(©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Alternativy in vivo te in - vitro Hf evropský f00!?'1^- ■ MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání TOndvCR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Toxikologie & Experimenty na zvířatech regulatorní toxikologie - od 20. století založena primárně na in vivo metodách OECD Test Guidelines řada metod vyvinuta před 30 - 60 léty » OECD Guideiines for Testing of Chemicals Section 4: Health Effects OECD OECD TG / Description 401 I 402 A03 404 | 05 Mucriu uyu iiiiictuu 406 Skin sensitisation 07 Rep^ 8 Re 409 Re Etické důvody Re rod Relevance a spolehlivost •^411 Repeat dose dermal toxicity (90 days), rodents Repeat dose inhalation toxicity (28 days), rodents \__- u -r^epeaB xlenti renal to pofcrrovk Iti nevyho\JGuci If30'' r\ "7 r\V\ lörlnoni Pokrok v technologiích Hc; One genei Ttr—generation reproduction toxicity 417 ToxicokineÉj|i layed I Cacut 11 iciuuuiuyn, I (acutl m pro \ kých látel v prostředí Ekonomická a časová náročnost O Toxikologie & na zvířatech r v • Eticky diskutabilní - tlak odborné i laické veřejnosti • 1959: Russel & Burch: "3Rs principle" • Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely aktivní podpora vývoje, validace a zavádění metod v souladu s 3R principem • „Cosmetic Directive" 76/768/EEC platí zákaz testování kosmetických produktů a přísad na zvířatech a zákaz marketingu takových produktů v EU • USA - zákony na státní úrovni (California, New Jersey, New York) • Validace alternativních metod - OECD • ECVAM JRC European Centre for Validation of Alternative Methods, Joint research Centre, EU, Ispra, Itálie (€» Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí JRok TG |EU Název 3R akce 1992 420 B1 Acute oral toxicity, fixed dose method 2001: Animal test (reduction and refinement method in comparison with the conventional TG 401), less suffering, smaller number of animals 1995 421 Reproduction / developmental toxicity screening study Animal test (reduction method compared to original TGs), new screening test provides essential information with a minimum number of animals 1996 422 Combined repeat dose with reproduction / developmental screening Animal test (reduction method compared to the individual TGs), combines the new screening test on reproduction toxicity with TG 407, and further reduces the number of animals to an absolute minimum for these combined endpoints 1996 423 B1 Acute oral toxicity, toxic class method 2001 Animal test (reduction method compared to the conventional TG 401), much smaller number of animals (10% of that required for TG 401) 1998 425 Acute oral toxicity, up and down method 2001: Animal test (reduction method compared to the conventional TG 401), smaller number of animals, provides a closer estimate of the LD50 than TGs 420 and 423 2004 428 Skin absorption: In vitro method In vitro alternative to the in vivo method (TG 427) 2002 429 Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay Animal test (reduction and refinement method compared to TG 406), provides more information and causes less suffering 2004 430 In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER) In vitro test method (ex vivo test) for the corrosion part of TG 404 2004 431 In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test In vitro test method for the corrosion part of TG 404 2004 432 In Vitro 3T3 NRU phototoxicity test In vitro test method (no OECD TG existed for an animal test) 2006 435 In Vitro Skin Corrosivity In vitro test method for the corrosion part of TG 404 (for specific applications, only applicable to acids and bases) 2009 436 Acute Inhalation Toxicity: Acute Toxic Class (ATC) Method Animal test introducing reduction in animal usage compared to TG 403, and refinement by applying humane endpoints. 2009 437 Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Animal test introducing reduction in animal usage compared to TG 403, and refinement by applying humane endpoints. 2009 438 Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method An in vitro screening test for identifying potential ocular corrosives and severe irritants in a tiered-testing strategy, as part of a weight-of-evidence approach. 