CG020 Genomika
Přednáška 4
Genetika přímá
Jan Hejátko
Funkční genomika a proteomika rostlin,
Středoevropský technologický institut (CEITEC)
a
Národní centrum pro výzkum biomolekul,
Přírodovědecká fakulta,
Masarykova univerzita, Brno
hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.eu
2
 Přímá vs. reverzní genetika
 Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky
 vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle
 anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu
 metabolického profilu
 exprese zajímavých genů
 identifikace mutovaného lokusu
 plasmid rescue
 iPCR
 Využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice
 poziční klonování
 GWAS
Osnova
3
 Přímá vs. reverzní genetika
Osnova
4
„Přímě genetický“přístup
1. IDENTIFIKACE FENOTYPU
2. GENETICKÉ MAPOVÁNÍ
3. GENOVÁ IDENTIFIKACE
-poziční klonování
„Reverzně genetický“ přístup
1.IZOLACE SEKVENČNĚ
SPECIFICKÉHO MUTANTA
2. IDENTIFIKACE FENOTYPU
3. PRŮKAZ KAUZÁLNÍ SOUVISLOSTI
MEZI INZERCÍ A FENOTYPEM
NÁHODNÁ MUTAGENEZE
Přístupy „klasické“genetiky versus „reverzně genetický“
přístup ve funkční genomice
EMS
T-DNA
(retro)transposons
5
 Přímá vs. reverzní genetika
 Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky
 vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle
 anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu
Osnova
6
Inzerční mutageneze v přímé
genetice
 Infekce EμMyc myší retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, které
vznikly díky aktivaci Pim kináz (ve 40% aktivaci Pim1 a v 15% aktivaci
Pim2), molekulární cíle těchto kináz byly neznámé
 Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze
Mikkers et al., Nature Gen (2002)
?
7
 Infekce EμMyc pim1 mutantů retrovirem MoMuLV vede k tvorbě
lymfomů, které obsahují v 90% inzerci v blízkosti (aktivaci) Pim2
 Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze
Mikkers et al., Nature Gen (2002)
?
Inzerční mutageneze v přímé
genetice
8
 Infekce EμMyc dvojnásobných mutantů pim1, pim2 retrovirem MoMuLV vede k
tvorbě lymfomů, u kterých lze očekávat aktivaci buď některého ze signálních
partnerů Pim proteinů (Y), některého z proteinů Pim signální dráhy (X) nebo k
aktivaci některé z příbuzných drah vedoucích k lymfomagenezi (Z)
 Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze
Mikkers et al., Nature Gen (2002)
?
Inzerční mutageneze v přímé
genetice
9
 Štěpení genomové DNA a ligace
speciálních linkerů, tzv. splinkerett
(zvýšení specifity amplifikace)
 Izolace genomových oblastí přílehajících k místu inzerce
proviru
Mikkers et al., Nature Gen (2002)
Devon et al., Nucl Acid Res (1994)
Inzerční mutageneze v přímé
genetice
10
 První amplifikace pomocí specifických
primerů
 Izolace genomových oblastí přílhajících k místu inzerce
proviru
Mikkers et al., Nature Gen (2002)
Devon et al., Nucl Acid Res (1994)
Inzerční mutageneze v přímé
genetice
11
 Druhá amplifikace pomocí „nested“
primerů (zvýšení specificity)
 Izolace genomových oblastí přílhajících k místu inzerce
proviru
Mikkers et al., Nature Gen (2002)
Devon et al., Nucl Acid Res (1994)
Inzerční mutageneze v přímé
genetice
12
 Sekvenace a lokalizace oblastí
přiléhajících k protoviru vyhledáváním v
anotovaných databázích myšího
genomu
 Izolace genomových oblastí přílhajících k místu inzerce
proviru
Mikkers et al., Nature Gen (2002)
Devon et al., Nucl Acid Res (1994)
Inzerční mutageneze v přímé
genetice
13
 Přímá vs. reverzní genetika
 Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky
 vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle
 anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu
 metabolického profilu
Osnova
14
 hromadná a automatizovaná analýza
metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS
technik v knihovnách T-DNA mutantů
 Metabolické profilování rostlin
Metabolické profilování
15
 hromadná a automatizovaná analýza
metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS
technik v knihovnách T-DNA mutantů
 identifikace (např. i komerčně) zajímavých
mutantů
 Metabolické profilování rostlin
Metabolické profilování
16
 hromadná a automatizovaná analýza
metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS
technik v knihovnách T-DNA mutantů
 identifikace (např. i komerčně) zajímavých
mutantů
 snadná a rychlá izolace genů pomocí
identifikace T-DNA zasažených sekvencí
 Metabolické profilování rostlin
Metabolické profilování
17
 možnost využít i speciální techniky, např. mikrodisekce
 Metabolické profilování rostlin
Metabolické profilování
18
 Přímá vs. reverzní genetika
 Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky
 vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle
 anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu
 metabolického profilu
 exprese zajímavých genů
Osnova
19
 analýza expresního profilu (vzorce) daného genu a
identifikace mutantů se změnou exprese
 Identifikace mutantů se změnou expresního profilu
Expresní profil
20
 analýza expresního profilu (vzorce) daného genu a
identifikace mutantů se změnou exprese
 Identifikace mutantů se změnou expresního profilu
 možnost částečné automatizace (virtuální digitální
mikroskopie)
Expresní profil
21
Vyhledávání pomocí automatické
mikroskopie
Dobisova and Hejatko, Methods in Mol Biol, 2014
image.vsi
22
WT
Expresní profil
23
 Přímá vs. reverzní genetika
 Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky
 vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle
 anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu
 metabolického profilu
 exprese zajímavých genů
 identifikace mutovaného lokusu
 plasmid rescue
 iPCR
Osnova
24
 Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za
keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis
 popis fenotypu
Identifikace mutovaného
lokusu
25
Identifikace mutanta
 zvlněné listy
 chybějící trychomy na listech a
na stonku
 opožděné stárnutí
 keříčkovitý fenotyp (poruchy
větvení)
26
 samčí sterilita, poruchy v
prodlužování tyčinek (A,B)
(porovnej se standardním typem C)
Identifikace mutanta
27
 Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za
keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis
 popis fenotypu
 identifikace T-DNA mutované oblasti
Identifikace mutovaného
lokusu
28
1. Identifikace oblasti genomové DNA přiléhající k levé hranici
pomocí plasmid rescue
 restrikční štěpení (EcoRI)
mutantní genomové DNA
 religace a transformace E.coli
 izolace plazmidové DNA z
pozitivně selektovaných klonů
 identifikovaná sekvence byla
identická s genem pro NAD7
kódovaným na mtDNA
Identifikace mutovaného lokusu
29
2. Identifikace oblasti genomové DNA přiléhající k pravé hranici
pomocí inverzní PCR (iPCR)
 restrikční štěpení (EcoRI)
mutantní genomové DNA
 purifikace, religace a PCR
pomocí T-DNA specifických
primerů
 klonování a sekvencování
 identifikovaná sekvence
nebyla homologní k žádné
sekvencí se známou funkcí
Identifikace mutovaného lokusu
30
 Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za
keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis
 popis fenotypu
 identifikace T-DNA mutované oblasti
 lokalizace T-DNA inzerce v genomu Arabidopsis
Identifikace mutovaného
lokusu
31
Vyhledávání v knihovně IGF-BAC
 genomová knihovna obsahující 10,752 klonů s průměrnou velikostí
inzertu 100 kb
 bakteriální klony uspořádané v mikrotitračních deskách
 knihovna nanesena na nylonové filtry pro hybridizaci s
radioaktivně značenou sondou
32
I. Sekvence přiléhající k levé hranici T-DNA
 celkem 28 pozitivně hybridizujících klonů
 19 z nich lokalizováno na chromozomu 2
 18 s podobností k mtDNA
II. Sekvence přiléhající k pravé hranici T-DNA
 celkem 6 pozitivně hybridizujích klonů
 všechny lokalizovány na chromozomu 2
Mapování pomocí IGF-BAC databáze
33
levé hranici T-DNASekvence přiléhající k pravé a
Lokalizace genomové T-DNA přiléhající k levé i pravé
hranici T-DNA na chromozomu 2
 pravděpodobně došlo k inverzi téměř celého
chromozómu 2
34
 Přímá vs. reverzní genetika
 Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky
 vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle
 anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu
 metabolického profilu
 exprese zajímavých genů
 identifikace mutovaného lokusu
 plasmid rescue
 iPCR
 Využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice
 poziční klonování
Osnova
35
 Poziční klonování
 podstatou je kosegregační analýza segregující populace (většinou
potomstva informativního zpětného křížení) s molekulárními markery
 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
 RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)
 SSLP (Simple Sequence Length Polymorphism)
 polymorfizmus délky genomu (PCR produktů) amplifikovaného
pomocí specifických primerů
 polymorfizmus délky restrikčních fragmentů úseků genomu,
detekce pomocí Southern blotu (PCR po naštěpení genomové DNA a
ligaci adaptorů)
 polymorfizmus délky náhodně (pomocí krátkých primerů, 8-10 bp)
amplifikovaných úseků genomu
 CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)
 polymorfizmus délky restrikčních fragmentů úseků genomu
amplifikovaných pomocí PCR
Identifikace mutovaného
lokusu
36
m m
M M
Col Col
+
M
Col Ler
m
M
+
M
+
M
Ler Ler
M M
m m
Col Ler
M M
m m
Ler Ler
m +
M M
Col Ler
m
M
+
M
Ler Ler
+ +
M M
Col Col Col Ler
+
M
+
M
M M
m +
Col Ler
+ +
M M
♂
Ler Ler
♀
Col Col
mm
M M
Příprava mapovací populace
M
m+
M
Poziční klonování
37
Rekombinantní analýza – určení procenta rekombinace mezi
mutací a molekulárním markerem
r [%] = počet chomozomů Col /
počet všech chromozomů x 100
marker I – ve vazbě
5 mutantů
1/10x100 = 10%
marker II - žádná vazba
6 mutantů
7/12x100 = 58%
• Analýza cca 2000 mutantních linií
• Určení nejbližšího (ještě) segregujícího markeru
• Identifikace mutace pomocí sekvenování
Ler Col
Ler Col
38
Mapa DNA molekulárních markerů
39
Markery pro jemné mapování
40
 Přímá vs. reverzní genetika
 Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky
 vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle
 anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu
 metabolického profilu
 exprese zajímavých genů
 identifikace mutovaného lokusu
 plasmid rescue
 iPCR
 Využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice
 poziční klonování
 GWAS
Osnova
41
Genome Wide Association
Study - GWAS
42
 Přímá genetika umožňuje cíleně vyhledávat zajímavé
fenotypy, jejichž asociace s určitým genem/lokusem není
dosud známa
 Lze využít jak inzerční mutageny, tak mutace bodové
 Inzerční mutace
 (většinou) mutace se ztrátou funkce (loss-of-
function)
 iPCR
 plasmid rescue
 Bodové mutace
 Jak mutace se ztrátou funkce (loss-of-function), tak i
 Mutace se získanou funkcí (gain-of-function)
 poziční klonování
 GWAS
Klíčové koncepty
43
Diskuse