3D MODELY NÁDOROVÉ TKÁNĚ Úloha č. 1 PŘÍPRAVA MNOHOBUNĚČNÝCH AGREGÁTŮ NÁDOROVÝCH BUNĚK – SFÉROIDŮ Úvod : 3D kultury nádorových buněk (sféroidy) jsou dokonalejším modelem nádoru vyskytujícího se v in vivo podmínkách než běžněji používané 2D monovrstvy. Z tohoto důvodu jsou využívané i pro testy efektivity chemoterapeutik a analýzu změn exprese a aktivace klíčových signálních drah v nádorové buňce. V rámci sféroidu se přirozeně vytváří gradient kyslíku, živin a pH, mezibuněčné kontakty a kontakty buněk s mimobuněčnou matrix. Všechny tyto veličiny mohou významně ovlivňovat efektivitu chemoterapie. Bylo zavedeno několik metod pro efektivní přípravu sféroidů o reprodukovatelné velikosti a tvaru. Sféroidy je možné kultivovat v gelu (kolagen, Matrigel, agaróza) nebo v tekutém kultivačním médiu za využití speciálního plastiku s neadherentním povrchem. V této úloze bude pro tvorbu sféroidů využit plastik, jehož dno bude ošetřené vrstvou 1% agaru. Pro rychlejší agregaci budou buňky kultivovány na orbitální třepačce v médiu se sníženou hladinou séra po dobu 24 hod a vzniklé agregáty budou růst po dobu následujících 5 dnů v kultivačním médiu s 10% hladinou séra. Perifosin je látka cílené terapie. Jedná se o inhibitor kinázy Akt. Deregulace této kinázy je spojena s nádorovou progresí nejen nádoru tlustého střeva, ale i mnoha jiných malignit. Aktivita perifosinu je závislá na pH prostředí, ve kterém se nádorová buňka nachází. V acidickém prostředí je perifosin méně účinný, pro jeho optimální protinádorové působení je tedy vhodné pH kultivačního média zvýšit, např. pomocí NaHCO3. Cíl: Připravit sféroidy z buněčné linie odvozené od kolorektálního karcinomu HCT116. Po dobu 3 dnů sledovat růst agregátů pomocí světelné mikroskopie. Stanovení průměru vznikajících sféroidů v závislosti na čase. Postup: 1. Dno 12ti jamkové destičky ošetřit vrstvou 1% agaru v 1 x PBS. 2. K buňkám HCT116 na 10 ml misce přidat trypsin (2 ml/miska), umístit na 5 min do 37ºC/5%CO2, buňky v trypsinu přenést do 2 ml média s 10% FBS (inaktivace trypsinu), centrifugace 4 min/290 g. 3. Buněčný pelet promýt EDTA/PBS, centrifugace 4 min/290 g. 4. Buněčný pelet suspendovat v 10 ml média DMEM + Glutamin (2 mM), stanovit počet buněk/ml. 5. Připravit 15 ml buněčné suspenze HCT116 (50 000 buněk/ml) v médium DMEM + Glutamin (2 mM) 6. Přidat do jamek 12ti jamkové destičky (1ml/jamka), umístit na orbitální třepačku (75 rpm) 7. Po 24 hod. přidat 10% FBS Úloha č. 2 STANOVENÍ VIABILITY SFÉROIDŮ test MTT, ATP assay, viabilní barvení propidium jodid/calcein-AM Úvod : Sféroidy jsou modelem pro testy cytotoxicity již klinicky používaných chemoterapeutik, ale i chemoterapeutik ve stadiu klinického výzkumu. Cytotoxické působení na buňky tvořící sféroid je možné stanovit několika metodami. Jedním z těchto testů viability je test MTT. Je založen na principu redukce žluté tetrazoliové soli (MTT) na fialový formazan. Redukce probíhá jen v metabolicky aktivních buňkách (NAD(P)H oxidoreduktázy). V případě 3D útvarů spolehlivost MTT testu limituje průnik MTT do vnitřních částí 3D útvaru. Proto budou sféroidy před samotným MTT testem disociovány trypsinem na jednobuněčnou suspenzi. Výsledky budou porovnány s výsledky testu MTT získanými na nedisociovaných sféroidech. Mezi testy viability buněk patří i stanovení hladiny intracelulárního ATP. Po přidání enzymu luciferázy a jejího substrátu luciferinu k buněčnému lyzátu obsahujícího ATP dochází k chemické reakci, jejímž produktem je oxyluciferin a vývoj světelné energie (luminiscence). Intenzita luminiscence je úměrná množství ATP v buněčném lyzátu. Dalším testem viability je barvení propidium jodid (PI)/calcein-AM. Nefluorescenční calceinAM proniká do buněk, pouze živé buňky jej činností esteráz hydrolyzují na zeleně fluoreskující calcein. Mrtvé buňky jsou barveny PI, který do živých buněk neproniká. Sféroid značený PI/calceinAM bude umístěn na podložní sklíčko a poměr calcein-AM/PI bude stanoven metodou konfokální fluorescenční mikrokopie (LSCM) a vyhodnocen pomocí programu LasX. Cíl: Stanovit viabilitu buněk sféroidu indukovaných perifosinem (20 µM), NaHCO3 (80 mM) a jejich kombinací metodou MTT, testem ATP a viabilním barvením PI/calcein-AM. Graficky znázornit změny viability buněk tvořících sféroid, v případě testu MTT pomocí absorbance (570 nm), v případě testu ATP pomocí množství ATP v buněčném lyzátů (nM), v případě testu PI/calcein-AM jako poměru intenzity fluorescence PI/calcein. Postup: test MTT: 1. Sféroidy buněk HCT116 indukovat perifosinem (20 µM), NaHCO3 (80 mM) a jejich kombinací po dobu 48 hod. Indukovat vždy 2 sféroidy od každého treatmentu. 2. Sféroidy promýt v 1xPBS, přidat trypsin (10 min., 37 ºC), 200 µl kultivačního média s 10% FBS (inaktivace trypsinu), centrifugace (290g, 4 min.) Do paralelních vzorků trypsin nepřidávat. 3. Buněčný pelet suspendovat v 450 µl kultivačního média se 50 µl zásobního roztoku MTT (5 mg/ml), kultivace 37 ºC, 1 hod. 4. Centrifugace (290g, 4 min.) 5. Odsát směs kultivačního média a MTT, pelet lyzovat v DMSO (200 µl) 6. Stanovit absorbanci při 570 nm (v rozmezí 0,2 – 1) test ATP: 1. Sféroidy buněk HCT116 indukovat perifosinem (20 µM), NaHCO3 (80 mM) a jejich kombinací po dobu 48 hod. 2. Připravit si 1x ATP Detection Sample Buffer. Naředit 2x koncentrovaný pufr sterilní vodou a přidat DTT (1 µl/ml). Připravit si 1x Detection Assay Buffer. Naředit 5x koncentrovaný pufr sterilní vodou a přidat DTT (17 µl/ml). 3. Sféroidy promýt 1xPBS a lyzovat v 1x ATP Detection Sample Buffer (50 µl/sféroid, zachovat i 50 µl Detection Sample Buffer jako blank). Lýzu buněk urychlit zamražením a následným rozmražením na ledu. Centrifugace (10 000g/5 min/4ºC). Supernatant do čisté epinky. 4. Připravit si Reakční směs (50 µl/vzorek): 1 ml 1x Detection Assay Buffer, 5 µl D-luciferinu,10 µl luciferázy NEVORTEXOVAT 5. Připravit si 96 jamkovou destičku. Na dno jamek pipetovat kalibrační křivku: 5µl standardů o koncentraci 10 µM; 1 µM;, 325 nM; 105,6 nM. Do dalších jamek pipetovat 5 µl buněčného lyzátů. Stanovit hladinu ATP i v blankovém vzorku (5 µl 1x ATP Detection Sample Buffer). Nakonec do všech jamek přidat čerstvě připravenou Reakční směs (50 µl/jamka). 6. Inkubovat při pokojové teplotě 15-20 minut. 7. Odečíst luminiscenci, stanovit množství ATP v buněčném lyzátu. test PI/calcein-AM: 1. Sféroidy buněk HCT116 indukovat perifosinem (20 µM), NaHCO3 (80 mM) a jejich kombinací po dobu 48 hod. 2. Sféroidy indukovat calcein-AM (konečná koncentrace 1 µM) a propidium jodid (konečná koncentrace 3 µM) po dobu 1 hod. 3. Sféroidy promýt 1xPBS a v kapce 1xPBS umístit na podložní sklíčko. Ihned analyzovat LSCM. (sekvence 1: laser 488 nm, detektor 500-560 nm) (sekvence 2: laser 552 nm, detektor 600-700 nm) Úloha č. 3 IMUNOHISTOCHEMICKÁ ANALÝZA APOPTOTICKÝCH