2009 455 Stably Transfected Human Estrogen Receptor-a Transcriptional Activation Assay (STTA) In vitro test (could possibly introduce reduction if used in a testing strategy for detection of endocrine disrupting chemicals). Toxikologie & Experimenty na zvířatech • Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (Regulation EC No. 1907/2006)-REACH - chemikálie s produkcí více než 1 t / rok -> hodnocení toxicity - odhadem cca 30000 chemických látek během 15ti let - s použitím současných metod odhadováno 9-54 mil. pokusných zvířat (Rovida 2009, Altex 26) - nejen etický, ale i ekonomický a časový aspekt - Annex XI: pravidla pro standardní testování zahrnují možnost interpretace výsledků z in vitro testů: • Validované testy • „Vhodné" (suitable) testy - dostatečně vyvinuté z hlediska mezinárodně uznávaných kritérií pro zahájení pre-validačního procesu (ECHA) (€» Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Toxikologie & Experimenty na zvířatech o 2007: Toxicity Testing in the 21 st Century: A Vision and a Strategy (US National Research Council/NAS) - Mezidruhové rozdíly - Vysoké dávky, krátké doby expozice - Hodnocené parametry (smrt, nádor) —► Předpoklady a extrapolace, faktory nejistoty - Nespolehlivost a nerelevantnost tradičních in vivo metod Farmakologie a farmaceutická toxikologie: • Pouze 43% shoda výsledků z testů na hlodavcích s výsledky klinických studií (ECVAM) • V klinické fázi testování selhává až 92% potenciálních léčiv (Pampaloni 2009, Rec Patents on Biotech 3) - Ekonomická a časová náročnost, zastaralost, etické problémy TOHCfTVľlSHWG IMTHÍ ílSTCEÍITUBY a visum and í sranTíůY (O) Samostudium - seznámení s dokumentem Toxicity Testing in the 21 st Century: A Vision and a Stratégy - ve studijních Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí materiálech k předmětu Toxicity Testing in the 21 st Century: A Vision and a Stratégy nově připravená strategie vycházející z aktuálních poznatků a nejmodernějších technologií s cílem: 1) Zvýšit počet testovaných látek 2) Snížit náklady 3) Zlepšit výpovědní hodnotu výsledků vzhledem k predikci zdravotních rizik a environmentálním koncentracím Primárně lidské buňky a tkáňové kultury in vitro • Vlivy na biologické procesy (toxicity pathways) - mechanismy buněčné odpovědi, jejichž narušení v organismu vede ke škodlivým účinkům • Cílené testování (Targeted testing) x Testy na celých organismech (Whole-animal testing) Počítačové modelování závislostí dávka-odpověď pro narušování toxických drah, modelování pro účely extrapolací - interpretace informací z buněčných systémů směrem k in vivo toxicitě • Informace o expozici - biomonitoring - hladiny chemických látek v krvi, vlasech či dalších tkáních Hodnocení rizik - minimalizace narušování toxických drah v exponované populaci Animal experiments Ethics? Reliability? Costs & Throughput? Alternative (non-animal) methods and models □ Experiments with parts of living organisms ■ Purified or synthetic biomolecules - In chemico □ Computer simulations and modelling - In silico ■ Isolated organs and tissues - Ex vivo ■ Isolated cells and cell cultures - In Vitro ■ Isolated cell organelles and cell extracts (€» Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Alternativní testy • Musí projít validačním řízením • Dle ECVAM (the European Centre for the Validation of Alternative Methods) v současnosti uznávána sada vědecky ověřených alternativních metod (zejména testování fototoxicity, kožní dráždivosti, embryotoxicity). • EURL-ECVAM = European Union Reference Laboratory for alternatives to animal testing (since 2011) • https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/ ^^^^^^^^ • Podporuje vývoj a uplatňování alternativních metod a přístupů, aplikace v průmyslu a akceptaci regulačními orgány • Výzkumné organizace mohou zaslat alternativní metody, které vyvinuly, na odbornou validaci do EURL ECVAM • 3R: změny v testování toxicity xenobiotik: redukce počtu zvířat, není třeba úhyn, špatný stav dostatečným projevem toxicity Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Speciální eko-toxikologické biotesty - in vitro • standardní testy (normy ISO, ČSN, USEPA) • optimalizace/vývoj nových testů • Toxicita \ • Výzkum mechanismů působení látek • Specifické mechanismy neletálních účinků > Genotoxicita > Dioxinová aktivita > Mechanismy endokrinní disrupce - estrogenita, androgenita > Imunotoxicita • Testování čistých látek (environmentálni polutanty) modelových směsí komplexních environmentálních extraktů Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí In vitro toxikologie Testy na původních či geneticky modifikovaných prokaryotických či eukaryotických