležitý ukazatel podmínek aerace v laboratorním i průmyslovém měřítku. Je-li v aerovaném systému kultura respirujících organismů (příp. suspenze enzymů spotřebovávajících kyslík), rovnice (4) přejde na tvar: dc/dt = kLa(cs - c) - Q (5) což znamená, že rychlost změny koncentrace kyslíku se rovná rychlosti dodávky kyslíku snížené o rychlost spotřeby kyslíku. Určení kLa Z více možností zde uvedeme dva často používané způsoby, jež budou předmětem experimentální práce. 1. Vytěsňovací metoda Jde o postup určení kLa bez přítomnosti organismů nebo enzymů, takže se projeví pouze konstrukční vlastnosti bioreaktoru. V kapalině bez respirujících organismů se vytěsní kyslík inertním plynem a poté se za definovaných podmínek aerace registruje sycení média kyslíkem. Po integraci rovnice (4) (v hranicích 0 - t, c0 - c) platí: ln(cs - c) = ln(cs - c0) - kLa.t (6) Hodnoty cs za dané teploty a tlaku jsou pro vodu známé. Po vynesení rovnice (6) získáme lineární regresí kLa jako směrnici. Za přítomnosti organismů lze určit kLa vytěsňovací metodou po úplné inhibici respirace organismu (Q = 0 v rovnici (5)). 3 2. Rovnovážná metoda Tato metoda má za cíl určení kLa v bioreaktoru za reálných podmínek kultivace nebo produkce, čili za přítomnosti organismů nebo enzymů spotřebovávajících kyslík. Po zjištění rychlosti spotřeby kyslíku v uzavřené nádobě podle vztahu (2) se po otevření nádoby a tím obnovení vzdušné aerace určí kLa z podmínky ustáleného stavu, kdy dc/dt = 0. Ustálí se koncentrace kyslíku c' jako výsledek rovnováhy mezi rychlostmi dodávky a spotřeby kyslíku. Z rovnice (5) za ustáleného stavu plyne: kLa = Q/(cs - c') (7) c' je ustálená koncentrace kyslíku. Výpočet je tedy jednoduchý, navození ustáleného stavu však může trvat delší dobu. Q lze změřit v krátkém čase v uzavřeném systému, hodnotu cs lze aproximovat známými hodnotami pro destilovanou vodu. Pro charakterizaci aerační účinnosti samotného bioreaktoru a její srovnání s dalšími bioreaktory, jakož i pro optimalizaci míchání a vzdušnění, je výhodné určení kLa vytěsňovací metodou. Pro určení kLa v reálných kultivačních nebo produkčních podmínkách může být vhodnější rovnovážná metoda. Pro vyjádření minimální intenzity aerace zabezpečující kyslíkem nelimitovaný reálný (bio)proces v ustáleném stavu lze rovnici (7) použít pro charakterizaci minimální hodnoty kritického koeficientu kLa: (kLa)crit = Q/(cs - ccrit) (8) kde ccrit představuje dolní kritickou koncentraci kyslíku za ustáleného stavu, při které ještě nedochází k limitaci kyslíkem. Koncentrace kyslíku v bioreaktoru by se proto měla dlouhodobě udržovat v užším intervalu nad ccrit, kdy bude optimalizovaná biochemická i ekonomická náročnost procesu. Cíl práce Stanovení objemového koeficientu přestupu kyslíku jako indikátoru účinnosti aerace. Vybavení Amperometrický detektor, termostat, magneticky míchaná termostatovaná měřicí nádobka (simulace bioreaktoru) s kyslíkovou elektrodou, použitelná v otevřeném i uzavřeném systému, zdroj dusíku (pro vytěsňovací metodu), kvasinky Saccharomyces cerevisiae (jako univerzální příklad aplikace organismů). Ukázka laboratorních bioreaktorů a souvislosti se simulací podmínek v úloze. 4 Pracovní postup Kalibrace kyslíkové elektrody Nulová hodnota koncentrace kyslíku se nastaví pomocí roztoku siřičitanu sodného, nasycená (rovnovážná) koncentrace kyslíku pomocí destilované vody za definované (pracovní) teploty. V měřicí nádobce s kyslíkovou elektrodou se provzdušňuje destilovaná voda, po ustálení záznamu koncentrace kyslíku se nastaví její tabelovaná hodnota (cs) pro danou teplotu a atmosférický tlak. Určení kLa vytěsňovací metodou Destilovaná voda bez jakýkoli organismů nebo enzymů se v bioreaktoru zbaví kyslíku probubláváním dusíkem. Jakmile se koncentrace kyslíku blíží k nule, přeruší se přívod dusíku a za daných podmínek aerace (konstantní teplota, objem a otáčky míchadla) se voda sytí vzdušným kyslíkem. Registrací hodnot koncentrace rozpuštěného kyslíku získáme záznam odpovídající rovnici (4). Při známé hodnotě cs se určí z rovnice (6) kLa lineární regresí. Určení kLa rovnovážnou metodou 0,2 g pekařského droždí se rozsuspenduje v 50 ml vytemperované destilované vody a suspenze se přenese do vytemperované měřící nádobky. V uzavřené nádobce změříme rychlost spotřeby kyslíku (Q) jako směrnici lineárního časového poklesu koncentrace kyslíku podle rovnice (2). Poté nádobku otevřeme a ve stejném objemu kultury jako byl objem vody u vytěsňovací metody vyčkáme ustáleného stavu a odečteme c'. Hodnotu kLa určíme z rovnice (7). Alternativním úkolem je využití hodnoty kLa z vytěsňovací metody a určení teoretické hodnoty ustálené koncentrace kyslíku c' ze vztahu (7). Závěr Vypracování protokolu demonstrujícího lineární regresi a určení kLa vytěsňovací metodou a vyhodnocení dat z rovnovážné metody.