Epigenetická pamět Vývojová genetika 2022 Obsah • Chromatin-remodelující proteiny – funkce histonové informace • Paměťové proteiny a jejich funkce • Polycomb • Thritorax • Epigenetické reprogramování • Vývojové epigenetické změny u savců • Epigenetické změny navozené umělým zásahem • Vývojové epigenetické změny u rostlin „Writers, erasers and readers“ Acetyltransferázy Methyltransferázy Kinázy Ubiquitinázy Deacetylázy Demethylázy Fosfatázy Deubiquitinázy →Rozpoznání specifických histonových značek → Vazba dalších remodelujících proteinů a chromatin-modifikujících enzymů (změna funkce a architektury chromatinu-Swi, ISWI…) →PcG, TrxG paměťové proteiny? Dedola et al. 2019 Klasifikace chromatin modifikujících enzymů • Kovalentně modifikující komplexy (předchozí přednáška) • Acetylázy/deacetylázy • Methylázy/demethylázy • Ubiquitinázy/deubiuitinázy • Kinázy/fosfatázy • aj. • ATP-dependentní chromatin modifikující komplexy • Rozpoznávají histonové modifikace, některé komplexy mají schopnost vlastní modifikace a chromatinové organizace (např. HDAC a Chd3/4 – NURD komplex) • Epigenetické faktory, které používají pro změnu chromatinu energii z hydrolýzy ATP • SWI/SNF (SWItch/Sucrose non-fermentable) – někteří zástupci TrxG proteinu • ISWI (imitation of SWI) • CHD family (Chromodomain helicase DNA binding protein family) • INO80/SWR Srovnání chromatin remodelujících proteinů • ATP-dependentní domény jsou typické pro všechny členy, ostatní domény rozlišují enzymy do jednotlivých pod-rodin • Každý enzym se váže s několika dalšími podjednotkami vytvářející multi-proteinové komplexy, které mění pozici nukleozomu nebo strukturu chromatinu = otevřený x zavřený ATP doména Becker 2013 →nucleosome spacing (disorder) →nucleosome spacing (higher order after DNA replication) →remodelers involved in transcriptional repression →remodelers important for DNA repair Tři hlavní typy chromatin remodelujících enzymů a jejich vztah k histonovým modifikacím • SWI/SNF (SWItch/Sucrose non-fermentable) • ISWI (imitation of SWI) • CHD family (Chromodomain helicase DNA binding protein family) • Většina mutantů deficientní pro tyto komplexy je neviabilních (alespoň u živočichů)! Marnie Blewitt The University of Melbourne Funkce ATP-nekleozom remodelujících komplexů • Remodelující komplexy umožňují vyšší dostupnost transkripčním faktorům • Pohyb nukleozomu • Odstranění nukleozomu • Výměna za specifikou histonovou variantu (CENP-A, H3.3, ƛ-H2AX…) • Sestavení nukleozomu • Nukleozomová frekvence Becker 2013 Obsah • Chromatin-remodelující proteiny – funkce histonové informace • Paměťové proteiny a jejich funkce • Polycomb • Thritorax • Epigenetické reprogramování • Vývojové epigenetické změny u savců • Epigenetické změny navozené umělým zásahem • Vývojové epigenetické změny u rostlin Koncept buněčné paměti – PcG proteiny Kingstone 2014 Pozitivní regulátory buněčné paměti • TrxG Negativní regulátory buněčné paměti • PRC1 • PRC2 Polycomb proteiny • „Polycomb group“ – multiproteinové komplexy, odpovědné za buněčnou paměť a regulující expresi během vývoje živočichů a rostlin • Umlčení homeotických genů – geny umlčeny PcG cestou jsou trvale deregulovány v buněčné linii (u rostlin VRNPRC2, po vernalizaci zůstává umlčen do další generace) • Tři zástupci, evolučně konzervované • PRC1 – Polycomb Repressive Complex 1 (H2AK119Ub1) • PRC2 – Polycomb Repressive Complex 2 (H3K27me3) • PhoRC – Pho Repressive Complex (vazba a specifikace PcG1 a PcG2) PRC2 komplex – model Drosophila • Hlavní jednotky