buňkách využívány zejména pro teoretické objasnění účinku toxického agens - i pro rutinní provádění testů toxicity BAKTERIÁLNI TESTY, KVASINKOVÉ TESTY c > ry TESTY NA TKÁŇOVÝCH KULTURÁCH - testy in vitro: tkáňové explantáty, bílé krvinky, jaterní buňky, tkáňové kultury = Alternativní metoda k pokusům na živých organismech Řada testů optimalizována na provedení v mikrodestičkách (high throughput testing) • In vitro modely se dají kultivovat v laboratoři, některé rychle rostou a lze vytvořit mnoho vzorků menších kultur, ke kterým se přidávají do kultivačního prostředí chemické látky a zkoumá se charakter toxických ¥ V ■ I O ucinku Výhody TK: výrazné snížení množství zvířat použitých v experimentu • zajištění vysokého počtu vzorků; původ kontrolních i experimentálních vzorků ze stejné tkáně, což minimalizuje variabilitu získaných výsledků. Nevýhoda TK: možnost sledovat účinky testované látky pouze na konkrétním druhu tkáně, ze kterého byla TK připravena, tedy chybějící možnost posouzení zdravotního stavu a chování celého živočicha. Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Testy na buněčných kulturách ^^^^^ • primární buněčné kultury x stabilní buněčné kultury x kmenové buňky • různé typy buněčných kultur - řada dostupných v buněčných bankách, respektive Sbírkách buněčných kultur. podle předepsaných podmínek (výživa, teplota, vlhkost apod.) lze danou buněčnou kulturu rozpěstovat a použít v toxikologickém testu. buňky se nasazují do speciálních nádob pro pěstování buněčných kultur, přidává se živné medium obohacené o antibiotika, případně antimykotika Primární buněčné kultury - buňky přímo získané z organismu/ od dárce omezená dostupnost - z tkání organismů, jsou nestandardní, variabilita a rozdíly mezi jedinci, což může významnou měrou ovlivnit výsledek testu toxicity (= nízká reprodukovatelnost) omezená doba života v kultuře (Hayflickův limit) - i přes optimální kultivační podmínky většina typů normálních (nenádorových) buněk prodělá pouze omezený, předem daný počet buněčných dělení nutná podrobná charakterizace zdrojové tkáně a postupu izolace (typ tkáně, věk a pohlaví dárce, způsob získání, počet pasáží od jejího stanovení, charakterizace fenotypu i genotypu atd.) - zvířecí: mezidruhová variabilita, etické problémy cemrum pro výzkum - lidské: limitovaná dostupnost heterogenita toxických látek v prostředí Permanentní linie - (kontinuální) => nádorové nebo imortalizované například stabilizované linie kožních buněk, nervových buněk, buněk srdečního svalu, buněk odvozených od tkání ledvin a pod. - často nádorového původu - geneticky nebo epigeneticky abnormální, abnormální genotyp a fenotyp - Relevance? buněčný substrát pro založení kultury pochází z modelových druhů nebo se kdysi získal od lidského dárce (jako vedlejší materiál např. při operaci), pak byl stabilizován a uzpůsoben k neomezenému dělení a následné kultivaci. lidské: 1951 - HeLa (cervikální karcinom) Imortalizace: • Spontánně (pomalé a málo účinné, někdy záměrná indukce mutageneze) • Cíleně - transdukce virem -HPV, SV-40, mutageny, umělá exprese či inhibice klíčových molekul - např. telomerázy (hTERT), onkogeny • možno získat stabilní buněčné linie z různých orgánů a z různých druhů organismů tyto linie se velmi dobře přechovávají v hybernovaném stavu. • v současné době dostupné stovky permanentních linií Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Primární kultury Heterogenní Omezená životnost Náročnější na kultivaci Variabilita mezi izolacem Permanentní linie Homogenní - klonální Nesmrtelné Snadno kultivované i Genetická nestabilita Mimic in vivo Tissue Phenotype - Karyotypic Stability Proliferative Capacity Inter-Experimental Reproducibility Cost Ease of Use Primary Cells Diploid Low High hTE RT-I mm ortaized Diploid/ Pseudodiploid +++ Good Medium ++ Testy kožní dráždivosti a leptavosti In vitro - Modely lidské kůže EpiPerm a Episkin 1 • trojrozměrný model lidské kůže - rekonstruované epidermis s funkční stratům corneum - účinek testované látky na životnost buněk • cytotoxicita je vyjádřena jako redukce aktivity mitochondriální dehydrogenázy • testovaná látka je umístěna na stratům corneum epidermálního modelu, expozice ukončena omytím fosfátovým pufrem. Pak tkáně inkubovány s MTT (žlutá tetrazoliová sůl). Pokud jsou buňky živé, MTT je v mitochondriích redukován sukcinát dehydrogenázou na modrý formazanový precipitát. Ten je přes noc z buněk vyextrahován