Karel Souček Krvetvorba, systém krevních buněk a krvetvorné orgány; principy diferenciace Krev – složení a funkce * Suspenze buněk v roztoku obsahujícím proteiny a elektrolyty (krevní plazma) * Slouží pro transport plynů, výživných a odpadních látek, hormonů a dalších regulátorů * Množství krve u dospělého člověka je ~ 4,5 - 5 litrů (6-8% celkové hmotnosti) * ~ 40% objemu krve jsou buňky * Erytrocyty – transport plynů * Trombocyty – srážení krve * Leukocyty (granulocyty, monocyty, lymfocyty) – obranná funkce * Omezené životnost krevních elementů (3-120 dní) * Krvetvorba zajištuje jejich obnovu, hlavní krvetvorný orgán (s výjimkou lymfocytů) je kostní dřeň Rychlost obnovy buněk http://book.bionumbers.org/wp-content/uploads/2014/08/490-t1-CellsBodyReplacementRate-16.png http://book.bionumbers.org/ Jaký podíl našeho těla tvoří krevní buňky? http://book.bionumbers.org/wp-content/uploads/2014/08/610-f2-CellsHumanMap-3-1.png http://book.bionumbers.org/ Jaký podíl našeho těla tvoří krevní buňky? Hematopoéza * proces tvorby krevních buněk proliferací a diferenciací jejich prekurzorů * * Produkce dostatečného množství krevních buněk vyžaduje •proliferaci buněk mitotickým dělením •diferenciaci buněk během jejich specializace * * Plně diferencované buňky již většinou nemohou proliferovat. * Hematopoetické orgány * Embryo: žloutkový vak, játra, slezina * Fetus: játra, slezina, kostní dřeň * Po narození: * kostní dřeň * většina krevních buněk (erytrocytů, granulocytů, monocytů) * Trombocyty * lymfatické uzliny, thymus, slezina a další orgány s výskytem lymfatických folikulů * lymfocyty * Cell 2008 132, 631-644DOI: (10.1016/j.cell.2008.01.025) Myeloidní: erytropoéza monocytopoéza granulopoéza (eosinopoéza, basopoéza) trombocytopoéza Větve hematopoézy Lymphoidní: produkce T lymfocytů produkce B lymfocytů Buněčná plasticita https://www.researchgate.net/profile/Alexandra-Fronville/publication/262423627/figure/fig1/AS:29694 1222154249@1447807712952/In-1957-Conrad-Waddington-proposed-the-concept-of-an-epigenetic-landscape- to-represent_W640.jpg 1957, Conrad Waddington Figure 1 https://www.nature.com/articles/nrm3543/figures/1 Buněčná plasticita https://www.mdpi.com/ijms/ijms-21-08274/article_deploy/html/images/ijms-21-08274-g001.png https://www.mdpi.com/1422-0067/21/21/8274/htm Charakterizace hematopoetických kmenových a progenitorových buněk - Colony Forming Cell (CFC) Assay https://www.rndsystems.com/resources/protocols/human-colony-forming-cell-cfc-assay-using-methylcell ulose-based-media Figure 3 Charakterizace hematopoetických kmenových a progenitorových buněk – competitive repopulation assay, CRU Immunodetekce History: 1940 – Conns, imunofluorescenční značení kryořezů 1959 – Singer, vývoj metody konjugující protilátky se značkou 1966 - Graham&Karnovsky, metoda značení protilátek enzymy (HRP) 1974 – Taylor&Burns – rutinní imunohistochemie 1975 – Kohler&Milstein – produkce monoklonálních protilátek pomocí hybridomů How are Antibodies Produced | Sino Biological [USEMAP] [USEMAP] Imunofenotypizace * stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací krevních elementů (primárně leukocytů) na základě exprese vybraných povrchových antigenů, případně v kombinaci s intracelulární produkcí cytokinů a expresí intracelulárních antigenů. • •CD („Cluster of Differentiation“) * systém označení povrchových molekul leukocytů. Soubor povrchových molekul (znaků, antigenů) buněk mající stejný epitop, který lze identifikovat stejnou protilátkou. * * Pojí se s určitými funkcemi a vlastnostmi buňky. Většina CD má proto alternativní názvy vztahující