PRC2 • Extra sex combs (Esc) – zvyšuje aktivitu, neznámý mechanismus • Enhancer of Zeste E(z) – hlavní část pro methylaci (SET doména) • Suppressor of Zeste (Su(z)12) – katalytická aktivita • P55 • Konzervovaná funkce v rostlinách i živočiších, PRC2 katalyzuje H3K27me3 – důležitá modifikace pro vazbu PRC1, katalyzující H2AK119ub • Obě značky mohou vázat ostatní chromatin re-modelující faktory, měnící strukturu chromatinu (ATP-dependentní faktory) nebo tvoří překážku pro transkripční faktory • PCR2 má opačný mechanismus k H3K4me2 (aktivující modifikace) skrze RETINOBLATOMA-BINDING PROTEIN2 Evoluce PcG proteinů a determinace základní funkce • PcG proteiny se vyvinuly dříve v evoluci, zřejmě v posledním společném předkovi všech eukaryot • Absence v S. pombe a S. cerevisiae zřejmě produktem genové ztráty, neznámý důvod • Pro základní funkci PRC2 jsou nejdůležitější podjednotky E(z) a p55 – determinováno na základě chybějících komplexů u modelových organismů • Chlamydonomas reinhardtii (jednobuněčný organismus) – abasence Su(z)12 • Tetrahymena – postrádá Su(z)15 a Esc • E(z) homolog katalyzuje H3K27me3 pomocí RNAi (navazuje methylace H3K9me3, pro kterou je esenciální) Geny PcG proteinů jsou evolučně staré jednotky genomu Whitcomb et al. 2007 • PcG-geny prodělaly několik duplikací, již před rozdělením bezobratlých a obratlovců • Ztráta PRC1 u haďátka • Paralogy PcG genů nemusí interagovat pouze s ostatními jednotkami PRC komplexů, ale mohou řídit celou řadu funkcí • Diverzifikace PcG genů zřejmě umožnila adaptivní rozpětí obratlovců během evoluce živočichů a savců • Expanze PcG genů a jejich evoluce rovněž sledovala evoluci trxG a Hox genů, studium koevoluce „highlevel“ regulátorů umožňuje pochopit složitost a propojenost regulačních drah Diverzifikace PRC2 komplexu u hlavních modelových organismů Grossniklaus 2013 PRC2 komplexy regulují: • Transdeterminace – změna linie kmenové nebo progenitorské buňky na její příbuzný typ • Transdiferenciace – změna buněčné linie na jiný druh buňky bez potřeby dediferenciace jako přechodného stavu Funkce PRC2 proteinů u rostlin • U Drosophila PCR2 homologů v rostlinách došlo k několika duplikacím, které vytvořily celé genové rodiny • Vývoj gametofytu • Fertilizace • Vegetativní vývoj • Květní vývoj (květní indukce, květní determinace) • Extra sex combs (Esc) = jediný homolog, FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE) • Enhancer of Zeste E(z) = CURLY LEAG (CLF), SWINGER (SWN), a FERTILIZATION INDEPENDET SEED 2 (FIS2) • Suppressor of Zeste (Su(z)12) = EMBRYONIC FLOWER (EMF2), VERNALIZATION2 (VRN2) a MEDEA (MEA) • P55 = MULTICOPY SUPRESSOR of IRA 1 – 5 (MIS1-5) Úloha PRC2 komplexů při rostlinném vývoji – diverzifikace funkce pro přesnou regulaci klíčových vývojových stádií Vývoj semen Tranzice kvetení Květní organogeneze Kontrola kvetení epigenetickým reprogramováním jako příklad buněčné paměti Konzervovaná doména PRC1 komplexu • Drosophila • PC – vazba na H3K27me3 • Polyhomeotic (PH) • Posterior sex combs (PSC) – přístup na chromatin (podobnost SU(z)12 • Sex combs extra (SCE) – ubiquitinace H2K118/K119 • U savců došlo k amplifikaci, základní jednotky více konzervovány • U rostlin silná divergence, podobnost funkce LHP1/TEL2 (LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1/TERMINAL FLOWER 2) Grossniklaus 2013 Funkce PRC2 a význam H3K27me3 při regulaci genové aktivity • Umlčení vývojových genů, přechodný stav regulace • Vazbou PRC1 proteinu dochází k trvalému umlčení, vazba dalších modifikujících