CG020 Genomika
Přednáška 5
RNA interference a editování genomu
Jan Hejátko
Funkční genomika a proteomika rostlin,
Středoevropský technologický institut (CEITEC)
a
Národní centrum pro výzkum biomolekul,
Přírodovědecká fakulta,
Masarykova univerzita, Brno
hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.eu
2
 Umlčování genů pomocí RNA interference
 Mechanismus RNAi
Osnova
 Editace genomu
 Princip editace genomu prostřednictvím místně specifických
nukleáz (Site Directed Nucleases, SDNs)
 Zinc-Finger Nucleases (ZFNs)
 Transcription Activator-Like Effectors (TALENs)
 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats/Cas9 (CRISPR/Cas9)
3
 Umlčování genů pomocí RNA interference
 Mechanismus RNAi
Osnova
4
 Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS)
 RNAi objevena u rostlin, později u Coenorhabditis
elegans
 U rostlin identifikována jako „sense effect“ v systémové
negativní regulaci genové aktivity
RNA interference
5
Umlčování exprese vnesením další kopie
genu pro biosyntézu flavonoidů
van der Krol et al., Plant Cell (1990)
p35S::DFR
6
Systémový efekt na regulaci exprese GFP
 Nicotiana benthamiana
exprimující GFP
 Retransformace
jednoho z listů
konstruktem pro
expresi GFP
 Absence GFP je
viditelná jako červená
fluorescence chlorofylu
Voinnet and Baulcombe, Nature (1997)
7
 Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS)
 RNAi objevena u rostlin a později u Coenorhabditis
elegans
 U rostlin identifikována jako „sense effect“ v systémové
negativní regulaci genové aktivity
 umlčování bylo indukováno jak sense tak antisense RNA
 dsRNA indukovala umlčování cca 10-100x účinněji
RNA interference
8
Waterhaus et al., PNAS (1998)
Posttranskripční umlčování u rostlin je
zprostředkováno dsRNA
9
 Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS)
 Umlčování genové exprese prostřednictvím dsRNA je závislé
na vlastních genech
 vyhledávání pomocí přímé genetiky
RNA interference
RNAi rnai
Mello and Conte, Nature (2004)
10
 Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS)
 je to přirozený mechanismus regulace genové exprese u
všech eukaryot
 podstatou je tvorba dsRNA, která může být spuštěna
několika způsoby:
 přítomnost cizí „aberantní“ DNA
 specifické transgeny obsahující obrácené repetice částí cDNA
 transkripce vlastních genů pro shRNA (short hairpin RNA) nebo
miRNA (micro RNA, endogenní „vlásenková“ RNA)
 dsRNA je procesována enzymovým komplexem (DICER),
což vede k tvorbě siRNA (short interference RNA), která
se pak váže buď na enzymový komplex RITS (RNAInduced
Transcriptional Silencing complex) nebo RISC
(RNA-Induced Silencing Complex)
 RISC zprostředkovává buď degradaci mRNA (v případě
úplné similarity siRNA a cílové mRNA) nebo vede pouze k
zastavení translace (v případě neúplné homologie jako je
tomu např. v případě miRNA
 RITS zprostředkovává reorganizaci genomové DNA
(tvorba heterochromatinu a inhibice transkripce)
RNA interference
11
RNA-dependent RNA polymerase
short hairpin RNA
micro RNA
Mechanism of RNA interference
+ tasiRNAs (trans-acting siRNA)
21-25 bp
Mello and Conte, Nature (2004)
12
From MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.., Adams, P.D., and Doudna, J.A. (2006)
Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311: 195 -198. Reprinted with permission from
AAAS. Photo credit: Heidi
Dicer and Dicer-like proteins
13
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: EMBO J. Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., and Benning, C. (1998)
AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J. 17: 170–180. Copyright 1998; Reprinted from Song, J.-J., Smith,
S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor, L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305: 1434 – 1437.
with permission of AAAS.
Argonauta argo
argonaut pelagickýago1
Argonaute proteins
14
MIR gene
RNA Pol
AAAn
AGO AAAn
RNA Pol
mRNA
AGO
AGO
RNA Pol
AGO
AGO
AAAn
siRNA
miRNA
post-transcriptional gene silencingtranscriptional gene silencing
transcriptional slicing
translational repression
binding to DNA
binding to specific
transcripts
15
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006
Andrew Z. Fire Craig C. Mello
USA USA
Stanford University
School of Medicine
Stanford, CA, USA
University of
Massachusetts Medical
School
Worcester, MA, USA
b. 1959 b. 1960
16
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006
Andrew Z. Fire Craig C. Mello
USA USA
Stanford University
School of Medicine
Stanford, CA, USA
University of
Massachusetts Medical
School
Worcester, MA, USA
b. 1959 b. 1960
David Baulcombe
UK
?