se k jejich funkci nebo struktuře. * * Využívají se pro rozpoznávání buněčných populací při imunofenotypizaci. * * Dodnes definovány CD1 až CD350. Některá CD jsou skupinami příbuzných molekul – jednotlivé molekuly se pak označují písmeny (např. CD62L, CD62P, CD62E) * CD molekuly * https://www.biolegend.com/cell_markers * http://www.hcdm.org/ The hematopoietic hierarchy – novel approaches https://kiedit.ki.se/sites/default/files/styles/adaptive/public/celler_niklas.jpg?itok=DjHEP83a Výsledek obrázku pro hematopoiesis map Kostní dřeň * Kostní dřeň poskytuje strukturální podporu a udržuje odpovídající prostředí pro průběh hematopoézy. * * Stroma kostní dřeně je pórovitá fibrózní tkáň tvořená fibroblasty, retikulárními buňkami a kostními buňkami, na kterou adherují vyvíjející se buňky, makrofágy a adipocity. * * Stromální buňky, makrofágy a endoteliální buňky spolu s hematopoetickými buňkami produkují růstové faktory regulující proliferaci a diferenciaci buněk. * * Strukturní molekuly vážou tyto růstové faktory, a tak udržují jejich vysokou koncentraci v kostní dřeni. * * Rozlišujeme: •červenou kostní dřeň – vlastní hematopoéza •bílou kostní dřeň – tuková tkáň * Kostní dřeň a věk * Převažující aktivita: •mládí – ploché a dlouhé kosti •stáří – ploché kosti a konce dlouhých kostí * * Mladí jedinci: kostní dřeň celá červená, hematopoéza probíhá ve všech částech * Dospělí jedinci: středová část kostí se postupně zaplňuje tukem a vytlačuje hematopoetické buňky; hematopoéza v těchto částech probíhá pouze v případě zvýšené potřeby krevních buněk * Hematopoiesis Úbytek telomer, délka telomer a telomeráza. https://doi.org/10.3389/fgene.2020.630186 Dynamika telomer a telomerázy v lidských kmenových buňkách. figure 1 British Journal of Cancer volume 96, pages1020–1024 (2007) Hematopoetická kmenová buňka (HSC) * Má nejen schopnost sebeobnovy, ale dává vznik všem krevním specializovaným buňkám * Dlouhodobé (LT-HSC): velké množství telomerázy * Krátkodobé (ST-HSC): nižší hladina telomerázy => životnost 2 týdny * * sebeobnova Hematopoetická kmenová buňka proliferace diferenciace snižující se proliferace zvyšující se diferenciace Vývojová stádia buněk v kostní dřeni Hematopoetická kmenová buňka je základní sebeobnovující se buňkou se schopností diferencovat do různých typů krevních buněk (multipotentní). Progenitorová buňka je již částečně diferencována a může dávat vznik jen dané buněčné linii (CFU). Téměř a zcela zralé krevní buňky. Hematopoetická kmenová buňka (HSC) * Osteoblastická nika * Vaskulární nika * CXCL12 (stromal cell-derived factor 1, SDF1) reguluje migraci HSCs * Stromální buňky podporují hematopoézu – např. produkcí c-Kit ligandu * Další cytokiny – interleukiny (IL), trombopoetin (Tpo), erytropoetin (Epo) ovlivňují funkci progenitorů Cell 2008 132, 631-644DOI: (10.1016/j.cell.2008.01.025) Hematopoetická kmenová buňka (HSC) https://ebmtonline.forumservice.net/media/04/mda/l/Fig3.jpg https://ebmtonline.forumservice.net/ Hematopoetická kmenová buňka (HSC) https://ebmtonline.forumservice.net/media/04/mda/l/Fig4.jpg https://ebmtonline.forumservice.net/ Cytokiny v hematopoéze Cytokiny * Nízká MW (< 80 kDa), často bývají glykosylovány (glykoproteiny) * účastní se imunity a zánětu, kde regulují intenzitu a délku trvání odpovědi * jsou produkovány - lokálně, po přechodnou dobu * působí zejména autokrinně a parakrinně * jsou vysoce účinné (pM) * interagují vysoce specificky s povrchovými receptory * po vazbě na receptory indukují přenost signálu vedoucí k transkripci cílových genů, výsledný efekt je závislý na konkrétním kontextu * působí v síti, kde * svoje efekty vzájemně ovlivňují (zejm. svoji produkci) * indukují transmodulaci povrchových receptorů * mohou působit na buněčné funkce aditivně, synergicky anebo antagonisticky * * Cytokiny jsou multifunkční + G-CSF ++ GM progenitor cell mature granulocytes GM progenitor cell mature macrophages mature granulocytes mature granulocyte myeloblast mature granulocyte phagocytosis superoxide G-CSF G-CSF G-CSF GM-CSF M-CSF IL-6 multi-CSF SCF (a) (d) (c) (b) (a) cell production is dependent on regulator stimulation (b) induction of commitment to form cells in a restricted lineage (c) initiation of maturation (d) stimulation of functional activity Úloha IL – 1 v hematopoéze T-cells endothelial cells fibroblasts epithelial cells IL-1 GM - CSF ELAM - 1 ICAM - 1 IL - 2 IL - 6 G - CSF 1. monocyte production and activation 2. proliferation of committed progenitor cells (BFU-E, CFU-GM) 1. neutrophil activation 2. neutrophil production 3. stem cell activation 1. T - cell growth 2. Ig secretion adhesion of leukocytes to other cells clonal expansion of differentiated B - cells Úloha TGF-β v hematopoéze Regulatory effects of TGF-β on the growth/proliferation and maturation/differentiation of developmentally distinct hematopoietic cells.BFU indicates burst-forming unit; CFU, colony-forming unit; HPP, high proliferative potential; DC, dendritic cell; E, erythroid cell; G, granulocyte; M, monocyte/macrophage; and Mk, megakaryocyte. Cytokiny působí v síti vzájemných interakcí GM - CSF T cell B cell macrophage Bone marrow IL - 3 IL - 1 IFN - g IL - 2 IL - 4 IL - 1 LPS TNF (-)TNF G - CSF Antibody Cell 2008 132, 631-644DOI: (10.1016/j.cell.2008.01.025) LT-HSC, long-term hematopoietic stem cell; ST-HSC, short-term hematopoietic stem cell; CMP, common myeloid progenitor; CLP, common lymphoid progenitor; MEP, megakaryocyte/erythroid progenitor; GMP, granulocyte/macrophage progenitor; RBCs, red blood cells. Hierarchické působení transkripčních faktorů Stárnutí hematopoetických kmenových buněk Blood (2018) 131 (5): 479–487. Hypothetical tracing of the offspring of a single HSC during aging. In mice, the most primitive HSC are believed to cycle only once every ∼4 months.23 With each cell division, daughter cells lose developmental (long-term repopulating) potential, such that each daughter is less potent than its ancestor. Cell-cycle times decrease with developmental stage. In young mice, the pool of stem cells is small, but the potency of each stem cell is high. In aged mice, the pool of stem cells has expanded, but their functionality is restricted. Adapted from Van Zant et al24 and Jung et al.25 In aged mice, the absolute number of cells with regenerative potential increases, but the extent to which individual aged cells contribute to blood cell production becomes highly variable. The relative frequency of stem cells with high regenerative potential (white) compared with cells with low regenerative potential (gray and black) thus decreases upon aging. Cell-intrinsic mechanisms that contribute to HSC aging. Although some of these molecular events are difficult to revert, other may be amenable to pharmacological interventions and could be exploited to rejuvenate HSCs. ROS, reactive oxygen species. Erytrocyty * Buňky (bikonkávní disky, 7,5 µm) bez jádra a dalších organel (u savců), malé kondenzované jádro a organely u ptáků plazů, obojživelníků a ryb * Vnikají z jaderných prekurzorových buněk * Obsahují hemoglobin, 95% všech proteinů erytrocytu * Vývoj v kostní dřeni cca 8 dní * Doba života cca 120 dní * Staré erytrocyty likvidovány makrofágy v kostní dřeni, v játrech a slezině scheme of erythropoesis 1 Membránová organizace erytrocytu * Plochá síť filament spektrinu propojena krátkými filamenty aktinu je ukotvena pomocí adaptorových proteinů k membráně * Jsou pasivně tvarovatelné, důležité pro prostupnost kapilárami, stárnoucí buňky ztrácí flexibilitu • Vývojová stádia erytrocytů http://www.mcl.tulane.edu/ kmenová buňka proerytroblast (pronormoblast) basofilní erytroblast polychromatofilní erytroblast ortochromatofilní erytroblast (normoblast, metaerytroblast) ortochromatofilní erytroblast extrudující jádro reticulocyt (polychromatofilní erytrocyt) zralý erytrocyt Regulace erytropoézy * Obecné faktory * hypoxie –> erythropoietin (embryogeneze - játra, po narození v peritubulárních buňkách kortexu ledvin) * růstové faktory, hormony (testosteron vs. estrogeny) * vitamíny * Maturační faktory * Vitamin B 12 * Folic acid * Faktory nezbytné pro produkci hemoglobinu * Vitamin C – napomáhá absorbci železa (Fe+++ - Fe++) * Proteiny – aminokyseliny pro syntézu globinu * Železo a měď pro syntézu hemu * Vápník, kobalt, nikl * Regulace erytropoézy Shilpa M. Hattangadi et al. Blood 2011;118:6258-6268 Erytropoéza a EpoR tour de france doping riders and podium Biological passport: Effective fight or futile failure? | The Science of Sport https://www.insidethegames.biz/images/2013/03/Athlete_Biological_Passport_130313.gif Opinion | How to Get Doping Out of Sports - The New York Times Regulace erytropoézy Hypoxie koordinuje syntézu EPO s metabolismem železa Volker H. Haase Am J Physiol Renal Physiol 2010;299:F1-F13 ©2010 by American Physiological Society Hypoxia coordinates EPO synthesis with iron metabolism. Shown is a simplified overview of hypoxic and HIF-mediated effects on iron metabolism. HIF-2 induces renal and hepatic EPO synthesis in response to hypoxia, which results in increased serum EPO levels (circle), stimulating erythropoiesis. Renal and liver EPO responses are modulated by dermal HIF-1 (see the text). Also, included in this schematic is the recently described contribution of glial cell-derived EPO to the serum EPO pool. An adjustment of iron metabolism is needed to satisfy increased iron demand in the bone marrow. In the duodenum, duodenal cytochrome b (DcytB) reduces ferric iron (Fe3+) to its ferrous form (Fe2+), which is then transported into the cytosol of enterocytes (square) by divalent metal transporter-1 (DMT1). DcytB and DMT1 are both hypoxia inducible and HIF-2 regulated. Absorbed iron is released into the circulation by ferroportin (FPN) and is then transported in complex with transferrin to liver, reticuloendothelial cells, bone marrow, and other organs. Transferrin (Tf) is HIF regulated, and hypoxia increases its serum levels. Hypoxia, low serum iron levels, and increased “erythropoietic drive” inhibit hepcidin synthesis in the liver, resulting in diminished FPN cell surface expression in different tissues. As a result, more iron is released from enterocytes, hepatocytes, and reticuloendothelial cells (RES). When intracellular iron levels are low, iron regulatory protein (IRP) inhibits HIF-2α translation and diminishes hypoxia-induced erythropoiesis. Trombocyty * Krevní destičky, 250 tis./ul * Klíčová role při srážení krve * Bejzaderné fragmenty megakaryocytů * postupné zvětšování buňky jako výsledek tzv. endomitóz (replikace chromosomů bez rozdělení jádra) * vznik obrovské polyploidní buňky (až 64 sad chromosomů) – megakaryocytu (až 150 µm) * vznik cytoplazmatických granul * odštěpování fragmentů (trombocytů) z periferie (až 8 000 z jedné buňky) * stadia: megakaryoblast, promegakaryocyt, megakaryocyt * * V cirkulaci cca 10 dní, likvidace makrofáfy sleziny a jater * Tvar bikonvexního disku, 2,5µm * Tvar udržován mikrotubuly * Na membráně receptory pro adhezi * Obnažený kolagen při poranění cévy vyvolá adhezi - > aktivace, vytvoření pseudopodií a uvolnění granul Trombocyty Aktivace a adheze trombocytů Copyright © American Heart Association, Inc. All rights reserved. Henri H. Versteeg et al. Physiol Rev 2013;93:327-358 ©2013 by American Physiological Society Trombolýza * léčebný proces, který má za cíl rozpuštění krevní sraženiny vzniklé v některé cévě (trombus), nebo zanesené do místa uzávěru krevním tokem z jiného místa (embolus) * Aplikace látek která rozpouští krevní sraženiny, např. rekombinantních aktivátorů plazminogenu * používá v akutních stavech, kdy je nutné sraženinu rozpustit rychle a účinně - ischemická mozková mrtvice, tepenný uzávěr na dolní končetině a klinicky se projevující masivní plicní embolie Figure 1 : Selective inhibition of integrin α2bβ3 in thrombosis. Výsledek obrázku pro tromboza příznaky Leukocyty * Slouží k obraně organismu v intersticiu, 5 tis./ul krve * Granulocyty, monocyty, lymfocyty * Cirkulaci opouštějí po krátké době (kromě lymfocytů) a zůstávají v extravasálním prostoru * Granulopoéza * označení pro vývoj všech granulocytů (neutrofilních, eosinofilních a basofilních) nebo někdy jen vývoj neutrofilních granulocytů. * * Počáteční prekurzory neutrofilních granulocytů jsou společné s monocyty. Na úrovni progenitorů GM-CFU se linie rozdělují. * Granulocyty po dokončení diferenciace zrají v kostní dřeni a potom jsou uvolňovány do krevního řečiště. V případě zvýšené potřeby neutrofilů se uvolňují do krevního řečiště nezralé neutrofily – tyčky. * Z krve migrují do různých tkání na základě stimulace chemotaktickými faktory. * Monocytopoéza * obtížná identifikace stadií v běžném krevním nátěru * monoblast, promonocyt, monocyt (vývoj trvá přibližně 55 hod.) * změna tvaru jádra * vývoj azurofilních granul (GER, GA) * zralé vstupují do krve, cirkulují 8 - 16 hod., pak vstupují do tkání a dozrávají v různé typy makrofágů, které mají obvykle životnost několik měsíců * kmenová buňka myeloblast promonocyt monocyt Lymfocytopoéza * progenitory všech lymfocytů vznikají v kostní dřeni * některé migrují do thymu, kde se diferencují v T-lymfocyty * ty, které zůstávají v kostní dřeni, se diferencují v B-lymfocyty a migrují do periferních lymfatických orgánů, kde se dále mohou množit (lymfatické uzliny, slezina) * stadia: lymfoblast → 2-3 dělení → prolymfocyt (nemá ještě povrchové antigeny) → dělení → lymfocyt * Lymfatické orgány * Primární * Kostní dřeň * Thymus (brzlík) * Sekundární * Mízní uzliny * Slezina * Slizniční lymfatická tkáň (MALT) * Tonsily (mandle) * Peyerovy pláty * … Lymfatické uzliny * Řetězec filtračních jednotek v systému lymfatických cév * vkleslina = hilus, vstup artérií, nervů, výstup vén, lymfatických cév * na povrchu – pouzdro = capsula – husté kolagenní vazivo → trabekuly * podkladem - retikulární vazivo (retikulární buňky, retikulární vlákna, základní amorfní hmota) * Kůra, cortex, B-zóna * Parakortikální oblast, T-zóna * Dřeň, medulla * Kapilární prostory, lymfatický sinus, vystlány endoteliálními buňkami * V případě aktivace zůstávají lymfocyty v uzlině, proliferují a diferencují do efektorových buněk * Neaktivované cirkulují, 5 mil. buněk/min vstupuje z krve do sekundárních lymfoidních orgánů * Slezina * Filtrační a imunitní orgán v krevním oběhu * Funkce * Odstranění zestárlých a poškozených erytrocytů * Červená pulpa (vazivové retikulum protkané venózními sinusy) * Makrofágy pohlcují fagocytované erytrocyty – recyklace * Hemové železo navázáno na ferritin, transport pomocí transferinu do erytropoetických buněk * Z hemu vzniká bilirubin, v komplexu s albuminem transportován do jater, v konjugaci s kys. glukuronovou vyloučen z jater ve žluči * Sekundární lymfoidní orgán * Bílá pulpa, systém lymfatických folikulů (B- lymfocyty, folikulární dendritické buňky) * • Související obrázek Slizniční lymfatická tkáň * Patrová mandle * Povrch tvořen nerohovějícím epitelem, rozbrázděn do cca 20ti krypt * Krypty obsahují epiteliální buňky, leukocyty, mikroorganismy * Pod kryptami – sekundární lymfatické folikuly – B-dependentní oblast * Interfolikulární zóna – T-dependenntní oblast * Slizniční lymfatická tkáň * Lymfatická tkáň střevní sliznice (MALT, Mucosa-associated lymphoid tissue) * Shlukováním lymfatických folikulů v některých částech trávicí trubice vznikají Peyerovy pláty * B dependentní oblast – folikul, T-dependentní zóna vyplňuje interfolikulární oblasti * Povrh epitelu nad folikulem (FAE) neobsahuje mucinózní vrstvu (nebo jen tenkou), chybí klky a pohárkové buňky * M-buňky bez mikroklků, dochází na nich k endocytóze antigenů * Enterocyty transportují protilátky transcytózou * Protilátky IgA jsou tvořeny subepitelovými plasmatickými buňkami * IgA spolu se sekretem exokrinních žláz vážou antigeny a mikroorganizmy – shlukování a opsonizace * IgA i v mateřském mléce – pasivní imunizace trávicího a dýchacího traktu kojence * Thymus, brzlík * Umístěn v mezihrudí, za sternem před perikardiem * Maxima rozvoje dosahuje v dětství (cca 20-30g) * S koncem puberty rychlá involuce, zůstavují jen rezidua v tukovém vazivu * Primární lymfatický orgán systému T-buněk, tvořen retikulárním epitelem (rozvětvené, navzájem spojené buňky, mezi kterými je tkáňový mok) * V časném fetálním období je osídlen prekursory T-lymfocytární linie – thymocyty * Vyzrávání imunokompetentních T-lymfocytů pod vlivem diferenciačních faktorů a kontaktu s retikulárním epitelu thymu, autotolerance Thymus, brzlík * Retikulární epitelové buňky – obsahuji CK vlákna, jsou spojeny desmosomy, * Vrstva u kortexu – obaluje thymocyty – ‚pečovatelské‘ buňky * vytváří trojrozměrnou síť osídlenou thymocyty * Podílí se na pozitivní a negativní selekci T-buněk * Hassalova tělíska – podoba eosinofilních agregátů (jejich počet a velikost roste s věkem) Hemothymová bariéra * ochraňuje T lymfocyty před antigeny cirkulujícími v krvi * souvislá endotelová výstelka kapilár * BL endotelu (perikapilární prostor) - vazivo + perivaskulární makrofágy fagocytují malá množství materiálu, který pronikne cévní stěnou) * BL retikulárního epitelu * perivaskulární hraniční membrána * HTB je vyvinuta v kůře, chybí ve dřeni Involuce thymu Výsledek obrázku pro thymic involution Shrnutí * Krev představuje tkáň s vysokou mírou sebeobnovy, * krvetvorba je hierarchicky organizována, * je precizně řízena prostřednictvím mezibuněčných interakcí a signalizací prostřednictvím solubilních faktorů – cytokinů, * všechny zralé krevní buňky vznikají z hematopoetické kmenové buňky jejíž funkce ovlivňuje prostředí v nice kmenové buňky v kostní dřeni. Literatura * Histologie, Renate Lullmann-Rauch, GRADA, 2012 * Histology – A Text and Atlas, M. H. Ross. W. Pawlina, Wolters Kluwer, 2011 * GUIDE to GENERAL HISTOLOGY and MICROSCOPIC ANATOMY, Petr Vaňhara, Miroslava Sedláčková, Irena Lauschová, Svatopluk Čech, Aleš Hampl, Published by Masaryk University, ISBN 978-80-210-8453-7 * Atlas fyziologie člověka, S. Stefan, D. Agamemnon, Grada, 2016