faktorů • H3K27me3 pouze v genových oblastech, konzervovaná distribuce Úloha PcG proteinů v buněčné paměti Homeotic mutation – mutation displacing body parts (homeosis) Leg imaginal disc undergoing transdetermination event In Su(z)12 mutant are all segments transformed into the eight copy due to misexpression of the Abd-B gene Ring1A-/- mice having eight vertebrosternal ribs Clf-2 mutant with missing petals Grossniklaus 2013 Koncept buněčné paměti – TrxG proteiny Kingstone 2014 Pozitivní regulátory buněčné paměti • TrxG Negativní regulátory buněčné paměti • PRC1 • PRC2 SWI/SNF rodina chromatin remodelujích proteinů u modelových organismů • Oproti PcG proteinům, TrxG jsou více divergované • Někteří členové TrxG patří např. do SWI/SNF rodiny • Funkce „readers and writers“ • Rodina BRM • Všichni členové mají ATPase a Bromo-doménu (afinita acetylovaných residuí) • Každá jednotka obsahuje gen SWI/SNF rodiny a alespoň 8 dalších podjednotek Kingstone 2014 Known function Organism Complexed with nontrxG proteins?Drosophila Human Yeast ATP-dependent chromatin remodeling BRM BRG1/HBRM Swi2/Snf2, Sth1 Yes (5–10)a OSA BAF250 Swi1/Adr6 Yes (5–10) MOR BAF155, BAF170 Swi3, Rsc8 Yes (5–10) SNR1 hSNF5/INI1 Snf5, Sfh1 Yes (5–10) Kismet (KIS) CHD7 – NK Histone methyltransferases Trithorax (TRX) MLL1, MLL2, MLL3 Set1 Yes (5–20) Absent, small or homeotic 1(ASH1) MlLL4, hSET1 hASH1 – NK Mediator subunits Kohtalo (KTO) TRAP230 Srb8 Yes (13–24) Skuld (SKD) TRAP240 Srb9 Yes (13–24) Cohesin subunit Verthandi (VTD) Rad21 Scc1/Rad21 Yes (>3) Transcription factor Trithorax-like (TRL) BTBD14B – No Growth factor receptor Breathless (BTL) FGFR3 – NK Other Sallimus (SLS) Titin NK ASH2 hASH2Lb Bre2 Yes (5–20) Kingstone 2014 Srovnání TrxG a PcG interakcí • Obě rodiny obsahují proteiny, které kovalentně modifikují histony a nekovalentně modifikují chromatin • Modifikace mohou nebo nemusí zvyšovat afinitu TrxG komplexů (SWI/SNF and KIS), PcG (PRC2 and PRC1) a jiných faktorů vedoucím k aktivnímu nebo umlčenému chromatinu Kingstone 2014 Úloha segmentačních proteinů Thritorax a Polycomb při vývoji larvy drozofily • Hranice abd-A a ostatních Hox genů jsou nastaveny paměťovými proteiny trxG a PcG a „off“ „on“ expresním stavem, dělících embryo do 14 segmentů Kingstone 2014 BRM je asociován s RNA PolII BRM TRX trxG mutace blokuje aktivaci Hox genů v PcG mutantech • Aktivace Hox genů v PcG mutantech • Normální vývoj • Absence Hox genů v důsledku mutace trxG Obsah • Chromatin-remodelující proteiny – funkce histonové informace • Paměťové proteiny a jejich funkce • Polycomb • Thritorax • Epigenetické a buněčné reprogramování • Vývojové epigenetické změny u savců • Epigenetické změny navozené umělým zásahem • Vývojové epigenetické změny u rostlin Epigenetické reprogramování u savců • Ke kompletnímu odstranění epigenetických značek dochází během vývoje u savců 2x • Ranná fáze embryonálního vývoje • Vývoj zárodečných buněk = doba sensitivity k vlivům prostředí je nejsilnější v období specifikace zárodečných buněk a následně v první fázi meiόzy (druhá fáze-dozrávání oocytů a spermií, u člověka se liší-ženy 8-10 let, muži 9-12 let) Vývoj zárodečných buněk Pre-implantační doba ranného vývoje Rozdíly ranného a PGC reprogramování • Rychlá a aktivní demethylace paternálního genomu • Pasivní demethylace maternálního geomu • V pozdním vývoji je odstranění DNA methylace rozdílná během spermatogeneze a oogeneze Ranný vývoj PGC vývoj Epigenetické reprogramování u savců – repetice a imprintované lokusy Ranný