okyseleným izopropanolem a kvantifikován spektrofotometricky. Adult skirt cells are cultured and added to a dish containing a layer of collagen gel. Skin cells taken from donors of different races will produce ethnically diverse Episkin samples The sample is completely immersed in a medium containing water, sugar and amino acids for} days. The celts begin to grow After 3 days the top of trie skin is exposed to the air for 10 days, allowing it to dry a nd creating a rough layer similar to real skin Intense UV light can be applied to "age" the skin, if needed The skin is then ready for Ihe testing of^^ cosmetics Testy oční dráždivosti a leptavosti stanovení dráždivých a leptavých účinků na oči po jednorázové aplikaci testované látky do oka 1. In silico 2. In vitro - modely EpiOcular 3. Ex vivo - metoda BCOP - test na hovězí rohovce - použití tkání z poraženého dobytka 4. In vivo - pokusné zvíře - albinotický králik ln-vitro - Modely lidské kůže EpiOcular trojrozměrný model umělé tkáně EpiOcularTM z lidských keratinocytů kultivovaných do podoby vrstevnatého dlaždicovitého epitelu podobného lidské rohovce zjišťuje se účinek látky na životnost buněk, cytotoxicita je vyjádřena jako redukce aktivity mitochondriální dehydrogenázy testovaná látka je umístěna na povrch modelu ve 3 expozičních časech inkubace v 37°C, 5%C02 inkubátoru v intervalech - 3 min., 30 min., a 60 min (€» Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Kmenové buňky a z nich diferencované buňky - NOVĚ VYVÍJENÉ MODELY "o fertilised egg self-renewal - Normální nenádorové buňky organismu - Symetrické (self-renewal) a asymetrické dělení (diferenciace) - Proliferační potenciál a potence - Vývoj protokolů pro jejich in vitro diferenciaci do požadovaných typů buněk totipotent stem cells self-renewal blastocyst containing pluripotent stem celľs self-renewal hematopoehicStí neural SCt mesenchymal ^ C í Dospělé (tkáňově-specifické) kmenové buňky i buľii-'.. f .ti1 H i prostredlTerminálné diferencované buňky Izolace (1998 - člověk) 9 9 Embryonálni | kmenové buňky (ESC) Izolace (1997 - člověk) 9 o Dospělé kmenové ^ wusele niiiciiuiřc ^ **" a progenitorové buňky Izolace & Reprogramování (2007 - člověk 99 9 9 Indukované plurípotentní buňky (iPSC) Kmenové buňky r r EMBRYONÁLNI KMENOVÉ BUNKY (ESC) DOSPELÉ KMENOVÉ BUNKY (ASC) STEM CELLS CAN REPLICATE ITSELF OR CHANGE INTO MANY CELL TYPES BLOOD CELLS N L RVE CELL UVER CELLS INTESTINAL CELLS MUSCLE CELLS Blastocysta. INDUKOVANÉ PLURIPOTENTE BUŇKY (iPSC) CARDIAC CELLS EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY (ESC - embryonic stem celis) • celý organismus se vyvíjí z jediné totipotentní buňky (zygoty), která vzniká po oplození vajíčka spermií • totipotentní buňka má schopnost dát vznik jakémukoli typu tkáně včetně tkáně embryonální, obsahuje kompletní genetickou informaci pro celý organismus • v průběhu embryonálního dělení se schopnost totipotence ztrácí • buňky vznikající na počátku embryonálního vývoje jsou pluripotentní, mohou se tedy diferencovat v jakoukoliv buňku embrya, ať už se jedná o buňku ektodermálního, endodermálního či mezodermálního původu • pokud se ESC vyjmou z embryonálního prostředí a kultivují se in vitro mohou dát vznik buňkám nervovým, plicním, krevním nebo pohlavním buňkám navíc se schopností zachovat stabilní karyotyp • z etických důvodů je problém se studiemi s ESC Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Izolace ESC Embryonic stem cells DOSPĚLE KMENOVÉ BUŇKY (ASC- adult stem celis) • nediferencované buňky, přetrvávají i v již vyvinutých a fungujících tkáních • patří mezi buňky multipotentní • na základě různých signálů se mohou přeměnit pouze na některé buněčné typy - umožňují průběžnou údržbu celého těla • každý orgán a každá tkáň v dospělosti obsahuje malou subpopulaci buněk schopných sebeobnovy • nepostradatelné pro hojení poškozených částí těla, pro procesy obnovení jejich funkce a pro správný průběh imunitních reakcí organismu • ASC lze rozdělit na buňky somatické (nacházejí se kdekoliv v těle) a germinální (tvoří gamety a vyskytují se v pohlavních orgánech) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí INDUKOVANÉ PLURIPOTENTNÍ BUŇKY (iPSC) indukované pluripotentní kmenové buňky (Induced Pluripotent Stem Celis, iPSC) jsou kmenové buňky uměle vytvořené z dospělých buněk těla v podstatě z jakékoliv buňky těla lze vytvořit iPSC dospělé nepluripotentní buňky lze změnit v iPSC např. fúzí