17
 Umlčování genů pomocí RNA interference
 Mechanismus RNAi
Osnova
 Editace genomu
 Princip editace genomu prostřednictvím místně specifických
nukleáz (Site Directed Nucleases, SDNs)
18
Editace genomu pomocí
SDNs
Pandey et al, Journal of Genetic Syndromes & Gene Therapy (2011)
19
 Umlčování genů pomocí RNA interference
 Mechanismus RNAi
Osnova
 Editace genomu
 Princip editace genomu prostřednictvím místně specifických
nukleáz (Site Directed Nucleases, SDNs)
 Zinc-Finger Nucleases (ZFNs)
20
 Každý zinkový „prst“ je schopen rozpoznat nukleotidový triplet
 Nukleázová doména funguje jako heterodimer – možnost
zvýšení specifity navržením sady „prstů“ rozpoznávajícíh 9 bp
z každé strany cílové sekvence
 Nevýhody
 Špatně se „programuje“
 Omezená specifita
Zinc-Finger Nucleases -
ZFNs
 Místně specifické endonukleázy, schopné rozpoznat
cílovou sekvenci prostřednictvím sady „zinkových prstů“
21
Zinc-Finger Nucleases
Carroll, Science (2011)
Wikipedia
22
 Umlčování genů pomocí RNA interference
 Mechanismus RNAi
Osnova
 Editace genomu
 Princip editace genomu prostřednictvím místně specifických
nukleáz (Site Directed Nucleases, SDNs)
 Zinc-Finger Nucleases (ZFNs)
 Transcription Activator-Like Effectors (TALENs)
23
Transcription Activator-Like
Effectors - TALENs
 Proteiny odvozené od sekvenčně specifických
transkripčních aktivátorů
 Identifikovány (zatím pouze) u rostlinných patogenních bakterií
Xanthomonas sp. jako bakteriální efektory, schopné regulovat
transkripci cílových genů rostlin
 Sekvenční specifita určena aminokyselinovou sekvencí DNA
vazebných repetic
 Lze využít k různým typům modifikací
 Nevýhody
 Špatně se „programuje“
 Omezená specifita
24
TALENs, původ
Fichtner et al. Planta (2014)
25
TALENs, určení specifity
Fichtner et al. Planta (2014)
26
TALENs, využití
Bogdanove and Voytas, Science (2011)
27
 Umlčování genů pomocí RNA interference
 Mechanismus RNAi
Osnova
 Editace genomu
 Princip editace genomu prostřednictvím místně specifických
nukleáz (Site Directed Nucleases, SDNs)
 Zinc-Finger Nucleases (ZFNs)
 Transcription Activator-Like Effectors (TALENs)
 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats/Cas9 (CRISPR/Cas9)
28
Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats/Cas9 -
CRISPR/Cas9
 Objevena jako součást imunitního systému bakterií
 Principem je cílené začlenění cizorodé DNA (typicky fágové
DNA) do specifických oblastí genomu bakterií
 Po přepisu genů pro trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) a
oblasti se začleněnými částmi cizorodé DNA a následném
procesování vzniklé RNA dojde k tvorbě komplexu crRNA–
tracrRNA
 crRNA–tracrRNA váže Cas9 nukleázu a navádí ji na
komplementární (cizorodou/fágovou) DNA, kterou pak Cas9
štěpí
 crRNA–tracrRNA je v cíleném editování genomu nahrazována
single guide RNA (sgRNA nebo také gRNA)
 Výhody
 Snadno se „programuje“
 Značná specifita
 Možná celá řada dalších aplikací
29
 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
CRISPR/Cas9 - Mechanism
Jiang and Doudna, Cell (2017)
trans-activating CRISPR RNA
CRISPR-associated (Cas) genes
CRISPR RNA
20 bp of guide sequence
preceding the Protospacer
Adjacent Motif
30
CRISPR/Cas9 – Genome
Editing
Jiang and Doudna, Cell (2017) (single guide RNA)
31
CRISPR/Cas9 – Nobel Prize
in 20..2x?
Francisco Mojica Emmanuelle Charpentier Jenifer Doudna
Martin Jinek Jinek et al, Science (2012)
2020!
32
 Editování genomu
 Sekvenčně-specifické modifikace genomu s
velkou přesností
 Umožňuje jak vznik náhodných mutací v daném
lokusu, tak
 Cílené vkládání definovaných sekvencí – ideální
nástroj pro cílené modifikace genomu včetně
genové terapie
 CRISPR/Cas9 otevřel cestu snadné, rychlé a
zejména přesné editaci genomu a dalším
odvozeným modifikacím s velkým aplikačním
potenciálem
 RNAi
 Přirozený způsob regulace genové exprese,
vyžadujcí vlastní geny a vysvětlující přítomnost
velkého množství DNA nekódujcí proteiny
 Možno využít pro cílenou regulaci genové
exprese
Základní koncepty
33
Diskuse