vývoj PGC vývoj Ochrana DNA methylace – úloha maternálních proteinů v oocytech Liší se ve spermiích a zralých vajíčkách Epigenetické reprogramování zárodečných buněk • Methylace na ICRs oblastech reguluje expresi imprintovaných lokusů- DMRs (=„differentially methylated regions“) • Lokusy líšící se úrovní methylace mezi vzorky nebo alelami navzájem • tDMR – buněčně specifické • cDMR – rakovinné • dDMRs – vývojové • rDMR – reprogramované • AMR – alel-specifické • aDMR – věkově specifické Úloha maternálních faktorů Aktivita DNMT and TET enzymů během reprogramování TET3, DNMT 3a, 3b – de-novo methylace TET1, TET2 DNMT 3a, 3C a 3L Ranný vývoj PGC vývoj Greenberg 2019 Epigenetické reprogramování u savců shrnutí • Zárodečné buňky • Paternální a maternální genomy mají odstraněny všechny značky (reset) • Repetice jsou umlčeny • Imprintované geny mají odstraněný imprinting • Výhradně ve vajíčku • Výhradně ve spermiích • Pre-implantační perioda • Paternální a maternální genomy mají odstraněny všechny značky (reset) • Repetice zůstávají umlčeny • Imprintované geny si ponechávají imprinting dle původu (úloha maternálních proteinů) Vývoj zárodečných buněk Pre-implantační doba ranného vývoje Epigenetické změny navozené umělým zásahem • Působení prostředí • Změny prostředí v průběhu sensitivní periody • Överkalix • Holandský hladomor = „thrifty phenotype“ • Dieta, maternální péče aj. • Vědecky- nebo klinicky-navozené změny • ART, klonování, somatické reprogramování Maternální programování epigenetických stavů Maternální péče jako model „experience-dependent“ chromatinové plasticity mateřská péče o novorozence (lízání a mazlení) DOBRÁ MATEŘSKÁ PÉČE vysoká exprese genu kódujícího glukokortikoidní receptor STABILNÍ PSYCHIKA DOSPĚLÉHO POTOMSTVA (Ac = acetylace histonů) DNA-metyltransferáza ŠPATNÁ MATEŘSKÁ PÉČE nízká exprese genu GR, STRESOVÁ PSYCHIKA DOSPĚLÉHO POTOMSTVA (CH3 = metylace DNA) DNA demetylázy histon-acetyltransferázy serotonin mozkový transmitter mozkový transkripční faktor cyklický adenosin monofosfát protein kináza A Historie buněčného reprogramování Hochedlinger 2015 Epigenetické reprogramování v somatickém buněčném jaderném přenosu (klonování) – ovečka Dolly • Fúze buňky izolované z vemene genetické matky (Fin Dorset) a matky vajíčka (Blackface) • Odstranění buňky vajíčka před fúzí, následná stimulace dělení – embryo vloženo do další matky Blackface • Věk stejný jako genetická matka, Dolly byla jediná ovce z 277 pokusů, která přežila do dospělosti • Jméno po americké zpěvačce – Dolly Parton Nízká úspěšnost klonování a epigenetické následky • Velké efekty v potomstvu – velký plod, placenta • Nedostatečné nastavení imprintovaných lokusů • Imprintované geny regulují růst, hlavně v placentě • Somatické jádro neprochází PGC reprogramováním (ICR lokusy nejsou „pře-nastaveny“, absence změny konformace chromatinu na úrovni gamet – protaminy?) • Efekt maternálních proteinů při ranném vývoji – eroze ICR methylace ? Odkaz ovečky Dolly • Další velká zvířata - prase, jelen, koně a skot • 2007 – tým, který klonoval ovečku Dolly zhodnotil, že klonování a jeho malý úspěch je nedostatečný pro člověka • 2014 – čínští vědci dokázali mít 70 – 80% úspěšnost při klonování prasat • Výzkum kmenových buněk! Klonování ohrožených druhů/druhů na pokraji vyhynutí? =kozorožec pyrenejský Úspěšnost buněčného reprogramování a hlavní faktory vedoucí k pluripotenci • c-Myc – homologie onkogenu viru Myelocytomatosis, transkripční faktor obsahující helix-loop-helix a motif zikového