somatické buňky s některou ze stávajících linií ESC, inzercí některých genů, kdy se pomocí virových vektorů do buněk vloží geny, které regulují přepis genetické informace v buňce a způsobí, že se buňka promění v buňku kmenovou Adult Fibroblast Cell K LR, S0X2, c-Myc, Nanog, Oct-3/4, LIN-28 . Reprogram Cells iPS cells *, "* Á <£t «*■ *k «fc «i (O) Ca rdi o myocytes Adipocytes Dopaminergic Neurons VHematopoietic Progenitor Cells Pancreatic p-Cel Is Motoneurons © R&D Systems, Inc In vitro toxikologie & Kmenové buňky Příklad: Hepatotoxicita - Játra - hlavní detoxikační orgán - Biotransformace / bioaktivace toxických látek - Permanentní jaterní linie (např. HepG2) - nízká aktivita detoxikačních enzymů - malá relevance In vitro diferenciace h ESC do „hepatocyte-like cells" Gen Genová exprese Izol.hepa-tocyty HepG2 CYP2B6 100 0.5 CYP2C9 100 CYP3A4 100 0 UTG1A1 100 5.2 AldB 100 0 Albumin 100 12.3 (Guillouzo2010, Toxicology 270) hESC Culture MTeSR + Mdťígel Endoderm Differentiation RPMI-B27 + AA +- Wnt3a (3 Days) Hepatic Specification SR-DM.SO (5 Days) Hepatic Maturation L-15 + OSM ■h HG F [9 Days} HLC Characterise t ion Day O Do y.* (Greenhough 2010, Toxicology 278) Day 6 Day 11 Day 17 a Organotypic e a plant culture 1 Growth Air-liquid interface medium b Cellular ípheroi d s ApoptosiVanoikis Aggregation Polarization Differentiation C PoLarii*d*pitheliaL cell culture 1 d Artificial skin Keraiinocytes t Mkfocarrier culture Mlcrocarrier Fibre mesh Fibroblasts Vývoj nových modelů 3D modely Kokultivace více typů buněk: • Studium parakrinních účinků • Strukturní a funkční buňky • Odděleně membránami Feeder-layer • Myší fibroblasty • Podklad pro růst jiných b. Bioreaktory, mikrofluidní systémy Ac ho-er r cel;< Organ-on-chip > 3D microenvironment > Multiple cell types > Microfluidics Lower inlet Human-on-chip > 3D microenvironment > Multiple modules representing different organs > Microfluidics Upper inlet Shear flow PE porous ß membrane ^ r Kupffer cell Stellate cell Hepatocyte Sinusoidal endothelial cell 10-Organ Chip -\ 1. Brain Heart Gl-tract Skin Endocrine Kidney Pancreas MECHANISMY chronické toxicity polutantů Princip: různé chronické účinky chemické látky vycházejí ze společného biochemického mechanismu působení - Základní výsledky z mechanisticky založených in vitro testů RECEPTOR Biochemické účinky In vivo účinky I^ORMOfr - zhodnocení in vitro účinků jednotlivých látek • Poznání zásadního mechanismu, predikce rizika • Možné testování většího množství látek a vzorků (HTS metody) - využití pro hodnocení rizik a/nebo monitoring • Určení relativních potencí ("toxických ekvivalentů") -> RA • Biomarkery in vitro - přímá charakterizace komplexních vzorků (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Rece pto rové- medi ova n é mechanismy toxicity ESTROGENNÍ RECEPTOR - ER DNA-bind domain of the Oestrogen Receptor Testy receptorově-mediovaných mechanismů • Jaderné receptory zahrnují několik rodin receptoru: Androgenní receptor (AR), estrogenní receptor (ER), progesteronový receptor (PR), glukokortikoidní receptor (GR) a mineralokortikoidní receptor (MR) jsou hlavními představiteli rodiny steroidních receptoru • Aryl hydrokarbon receptor (AhR) - umístěný v cytosolu • Receptory slouží jako poslové mezi genomem a extracelulárními signály, na které musí buňka reagovat, aby přežila. • Např. AhR regulují na základě interakce s xenobiotiky expresi enzymů I. a II. fáze biotransformace a některých detoxifikačních transportérů, které se přímo podílejí na biotransformaci nebo exkreci xenobiotik. Princip testu: sledovaná aktivita reportérového enzymu odpovídá potenci látky či směsi pro interakci s receptorem aktivita reportérového genu, např. luminometrie - indukce nebo inhibice reportérové luciferázy, nebo spektrofotometrie - indukce nebo inhibice reportérové (3-galaktosidázy Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Studované mechanizmy účinku Interakce s jadernými receptory - důležité mechanismy chronické toxicity Toxicita dioxinového typu • Aryl hydrokarbonový receptor (AhR) • indukce detoxikačních systémů • narušení funkce jater, imunity a reprodukce, endokrinního a nervového systému, karcinogenita, embryotoxicita • „cross-talk" s jinými hormonálními signálními drahami Anti/estroqenita • Estrogenní receptor (ER) • vývoj pohlaví, řízení reprodukce, karcinogeneze, ovlivňuje buněčnou proliferaci a diferenciaci, vývoj a homeostázu (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Anti/androqenita • Androgenní receptor (AR) • vývoj pohlaví, zejména samčích pohlavních charakteristik, řízení reprodukce, karcinogeneze, ovlivňuje růst, spermatogenezi Glukokortikoidní aktivita • Glukokortikoidní receptor (GR) • ovlivňuje vývoj, metabolismus, immunitní odpověď, reakci na stres Anti/retinoidní aktivita • Receptor kyseliny retinové (RAR) • reguluje růst, morfogenezi, apoptozu a diferenciaci, ovlivňuje nervový a imunitní systém, vidění a embryonální vývoj In vitro stanovení dioxinové toxicity - Stanovení na buněčné linii krysího hepatomu H4IIE.IUC - Pod kontrolu AhR-responsivního elementu vložen gen pro luciferázu ÄTP+ lucigenin I H V t J I I V» Ee* \»/ r\ \»/ £ V X-/ J EV Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky In vitro stanovení estrogen n í Estrogen or x en oestrogen aktivity ER / (ji) (j>) * Nuclear Factors EBJO© Protein Phosphorylation of ER: \ Ligand-Independent Activation DNA Binding m RNA / Estrogenic Effects' ER-Responsive Genes Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí In vitro biotesty k detekci dioxinové a estrogenic aktivity Buňky H4IIE-LUC I Buňky íryp™án^ * dá^kovány I Buňky MVLN y + 15,000 buněk/jamku j y Po 24 hodinách vyměněno medium, dávkovány testované látky Expoziční doba : 3-72 hod o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o ooo ooo o o o Po expozici odstraněno medium, buňky vymyty pufrem a přidán Luclite reagent. Po 20 minutách měřena aktivita luciferázy v destičkovém luminometru. Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí In vitro testy na buněčných liniích - hodnocení expozice látkami se specifickým mechanismem účinku (látky s dioxinovou, estrogenní aktivitou) - reportérové buněčné linie transfekované genem luciferázy, který je indukován po navázání ligandu na receptor - kalibrace odpovědi standardním ligandem (2,3,7,8-TCDD pro dioxinovou aktivitu, 17p-estradiol pro estrogenní aktivitu) Vztah mezi dioxinovými toxickými ekvivalenty stanovenými v biotestu na buněčné linii (TCDD-EQ) a spočítanými z výsledků chemických analýz 1600 0 ry I v prostředí 500 1000 TCDD-EQ (pg/g) 30000 25000 ^ 20000 2 15000 O LU 10000 5000 0 y = 1.0764X + 723,67 R2 = 0,8345 . 1500 0 5000 10000 15000 20000 25000 TCDD-EQ [pg/g] Srovnání různých látek -> Použití v hodnocení rizik • Kvantifikace účinků (EC50) - relativní potence • Srovnání s účinkem referenčního toxikantu (2,3,7,8-TCDD) • Vyjádření jako relativní potence/ Ekvivalenční Faktor (~ REP/TEF) 1.E-07 1.E-04 1.E-01 1.E+02 concentration faM) Toxické equivalenční faktory pro PCDDs, PCDFs a PCBs: Table 4. Toxic Equivalent. Factors established by ehe WHO vWHO-TEF*) for dioxinsand dioxin-like PCBíí |4| PCDD Congener WHOTEF PCDF Congener WHOTEF PCB Congener WHOTEF 2,3,7,8-TCDD 1 2,3,7,8-TCDF 0.1 Non-ortho 12,37,8-PeCDD I U3,7>PeCDF 0.05 pcb#81 0.0005 123478 HxCD D 0.1 23478^ Pe CD F 0.5 pcb#77 0.0005 123678~HxCDD L). "I 12347S HxCDF 0.01 pcb#126 0.1 1237,89'HxCDD 0.1 123&78 HxCDF 0.1 pcb#169 0.01 1234ň78^HpCDD 0.01 234ň78^HxCDr 0.1 Mono-ortho OCDD 0.0001 12,37,89^HxCDF 0.1 pcb#105 0.0001 1234678^ h pCD F 0.01 pcb#114 0 0005 1234789^ h pCD F 0.01 pcb#ii8 0.0001 ocdf 0.0001 pcb#123 0.0001 pcb#15Ó 0 0005 pcb#157 0 0005 pcb#1f,7 0 00001 pcb#189 0 0001 Eljarrat & Barceló, Trends Anal. Chem.22: 655 Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Testování komplexních vzorků ze životního prostředí • vzorky vzduchu, sedimentů, půd • rychlý screening znečištění • hodnocena toxicita, genotoxicita, dioxinová a estrogenní aktivita • výběr vzorků pro podrobnější studium/analýzu • spojení s analytickou chemií, frakcionace Problém reprezentativního vzorkování, uchovávání vzorku „pseudopersistentní látky" - kontinuální expozice nízkým dávkám Mobilní Toxicita vodného výluhu ■ ve vodě rozpustné {mobilní) část kontaminace Kontaktní test toxicity -biodostupna část kontaminace Toxicita organického extraktu ■ celková (extrahovatelna část) kontaminace Výhody toxikologických in vitro testů • rychlost, citlivost, reprodukovatelnost, snadnost provedení, menší náklady • ukazují celkovou biologickou aktivitu látek, které působí specifickým mechanismem • možnost provést screening velkého množství vzorků • mohou poukázat na přítomnost toxikologický významných látek, které nejsou běžně analyticky stanovovány • sledují i možné interakce (jako synergismus či antagonismus) působení látek v komplexních směsích Nevýhody