A PROLIFERAČNÍCH MARKERŮ NA MODELU SFÉROIDŮ Úvod: Ve sféroidech se vytváří přirozený gradient živin, kyslíku a pH. V důsledku tohoto gradientu v okrajových částech sféroidu můžeme detekovat proliferující buňky exprimující protein Ki-67. Naopak v hlouběji položené části sféroidu se nacházejí buňky adaptující se na nedostatek kyslíku indukcí glykolýzy a příjmu glukózy. V centrální části sféroidu pak můžeme detekovat buňky apoptotické nebo nekrotické. Buňky sféroidů mohou reagovat na cytotoxické působení chemoterapeutik indukcí apoptózy, kterou je možné prokázat detekcí zvýšené hladiny štěpené kaspázy 8, kaspázy 3 nebo proteinu PARP. Tyto oblasti se zvýšenou apoptózou v důsledku působení chemoterapeutik je možně očekávat v okrajových i centrálních oblastech sféroidu. V našem cvičení budeme proliferaci a apoptózu sféroidů detekovat imunohistochemickou analýzou distribuce Ki-67 a štěpené kaspázy 8. Sféroidy budou krájeny na kryostatu a ekvatoriální řezy umístěny na podložní sklíčko, fixovány a pomocí specifických protilátek bude zviditelněna lokalizace Ki-67 a štěpené kaspázy 8. Cíl: Pomocí specifických protilátek stanovit prostorovou lokalizace Ki-67 a štěpené formy kaspázy 8 ve sféroidech indukovaných kombinací perifosin/NaHCO3 a porovnat ji s kontrolním vzorkem. Distribuce uvedených markerů bude hodnocena pomocí LasX. Postup: Indukce 1. Sféroidy indukovat kombinací perifosin 20 µM/NaHCO3 80 mM po dobu 48 hod., pro porovnání do experimentu zařadit i neindukované kontroly Umístění sféroidu do želatiny 1. Promýt sféroid 1xPBS 2. Rozpustit želatinu (175 mg/ml 1x PBS) 40ºC 3. 200 µL želatiny na dno kryomolds, po ztuhnutí na želatinu umístit sféroid a zalít 200 µl želatiny 4. Na ledu zanést do -80ºC Krájení sféroidů na zmražovacím mikrotomu (kryostatu) 1. Před krájením ekvilibrovat sféroid a nůž na – 22ºC. 2. Řez ekvatoriální rovinou sféroidu umístit na podložní sklíčko, vysušit 3. Zamzazit na - 20ºC (krátkodobé uskladnění). Imunohistochemie 1. Temperovat řezy na pokojovou teplotu (~30min) 2. Označit hranice řezů pomocí DAKO pen 3. Rehydratace řezů 15 min v 1xPBS/RT 4. 20 min inkubace 4% PFA v 1x PBS, 4ºC 5. Promýt 3x v 1xPBS (na ledu) 6. Inkubace v 0,1% Triton X-100 v 1xPBS, 6 min, RT 7. Promýt 1xPBS (na ledu) 8. Blokace nespecifických vazebných míst 1% BSA in 1xPBS, 30 min, RT 9. Inkubace s primárními protilátkami – roztok v 1% BSA v 1xPBS, přes noc, 4ºC 10. Promýt 3 x v 1xPBS (na ledu) 11. Nanést sekundární protilátku – roztok v 1% BSA v 1x PBS, 1 - 2 h, RT, ve tmě!!!! (ředění 1:600 pro sekundární protilátku), přidat TO PRO (1:1000) 12. Promýt 3 x v 1xPBS 13. Promýt 1 x H2O MiliQ 14. Odstranit přebytek vody ze sklíčka 15. Aplikace montovacího média, přikrytí řezů krycím sklíčkem – uskladnit ve 4º C, prvních 24 hod v horizontální pozici Úloha č. 4 ANALÝZA APOPTÓZY V 3D MODELECH NÁDOROVÉ TKÁNĚ POMOCÍ IMUNOBLOTU Úvod : Apoptóza buněk je tradičně detekovatelná pomocí zvýšené hladiny štěpených forem kaspáz a proteinu PARP. Ve sféroidu se přirozeně vyskytují apoptotické oblasti vznikající s důsledku nedostatku živin a kyslíku. V důsledku působení chemoterapeutik nicméně můžeme očekávat zvýšení apoptózy i v ostatních oblastech sféroidu. Cíl: Zjistit, zda ve sféroidech vytvořených z buněčné limie HCT116 vystavených působení perifosinu, NaHCO3 a jejich kombinace po dobu 2 dnů dochází k indukci apoptózy, porovnání s kontrolním vzorkem. Postup: Příprava vzorků: Sféroidy HCT116 ošetřit perifosinem, NaHCO3 a jejich kombinací (výše uvedené koncentrace), inkubovat 2 dny. Buňky promýt 1xPBS a lyzovat v 2xCSB pufru neobsahujícím merkaptoethanol ani bromfenolovou modř, 4 minuty povařit a uchovávat při –20 oC. Změřit koncentraci proteinů ve vzorcích DC Protein Assay kitem (Biorad). Ke vzorkům přidat alespoň dvojnásobek kompletního 2xCSB pufru tak, aby výsledná koncentrace proteinů v takto naředěných vzorcích byla stejná. Měření koncentrace proteinů (DC Protein Assay Kit): Na mikrodestičku pipetovat 5ul každého vzorku ve třech opakováních. Ke vzorkům přidat 25 ul roztoku A´ (obsahuje 20 ul roztoku S na 1 ml roztoku A). Přidat 200 ul roztoku B, zbavit vzorky bublin a ponechat 15 minu stát. Poté změřit absorbanci na ELISA readeru při 750 nm. Vypočítat vhodné ředění vzorků tak, aby na SDS-PAGE bylo naneseno stejné množství proteinů od každého vzorku. Příprava gelu: 1. S použitím rukavic vyčistit skla, promýt pod tekoucí vodou, umýt detergentem, propláchnout vodou, opláchnout ethanolem a utřít. 2. Sestavit skla se spacery a sevřít je svorkami. 3. Připravit roztok pro dolní gel, jemně promíchat a nalít mezi připravená skla asi do 2/3. Převrstvit gel slabou vrstvou destilované vody. Nechat polymerovat 30 minut. 4. Slít horní vrstvu destilované vody, připravit roztok pro horní gel, nalít jej na dolní gel, vsunout hřebínek a nechat polymerizovat 45 minut. Nanášení vzorků a elektroforéza: 1. Skla s gelem umístíme do elektroforetické aparatury, dolijeme elektroforetický pufr a opatrně vytáhneme hřebínky. 2. Na gel nanášíme 10-20 ul vzorku (množství závisí na koncentraci proteinů v buněčných lyzátech). 3. Připojíme aparaturu ke zdroji. Pro průchod horním gelem aplikujeme 80V, poté zvýšíme napětí na 120V. 4. Elektroforézu zastavím v momentě, když hrana barvičky opouští gel. Sestavení blotovací aparatury: 1. Nastříháme 4 kusy papíru Whatman 3MM a nitrocelulózovou membránu stejné velikosti jako je proteinový gel. 2. Navlhčíme papíry Whatman a pórézní podložky v transferovém pufru. 3. Plastikovou svorku umístíme do vaničky s transferovým pufrem černou plochou dolů. Na ní položíme pórezní podložku a vytlačíme bubliny. 4. Na podložku umístíme 2 navlhčené filtrační papíry Whatman a opět vytlačíme bubliny. 5. Na papíry Whatman položíme gel a na něj opatrně navlhčenou nitrocelulózovou membránu. 6. Na membránu pak opět položíme dva papíry Whatman, vytlačíme bubliny a na ně druhou pórézní podložku. Opět vytlačíme bubliny. 7. Takto sestavený sendvič sevřeme do plastikové svorky a umístíme do vaničky s transferovým pufrem a chladítkem. 8. Blotujeme 1 hod při 400 mA. Detekce proteinů na membráně pomocí protilátek: 1. Po skončení blotingu promyjeme nitrocelulózovou membránu v 5% roztoku sušeného mléka v TBS-Tween po dobu 30 minut při pokojové teplotě nebo přes noc při 4 oC. 2. Inkubujeme membránu s primární protilátkou specifickou vůči štěpené formě kaspázy 8 ředěnou 1:1000 v TBS-Tween 1 hod při pokojové teplotě nebo přes noc při 4 ºC. Jako kontrolu množství proteinů použijeme protilátku specifickou vůči alfa-tubulinu (ředění 1:1000). 3. 3x promyjeme v TBS-Tween (cca 5 minut každé promytí). 4. Inkubujeme membránu 1 hod se sekundární protilátkou konjugovanou s peroxidázou (antimouse/anti-rabbit IgG ředěná 1:15000 v TBS-Tween) při pokojové teplotě. 5. Promyjeme dvakrát TBS-Tween a dvakrát TBS. 6. Opláchneme membránu v destilované vodě. 7. Membránu inkubujeme s chemiluminiscenčním substrátem (Pierce ECL, Thermo Scientific) po dobu 5 minut či supersubstrátem (SuperSignal West Femto, Thermo Scientific) 1 minutu. Chemiluminiscenci detekujeme v temné komoře použitím fotografického papíru. Použité roztoky Transferový pufr: TBS: TBS-Tween: 48 mM Tris 50 ml 1M Tris-Cl pH=8.0 přidat 1,5 ml Tween 20 do 2 litrů TBS 39 mM glycin 57,6 ml 5M NaCl 20%methanol doplnit vodou do 2 litrů Odbarvovací roztok: Tris-glycin elektroforetický pufr (ph=8,3): 500 ml metanolu 25 mM Tris 400 ml destilované vody 250 mM glycine 100 ml kyseliny octové 0,1% (w/v) SDS Barvící roztok: (barvení proteinů) 2,5 g Coomassie Blue na 1L odbarvovacího roztoku doplnit destilovanou vodou do 10ml Dolní (dělící) gel – 10% (10ml) Horní (zaostřovací) gel – 4% (7,5ml) H2O 4,9 ml H2O 5,62 ml 40% Akrylamid 2,4 ml 40% Akrylamid 0,79 ml 1,5M Tris-Cl (pH=8,8) 2,5 ml 1,5M Tris-Cl (pH=6,8) 0,94 ml 10% SDS 0,1 ml 10% SDS 75 ul Ammonium persulfate 75 ul Ammonium persulfate 30 ul TEMED 7,5 ul TEMED 10 ul 2xCSB lyzační pufr 6,9 ml H2O 2 ml glycerol 1,2 ml 1M Tris pH=6,8 0,4 ml 0,2% Bromfenolová modř v 1M Tris pH=6,8 2 ml 20% SDS + před použitím přidat 100 ul beta-merkaptoethanolu k 900 ul 2x CSB Vývojka: 500 ml roztoku G-150 (Agfa) 1500 ml dH2O Ustalovač: 500 ml roztoku G-354 (Agfa) 1500 ml dH2O Úloha č. 5 ANALÝZA BUNĚČNÉHO CYKLU V 3D MODELECH NÁDOROVÉ TKÁNĚ Úvod : Buňky tvořící sféroid mohou být v důsledku nedostatku živin, kyslíku a změn pH zastaveny v některé z fází buněčného cyklu nebo je u nich indukována apoptóza. U buněčných monovrstev tuto zástavu buněčného cyklu a indukci apoptózy nepředpokládáme. Zástavu nebo změnu buněčného cyklu lze sledovat analýzou obsahu DNA v buňkách po obarvení propidium jodidem pomocí průtokového cytometru FACSVerse. Propidium jodid je interkalující barvivo, které se váže k DNA a po ozáření světlem o vlnové délce 488 nm emituje zárení (> 560 nm). Množství navázaného barviva je úměrné množství DNA v buňce. Z jednoparametrové analýzy fluorescenčního signálu propidium jodidu je možné určit obsah DNA v buňkách a tím i fázi buněčného cyklu, ve které se nacházejí. Tento protokol může být modifikován i pro detekci fragmentace DNA (provázející apoptózu) přidáním kroku extrakce nízkomolekulární DNA citrátovým pufrem. Cíl: Vyhodnotit distribuci fází buněčného cyklu v buňkách HCT116 tvořících sféroid a porovnat jej s buňkami tvořícími monovrstvu. Rozlišit apoptotickou frakci buněk ve sféroidu a v monovrstvách pomocí extrakce nízkomolekulární DNA citrátovým pufrem. Indukce 1. Sféroidy i buněčné monovrstvy indukovat kombinací perifosin 20 µM/NaHCO3 80 mM po dobu 48 hod., pro porovnání do experimentu zařadit i neindukované kontroly Postup: 1. Médium dát do zkumavky (15 ml), k buňkám přidat trypsin (37ºC, 10 min.), buňky v trypsinu přidat k médiu ve zkumavce, centrifugace 200g/4min 2. Buňky promýt 1xPBS 3. Pelet rozsuspendovat v 500 µl PBS a přikapat 4 ml vychlazeného 70% etanolu 4. Fixace min. 30 min v 4°C 5. Centrifugace 500g/5 min, odsát supernatant 6. Promýt 800 µl 1xPBS 7. Suspendovat v l ml 1xPBS 8. Přidat 0,5 ml citrátového pufru 9. Inkubace 5 min. při pokojové teplotě 10. Stočit 200 g/5 min 11. Rozsuspendovat ve Vindelově roztoku (obsahuje propidium jodid a RNázu) 12. Barvit 30 min, RT, ve tmě 13. Analýza množství DNA průtokovým cytometrem