prstu, reguluje celou řadu pro-proliferativních genů • Oct4 – „“octamere-binding transcription factor 4“ – aktivní jako maternální faktor v oocytech a v preimplantační periodě, zabraňuje diferenciaci=udržuje pluripotenci • Klf4 – „Krupple like factor 4“ – transkripční faktor, motif zinkového prstu, regulace telomerázy, kontrola buněčného cyklu a počtu centrozomů (genetická stabilita) • Sox2 – „sex determining region Y-box 2“, obsahuje HMG doménu, transkripční faktor pro udržení pluripotence a dělení, různé úrovně mohou vést k diferenciaci • Pro úspěšné reprogramování musí být kontrolovány a kombinovány specifické transkripční faktory – snížení pluripotentní bariéry • Využití inhibičních látek pro zvýšení úspěšnosti – riziko globálního afektu a mutageneze? Epigenetické reprogramování somatických buněk „Složitost“ epigenetického reprogramování je dána úrovní buněčné diferenciace • Každá úroveň buněčné diferenciace vyžaduje • Změnu stávajících modifikací • Kontrola buněčného plánu (vnitřní plán) • Kontrola buněčného plánu ve vztahu k okolí • Získání nových modifikací • Uměle vyvolané reprogramování vyžaduje • Odstranění typově specifických modifikací • Obnovení modifikací udržujících pluripotentní stav • Obnovení stavu chromatinu • Udržení imprintovaných oblastí • Odstranění XCI (u samiček) • Specifita epigenetických a „dosud“ neznámých faktorů? Specifita modifikací cytosinu - úloha? • Neznámý kontext funkce při buněčné diferenciaci – úloha? • Oxidace 5mC na jeho deriváty v ES buňkách – možná blokace udržovacích methyláz • Oxidační deriváty 5mC mohou měnit funkci/expresi některých genů u terminálně diferenciovaných buněk (Purkyňovi buňky) Kriaucionis 2014 Epigenetické reprogramování a úspěšnost klonování • Globální transkriptomické změny mezi klony naznačují velké abnormality na epigenetické úrovni regulace (stejný genotyp – rozdílnost v úrovních exprese) • Vyšší úspěšnost dosažena přidáním látek, které narušují epigenetický stav buňky (inhibitory methyláz aj.) • Využití • iPS – „embryonic stem cell-like pluripotent cell“ odvozené ze somatické buňky • Terapie – získání kmenových buněk pacienta s určitou poruchou, regenerace orgánů? • Etika – bez podpory se nemůže vyvíjet, chybí placenta=není embryo Zdroj pluripotentních buněk • Kultivace buněk blastocysty • Jaderný přenos do oocytu • Buněčná fúze • iPS (in vitro reprogramování – retrovirový vektor – Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) • iPS reprogramování a dediferenciace není identická k in vivo oplození a materiálu Hochedlinger 2015 Možné terapeutické využití iPS • Dva příklady iPS pro léčbu SMA (spinální svalová atrofie) • Maturace SMA-iPSCs v neuronové buňky a hledání nových látek inhibující degeneraci motorických neuronů • Oprava mutací postihující geny vedoucí k SMA a transplantace opravených motorických neuronů zpět do pacienta Hochedlinger 2015 Změny v epigenetickém reprogramování v důsledku ART • Efekt ICSI („Intracytoplasmic Sperm Injection“) nebo IVF („In Vitro Fertilisation“) – • nárůst v počtu BWS a AS syndromů (ICSI) – maternálně přenosné (1/300 000), u ART dětí nízké riziko • Možné problémy s fertilitou, závislé na věku matky • Narušení sensitivní periody • Změna efektu maternálních proteinů z důvodu odběru oocytů – možná eroze DNA methylace a imprintovaných lokusů během ranného vývoje • Transgenerační efekt? Změny v epigenetickém reprogramování v důsledku ART ICSI/IVF Kultivování in vitro Mechanické zacházení s embryem Odběr zárodečných buněk? Děkuji za pozornost!