toxikologických in vitro testů • nezohledňují biotransformaci látek v organismu • nemohou plně nahradit enzymaticko-imunitní reakci živého organizmu • neposkytují informaci o tom, které jednotlivé látky ze směsí vyvolaly odpověď • poskytují informaci jen o celkové aktivitě látek působících určitým specifickým mechanismem Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Vysokokapacitní skríning High-Throughput Screening Assays automatizované systémy LTS MTS H TS uHTS I ■* — Gene-expression 10s-100s/rok 1000s/den 10s-100s/den Pi J L Ei 1 10,000s-100,000s/den Relevance pro lidi Nákladv/Komolexnos Množství testů/ Jednoduchost Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Paradigm Shift in Toxicity Testing : Tox21 Balance between certainty and cost Human experience 1—3 studies/year Standard rodent toxicological tests 10-100/year Alternative animal models 100-10,000/year Biochemical- and cell-based in vitro assays >10,000/day Vysokokapacitní skríning (HTS) Charakterizace Bioaktivity (Bioactivity Profiling) - biologicky relevantní characterizace chemických látek - vysoká kapacita testování - nutný vývoj a validace /^P~N\ I Centrum pro výzkum (v>;|ľPtrrk ToxCast Budoucnost Testování Toxicit •é 7Ír /n wřro testy in silico analýzy HTS -omics Bioinformatics/ Machine Learning Cancer Q ReproTox DevTox NeuroTox PulmonaryTox ImmunoTox A Tox?/ EPAs Contribution: The ToxCast Research Program Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí www.epa.gov/ncct/toxcast \ ToxCast To^?/ > 600 assays, >8000 chemicals • Research program of EPA's National Center for Computational Toxicology • Addresses chemical screening and prioritization needs for pesticidal inerts, anti-microbials, HPVs and MPVs • HTS technologies to generate biological fingerprints and predictive signatures c/EPA United States Environmental Protection ToxCast HTS Assays -5Ü0 Total Endpoints Cellular Assays Biochemical Assays Protein families GPCR - NR Kinase Phosphatase Protease - Other enzyme Ion channel Transporter Assay formats - Radioligand binding Enzyme activity Co-activator recruitment Primarily Human / Rat Exception: Zebrafish development (Stephanie Pad IIa) I Office of Research and Development | Computational Toxicology Research Program Cell lines HepG2 human hepatoblastoma A549 human lung carcinoma HEK 293 human embryonic kidney Primary cells Human endothelial cells - Human monocytes Human keratinocytes Human fibroblasts Human proximal tubule kidney cells Human small airway epithelial cells Rat hepatocytes Mouse embryonic stem cells (Sid Hunter) Biotransformation competent cells Primary rat hepatocytes Primary human hepatocytes Assay formats Cytotoxicity Reporter gene Gene expression 13 Biomarker production High-content imaging for cellular phenotype 1536 well HTS 10,000 chemicals 25 assays per year ÄEPA Liiflrfl Stil« t nvircnm cfriaj i-rcHMtion ANIEHS -v^'*^ NititMul Imtluti cH r EnviroofTHftWl I1«ahfi Sei«octí N https://www. youtube.com/watch ?v=T4K-YrqtwZA Tox21 ToxCast - h - Launched in 2007 - App. 8000 chemicals - 700+ assay endpoints (cellular and biochemical assays) 300 signaling pathways l rSctcríWflírviKJ-t.ij-J- v>EPA http://www.epa.gov/ncct/Tox21/ Launched in 2008 10,000 chemicals 14 concentrations, 4 logs, 3 replicates 1536 well plates, 2-8 uL volumes -70 assays atiarjaicgr^ntrUrTI prof Advancing . , , , , , I nBiLíPžy&teřfch lat| I v prostředí I^S) FOOD & DRUG f ADMINISTRATION ■ National Toxicology Program ^= U.S. Department of Health and Human Services Toxicity Forecaster (ToxCast™) Computational toxicology research (CompTox) integrates advances in biology, biotechnology, chemistry, and computer science to identify important biological processes that may be disrupted by the chemicals and tracing those biological disruptions to a related dose and human exposure The combined information - helps prioritize chemicals based on potential human health risks. o o r'hase II Released: 2013 Phase III Initiated: 2014 Chemical set: "phl_v2" 1 293 chemicals Chemlcílíftf W * 76S chemicals * -WŮ aisjy cnttpoints ■Chemical set: "ulk" ■ 799 chemicals * "SO assay endpoints V Chemical set: "ph3u • Assay testing in process * ?rS7S chemicals. Phase I (proof of concept, 2007-2009, released 2013) over 300 chemicals well studied chemicals (primarily pesticides, well characterized in animal-based studies) in over 500 HTS assays/endpoints https://comptox.epa.qov/dashboard/chemical lists/toxcast phasel Phase II (completed in 2010, released 2013): ~ 1800 chemicals from a broad range of sources including industrial and consumer products, food additives, and potentially "green" chemicals that could be safer alternatives to existing compounds) in over in 700 HTS assays/endpoints covering a range of high-level cell responses and approximately 300 signaling pathways => the EPA's Endocrine Disruption Screening Program (EDSP) https://comptox.epa.gov/dashboard/chemical lists/toxcast phasel I Phase III (from 2014) ~ 4,500 chemicals consisting of the major portion of the Phase II testing library + newly added ph3 ~ 2,600 chemicals chemical subset (including EPA chemicals previously included in the Tox21 library - TOX21_SL that were not part of Phases I or II of the ToxCast program) up to 2000+ HTS assays/endpoints (description) https://comptox.epa.gov/dashboard/chemical lists/toxcast phaselII o Chemistry Dashboard - https://comptox.epa.gov/dashboard ToxCast /Tox21 Overall Strategy • Identify targets or pathways linked to toxicity (AOP focus) • Identify/develop high-throughput assays for these targets or pathways • Develop predictive systems models: in silico/in vitro —► in vivo • Use predictive models (qualitative): □ Prioritize chemicals for targeted testing □Suggest / distinguish possible AOP / MOA for chemicals • High-throughput Exposure Predictions (ExpoCast) • High-throughput Risk Assessments (quantitative) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ToxCast Assays (>700 endpoints) f Assay Provider\ ACE A Apredica Atta gene BioReliance BioSeek CeeTox CellzDirect Tox21/NCATS IMHEERL MESC NHEERLZebrafish NovaScreen (Perkin Elmer) Odyssey Thera Vala Sciences /I Biological Response cell proliferation and death cell differentiation Enzymatic activity mitochondrial depolarization protein stabilization oxidative phosphorylation reporter gene activation gene expression (qNPA) receptor binding receptor activity steroidogenesis ^Target FamilyN response Element transporter cytokines kinases nuclear receptor CYP450 / ADME Cholinesterase phosphatases proteases XME metabolism GPCRs \^ ion channels ^ item.* • 96-wellplate JS-'.-iVz-lljildlh 153Ü-.VCII phtc V Assay Design viability reporter morphology reporter conformation reporter enzyme reporter membrane potential reporter binding reporter inducible reporter Readout Type single multiplexed multiparametric f Cell Format cell free cell lines primary cells complex cultures free embryos ^ Species N \ human rat mouse zebrafish sheep boar rabbit cattle guinea pig Tissue Source Lung Breast Liver Vascular Skin Kidney Cervix Testis Uterus Brain Intestinal Spleen Bladder Ovary Pancreas Prostate Inflammatory Bone Detection Technology ^\ qNPA and ELISA Fluorescence & Luminescence Alamar Blue Reduction Arrayscan / Microscopy Reporter gene activation Spectrophotometry Radioactivity HPLC and HPEC TR-FRET List of assays and related information at: http://www.epa.gov/ncct/ ToxCast In vitro data (467 assays) Cell Free HTS Multiplexed TF Human BioMap HCS qNPAs XMEs Impedance Genotoxicity (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Cti O E CD 6 ,--, _1_ i J—i i ^ i 1 lllllllllllllllll III inu n um li 11 mni m ■■■li-' ' '— -V i .■. ..\" i v ; i'. •i : J- ' ř1 i. si ToxCast In vitro data (467 assays) Bisphenol A <0.01 0.1 1 10 100 >100 AC50/IC50/lel Concentration (mM) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí 48 Predicting Human Toxicity: The Grand Challenge in Toxicology Complex Cellular and HCS HTS Biochemical Tissues ToxRefDB HTS Tissue Dose Molecular Targets 1 Cellular Systems Cell i Cellular Changes Networks Molecular Pathways Cell-Based HTS Toxicity Model Organism MTS Virtual Tissues (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí 49 High-content screening (hcs) = high-content analysis (hca) method used in biological research and drug discovery to identify substances such as small molecules or peptides that alter the phenotype of a cell. (1) Assay development. (2) Robotics for scaling up the screening process (3) Image acquisition (4) Image analyses - high content Plate Well Field Cell Compartments Features Phenotype Apoptosis GO-arrest Necrosis Translocation Receptor activation sociálni fond v ČR EVROPSKÁ UNIE MINISTERSTVO ŠKOLSIVÍ, OP Vzdělávání MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVANÍ > v- # - - Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí