37
4 Cytogenetika pavoukovců
Jiří Král & Martin Forman
Studiu biologie bezobratlých je všeobecně věnována menší pozornost než biologii obratlovců. Toto
platí i pro cytogenetiku. Využití cytogenetiky v arachnologii je přitom poměrně široké. Může
sloužit jako metoda použitelná pro systematiku a pro rekonstrukci evoluce jednotlivých skupin.
Díky diverzitě cytogenetických znaků mohou pavoukovci sloužit také jako modelové organismy při
analýze genetických fenoménů, např. holocentrických chromozomů nebo různých modifikací
meiotického dělení. Pavouci jsou nedoceněnou modelovou skupinou při sledování evoluce
pohlavních chromozomů. Bez nadsázky můžeme říci, že systémy pohlavních chromozomů známé u
pavouků nemají u jiných organismů obdoby.
4.1 Buněčný cyklus
Drtivá většina genetické informace eukaryotní buňky je umístěna v jádře. Jaderná DNA je
organizována v chromozomech, jejichž studium je hlavním předmětem cytogenetiky. Materiál
chromozomů (tzv. chromatin) je po většinu buněčného cyklu despiralizován a ve světelném
mikroskopu nelze odlišit jednotlivé chromozomy. K jejich kondenzaci dochází až v průběhu dělení
jádra (mitózy nebo meiózy).
Průběh buněčného cyklu u eukaryotní buňky
I - interfáze - Po většinu buněčného cyklu je buňka v interfázi.
Chromozomy nejsou spiralizované, pod mikroskopem je nelze
rozlišit.
G1 fáze - První růstová fáze. Dochází k růstu buňky,
s chromozomy se neděje nic.
S fáze – Syntetická fáze. Dochází k syntéze DNA (ke tvorbě
druhé chromatidy).
G2 fáze - Druhá fáze růstu. Buňka se připravuje na dělení.
G0 - tzv. stacionární fáze. Pokud buňka nebude ihned pokračovat
v dělení, může z buněčného cyklu na různě dlouhou dobu
vystoupit a ustrnout v G0 fázi, většina buněk v organismu je v G0
fázi.
M - Samotné jaderné a buněčné dělení, zaujímá jen nepatrnou
část buněčného cyklu.
Chromatin rozdělujeme do dvou typů. Euchromatin je méně spiralizovaný, nachází se v něm
většina genů. Oproti tomu heterochromatin je více spiralizován a většinou je tvořen nekódujícími
sekvencemi. Heterochromatinizace může být stálá po celou dobu života organismu, tyto části
genomu označujeme jako konstitutivní heterochromatin. Jiným typem je fakultativním
heterochomatin, který je omezen na určité pohlaví, ontogenetické stádium nebo tkáně.
38
4.2 Mitóza a stavba chromozomu
Část buněčného cyklu, ve které dochází k dělení jádra, se nazývá mitóza. Její hlavní biologickou
funkcí je rovnoměrné rozděleni genetické informace mezi dceřiné buňky. Po ukončení mitózy (po
vzniku dvou dceřiných jader) dojde k dělení samotné buňky. Do mitózy vstupuje chromozom
tvořený dvěma chromatidami, z nichž každá obsahuje identickou dvoušroubovici DNA.
Výsledkem mitózy jsou dva chromozomy, které jsou tvořeny jedinou chromatidou. Mitózu lze
rozdělit na několik fází, je však nutné mít na paměti, že je to dynamický proces, jednotlivé fáze
přecházejí plynule jedna do druhé.
V profázi začíná kondenzace chromozomů, chromozomy jsou relativně dlouhé, často mají tvar
vlnovky, což odráží spiralizaci chromatinu. Na konci profáze se rozpadají jaderné membrány.
V metafázi vrcholí kondenzace chromozomů. Metafázní chromozomy jsou krátké, do oblastí
centromer se na specifickou strukturu (kinetochor) uchycuje dělící vřeténko a začíná rozchod
chromatid. V anafázi jsou chromatidy vřeténkem taženy k opačným pólům. Během telofáze se
chromozomy rozvolňují a tvoří se opět jádro. Pro studium mitotických chromozomů jsou nejlepším
stádiem buňky v metafázi, kdy jsou chromozomy nejvíce spiralizované, a je nejlépe patrná jejich
morfologie.
Telomery - koncové oblasti chromozomu, jejich DNA je tvořena repeticemi (u
většiny pavoukovců se několikanásobně opakuje tzv. „hmyzí motiv“ TTAGG).
Centromera - úsek chromozomu, ve které dochází k navázání dělícího vřeténka.
Obvykle je na chromozomu patrna jako výrazné zúžení (tzv. primární
konstrikce).
Rameno chromozomu - oblast chromozomu mezi centromerou a telomerou.
Kratší rameno se někdy označuje písmenem „p“, delší rameno se označuje
písmenem „q“.
Chromatida – obsahuje jeden řetězec DNA, po metafázi se chromatidy
rozcházejí do dceřiných jader.
.
Mitotické metafáze různých entelegynních pavouků ukazující postupný rozchod chromatid. Vlevo – těsně přiložené
chromatidy na začátku metafáze. Vpravo – chromatidy jsou již dobře separované.
39
4.3 Klasifikace chromozomů
Podle polohy centromery (poměru ramen) rozdělujeme chromozomy na několik morfologických
typů. Základní dělení je na jednoramenné chromozomy (centromera je umístěna na jednom z konců
chromozomu, v mitotické metafázi a metafázi druhého meiotického dělení má chromozom tvar
písmene „V“) a dvouramenné chromozomy (chromozom připomíná písmeno „X“).
Metacentrický Submetacentrický Subtelocetrický Akrocentrický
Zvláštním typem chromozomů jsou holocentrické (někdy nazývané holokinetické) chromozomy.
V tomto případě zcela chybí primární konstrikce, chromozomy postrádají centromerickou oblast
včetně spojení obou chromatid. Dělící vřeténko se u takových chromozomů navazuje na většinu
nebo i celý povrch chromozomu přivrácený k pólu. U pavoukovců se holocentrické chromozomy
vyskytují u štírů čeledi Buthidae, pavouků nadčeledi Dysderoidea a akariformních roztočů.
Schématické znázornění monocentrického (vlevo) a holocentrického (vpravo) chromozomu. V prvním případě je
kinetochor lokalizován na centromeře, v druhém případě pokrývá většinu povrchu chromatid.
4.4 Přestavby karyotypu a karyotypová evoluce
Počet a morfologie chromozomů jsou v rámci druhu obvykle stabilní. Změny v karyotypu jsou
často letální nebo způsobí závažné poruchy vývoje a komplikace (u člověka popsána celá řada
poruch). Ve výjimečných případech však může chromozomová mutace přetrvat a dokonce se
v populaci zafixovat, což vede k diverzifikaci karyotypu mezi organismy. Chromozomové
přestavby jsou důležitým speciačním mechanismem. Srovnáním karyotypu různých taxonů lze
často objasnit jejich vzájemné evoluční vztahy.
Početní změny chromozomů
Polyploidie: Zmnožení celé chromozomové sádky. U pavoukovců hrála roli v evoluci sekáčů.
40
Aneuploidie: Zmnožení jednoho chromozomu, většinou nesprávným rozchodem chromozomů
v mitóze nebo meióze (tzv. nondisjunkce). Jeden z předpokládaných mechanismů vzniku a evoluce
pohlavních chromozomů u pavouků.
Intrachromozomové přestavby
Většina ostatních přestaveb vzniká dvouřetězcovými zlomy DNA chromozomů. Zlomené konce
DNA jsou rekombinogenní (jakoby „lepivé“), takže chromozomy mají tendenci se spojovat ve
všech myslitelných kombinacích. Pokud se přestavba týká jen jednoho chromozomu, mluvíme o
tzv. intrachromozomové přestavbě:
Delece - ztráta části chromozomu.
Inzerce - vložení segmentu do chromozomu.
Duplikace - zdvojení určité části chromozomu.
Transpozice - přemístění určitého
chromozómového úseku do jiné oblasti
Inverze - otočení části chromozomu
a) pokud zasáhne oblast centromery pericentrická
inverze (může změnit morfologii
chromozomu).
b) paracentrická inverze - nezasahuje oblast
centromery.
Interchromozomové přestavby
Pokud jsou do přestavby karyotypu zapojeny nehomologní chromozomy mluvíme o
interchromozomových přestavbách.
Translokace - přesun části chromozomu na nehomologní
chromozom, zahrnuje i vzájemné výměny úseků mezi
nehomologními chromozomy (tzv. reciproké
translokace viz obr.).
Fúze - spojení minimálně dvou chromozomů; podle
způsobu spojení rozlišujeme tandemové a centrické
fúze. Centrické fúze se označují též jako Robertsonovy
translokace.
41
4.5 Pohlavní chromozomy
U některých živočichů je pohlaví určeno faktory vnějšího prostředí (např. teplotou v době inkubace
vajíčka). U jiných je pohlaví určeno při oplození kombinací specifických genů nesených zvláštními,
tzv. pohlavními chromozomy (= gonozomy, heterochromozomy).
Základním způsobem vzniku pohlavních chromozomů je postupná diferenciace chromozomů
nepohlavních (autozomů). Pokud jsou u určitého druhu vyvinuty pohlavní chromozomy, obě
pohlaví se liší sestavou pohlavních chromozomů. Rozlišujeme pohlaví homogametické, kde je
jeden nebo více párů pohlavních chromozomů, z nichž každý je tvořen homologickými
chromozomy, a pohlaví heterogametické, které nese nehomologní pohlavní chromozomy. Pokud je
heterogametickým pohlavím samec, pohlavní chromozomy se označují písmeny X (párový
chromozom) a Y (nepárový chromozom, alozom). Pokud je heterogametickým pohlavím samice,
označujeme pohlavní chromozomy písmeny Z (párový chromozom) a W (alozom). Pokud alozom
chybí, označujeme to číslicí „0“. Pokud je pohlavních chromozomů stejného typu (např. X, Y) více,
číslujeme je spodním indexem. U pavoukovců se můžeme setkat s rozmanitými systémy pohlavních
chromozomů. Zejména pavouci představují v tomto směru značně diverzifikovanou skupinu.
♀ ♂ výskyt u pavoukovců
XY
(typ Drosophila)
XX XY někteří parazitiformní a acarifomní roztoči,
výjimečně u štírků a pavouků jako odvozený
stav
ZW
(typ Abraxas)
ZW ZZ vyskytuje se u některých sekáčů
X0
(typ Pronetor)
XX X častý u štírků a některých pavouků
X1X20 X1X1X2X2 X1X2 nejrozšířenější systém u pavouků
Systémy pohlavních chromozomů
Pokud dojde v evoluci k translokacím nebo fúzím mezi pohlavními chromozomy a autozomy,
autozomy se mohou začlenit do systému pohlavních chromozomů. Tak vznikají často i velmi složité
systémy tzv. nepohlavních chromozomů.
Protože pohlavní chromozomy vznikají z autozomů, jsou v počátečních stadiích evoluce
morfologicky neodlišitelné, homomorfní. Odlišují se jen na molekulární úrovni. Podle některých
názorů jsou mezi živočichy poměrně rozšířené a je velice obtížné je detekovat. U pavouků se
systémem X1X20 byly detekovány pomocí metod elektronové mikroskopie.
Zvláštním typem chromozomového určení pohlaví je tzv. haplodiploidie. V tomto případě nejsou
vyvinuty pohlavní chromozomy, pohlaví jsou odlišeny počtem chromozomových sad. Samci jsou
haploidní (každý chromozom je tedy zastoupen jen jednou) a vznikají z neoplozených vajíček
(arrhenotokie) nebo destrukcí paternální sady chromozomů v embryu (parahaplodie), samice jsou
diploidní. Arrhenotkie je dobře známa u blanokřídlého hmyzu. U pavoukovců můžeme
haplodiploidii nalézt u některých skupin akariformních a parazitiformních roztočů.
42
Meioza
Meioza je specializované dělení, při kterém vznikají pohlavní buňky (spermie nebo vajíčka). Jejími
základními biologickými funkcemi jsou: redukce počtu chromozomových sad (tvorba
haploidních (n) gamet z diploidních (2n) buněk) a tvorba gamet s různými variantami genetické
informace, která je zajištěna jednak náhodným rozchodem homologních chromozomů, jednak
rekombinací. Na rozdíl od mitozy jde o složitější proces zahrnující dvě dělení. Při prvním (tzv.
redukčním) dělení, dojde k rekombinaci a rozchodu homologních chromozomů. Druhé dělení
(ekvační) je analogické mitóze a dochází k rozchodu chromatid.
První dělení - redukční
Profáze I - profáze prvního meiotického dělení je na rozdíl od mitozy poměrně komplikovaný
proces. Kromě kondenzace chromozomů v ní dochází k párování homologních chromozomů (tedy
chromozomů od rodičů) a k jejich rekombinaci. Rozlišujeme několik etap profáze I:
Leptotene - chromozomy se zviditelňují, kondenzují a spiralizují, začínají být morfologicky
odlišitelné.
Zygotene - začíná párování homologních chromozomů a jejich těsné spojení (synapse)
prostřednictvím zvláštní proteinové struktury, synaptonemálního komplexu.
Pachytene - dokončena synapse homologních chromozomů a tvorba synaptonemálního komplexu.
Bivalenty jsou v tomto stadiu poměrně dlouhé. Probíhá rekombinace zahrnující crossing over. Na
konci pachytene se . rozpadá synaptonemální komplex.
Diplotene – rozpad synaptonemálního komplexu je následován oddělováním homologních
chromozomů. Ty zůstávají spojeny jen v místech překřížení nesesterských chromatid, kde předtím
proběhl crossing over (tzv. chiazmata). Sledováním polohy a počtu chiazmat se tedy dají získat
poměrně přesné informace o počtu a poloze crossing overu v karyotypu.
Dikineze - zkracování chromozomů, bivalenty mají tvar křížků, kruhu nebo složitějších útvarů
(podle počtu chiazmat). Na konci diakineze se rozpadají jaderné membrány.
Metafáze I - vrcholí kondenzace chromozomů. Každý pár homologních chromozomů je připojen
kinetochory k dělícímu vřeténku.
Anafáze I - rozchod homologních chromozomů k opačným pólům dělícího vřeténka.
Telofáze I - dekondenzace chromozomů, tvorba jaderných membrán.
Interkineze – modifikovaná krátká interfáze mezi meiotickými děleními (bez syntézy DNA). U
některých organismů chybí. V tomto případě se kolem chromozomů v telofázi nevytváří jaderné
membrány, buňka plynule přechází do druhého meiotického dělení.
Druhé meiotické dělení - ekvační
Profáze II - spiralizace chromozomů, chromozomy jsou dvouchromatidové, je jich haploidní počet.
Na konci profáze se rozpadá jádro.
Metafáze II – Chromozomy se seskupují ve středu buňky. Sesterské chromatidy se oddalují, jsou
však stále spojeny centromerou. Poloha centromer je v této fázi tedy velmi dobře patrná, čehož lze
využít pro stanovení morfologie chromozomů (dvouramenné chromozomy - tvar písmene „X“,
jednoramenné - tvar písmene „V“).
Anafáze II - rozdělení centromer, sesterské chromatidy putují k opačným pólům.
Telofáze II - vznik haploidních jader gamet.
43
44
Chování pohlavních chromozomů v meioze heterogametického pohlaví
Primitivní, málo diferencované pohlavní chromozomy párují v meiotickém dělení prostřednictvím
chiazmat stejně jako autozomy. V průběhu evoluce však dochází k postupné diferenciaci
nepárového pohlavního chromozomu, takže párový a nepárový pohlavní chromozom nakonec
nejsou homologické. Takové chromozomy nemohou rekombinovat a tedy ani párovat
prostřednictvím chiazmat. Pro meiotické párování nehomologických pohlavních chromozomů se
vyvíjejí různé náhradní mechanismy.
Pokud jsou pohlavní chromozomy dostatečně morfologicky diferencovány, lze je snadno
identifikovat v meioze heterogametického pohlaví. Nejvíce prostudovanou skupinou pavoukovců
jsou v tomto ohledu pavouci se systémem pohlavních chromozomů X1X20. Jejich pohlavní
chromozomy v průběhu profáze I navzájem párují. Na rozdíl od autozomových bivalentů není jejich
párování chiazmatické. Je zajištěno různými způsoby, nejznámější je párování prostřednictvím
zvláštní struktury (junction lamina) patrně odvozené od synaptonemálního komplexu. Toto
párování vyžaduje paralelní polohu pohlavních chromozomů, která je u pavouků nejčastější.
Zejména u bazálních skupin pavouků se však můžeme setkat s párováním telomerickými oblastmi
(tzv. end-to-end párování), nebo s přechody mezi paralelním a end-to-end párováním.
V průběhu meiozy jsou pohlavní chromozomy fakultativně heterochromatinizovány, přičemž
vykazují jiný stupeň kondenzace chromatinu než autozomy. Pokud jsou více kondenzovány, jsou ve
světelném mikroskopu více obarveny (tzv. pozitivní heteropyknóza). V jiných případech mohou
být pohlavní chromozomy méně barvitelné (tzv. negativní heteropyknóza) popř. protáhlejší.
Vzorec jejich chování v průběhu meiozy se mezi jednotlivými druhy odlišuje.
a b c
Chování pohlavních chromozomů X1X2 v průběhu samčí meiozy: a – Schizocosa malitiosa (Lycosidae), pachytene, řez
pohlavními chromozomy. Pohlavní chromozomy párují paralelně, mezi nimi je patrná junction lamina (snímek
z transmisního elektronového mikroskopu), b – Pax islamita (Zodariidae), párování pohlavních chromozomů oběma
konci (typ end-to-end párování) v pachytene, pohlavní chromozomy jsou pozitivně heteropyknotické. c – Titanoeca sp.
(Titanoecidae), paralelní asociace pohlavních chromozomů v diakinezi.
Chování pohlavních chromozomů v meioze homogametického pohlaví
Toto chování je detailně prostudováno zatím jen u samic pavouků. Stejně jako u homogametického
pohlaví všech ostatních živočichů tvoří homologické pohlavní chromozomy standardní
chiazmatické bivalenty. Tyto bivalenty jsou však fakultativně heterochromatinizovány podobně
jako pohlavní chromozomy samců, což se u homogametického pohlaví jiných živočichů
nevyskytuje. Heterochromatinizace v pachytene může zabraňovat nelegitimní rekombinaci
pohlavních chromozomů X náležejících k různým párům.
45
Samičí pachytene pokoutníka Tegenaria silvestris (Agelenidae).
Heterochromatizované bivalenty X1X1 a X2X2 jsou označeny šipkami, tyto
bivalenty vzájemně párují koncovými oblastmi.
Modifikace meiozy u pavoukovců
Difúzní stádium
V průběhu profáze prvního meiotického dělení (nejčastěji diplotene) dochází u některých
organismů k dočasné dekondenzaci chromozomů. Tento stav nazýváme difúzním stádiem.
Vyskytuje se patrně u samic všech pavouků, u některých skupin (např. haplogynní pavouci) také u
samců. Rozvolněná struktura chromatinu umožňuje jeho transkripci. V tomto případě tedy mohou
být geny aktivní i v průběhu meiotického dělení.
Difúzní stádium samce pavouka Loxosceles spinulosa (Sicariidae).
Invertovaná meióza
Zatímco u standardní meiózy se rozchází sesterské chromatidy až
v druhém meiotickém dělení, u invertované již v prvním
meiotickém dělení (obr.). Segregační posloupnost meiozy je tedy
v tomto případě převrácena, první dělení je ekvační a druhé
redukční. Výsledný produkt je ale stejný jako u standardní meiozy.
Vyskytuje se u některých živočichů s holokinetickými
chromozomy. U pavoukovců byla invertovaná meióza popsána u
svilušek a některých zástupců nadčeledi Dysderoidea.
Achiazmatická meióza
Achiazmatická meioza je modifikace prvního meiotického dělení. V tomto případě je potlačen
crossing over, nedochází tedy k tvorbě chiazmat. Vyskytuje se u heterogametického pohlaví
některých prvoků, živočichů a rostlin. Ve světelném mikroskopu se tato modifikace projeví absencí
diplotene a diakineze vzhledem k nepřítomnosti chiazmat. Homologní chromozomy párují plynule
po celé své délce až do metazáze I. Stádium nahrazující diplotene a diakinezi se označuje jako
46
postpachytene. Následující meiotické fáze jsou stejné jako u standardní meiozy. U pavoukovců se
vyskytuje u štírů, některých akariformních roztočů, štírků a pavouků.
Meioza u heterozygotů s translokacemi
Chromosomy párují v meiotickém dělení homologními úseky. Pokud dojde k translokacím nebo
fúzím, homologní úseky spolu párují i nadále, přestože jsou translokovány na jiný chromozom.
Proto dochází u takových jedinců v profázi I k tvorbě multivalentů (řetězců nebo kruhů tvořených
více chromozomy). Multivalenty autozomů jsou často nalézány u štírků a štírů, méně obvyklé jsou
u pavouků. Pokud se do translokací zapojí i pohlavní chromozomy mohou vzniknout systémy
nepohlavních chromozomů.
Schematické znázornění vzniku hexavalentu (chromozomového
řetězce s šesti chromozomy) hybridizací jedinců nesoucích
různé translokace. Původní stav byl pět párů akrocentrických
chromozomů. V populacích A a B dojde následně k sérii
centrických fúzí, v každé populaci však fúzují jiné
chromozomové páry. Výsledkem jsou jedinci s metacentrickými
chromosomy. V každé z populací jsou však jejichž ramena
tvořena jinou kombinací původních akrocentriků. Pokud se
zkříží jedinci z různých populací, bude mít vzniklý potomek
metacentrické chromozomy s různými kombinacemi ramen.
V profázi I se vytvoří multivalent, neboť ramena
metacentrických chromozomů budou párovat podle původní
homologie.
Samčí diakineze štírka Atemnus politus (Atemnidae) s
multivalenty, hexavalent (výsek vlevo) a tetravalent (výsek
vpravo).
47
4.6 Přehled vybraných cytogenetických technik
Stanovení velikosti genomu
Nejčastěji se používá metoda průtokové cytometrie. Připraví se suspenze buněk (u pavoukovců
používáme hemolymfu nebo nadrcené končetiny), DNA jader se obarví fluorescenčním barvivem.
Měření probíhá ve stroji – cytometru, který měří intenzitu fluorescence jednotlivých jader. Intenzita
fluorescence je přímo úměrná množství barviva, které se naváže na DNA, tedy velikosti genomu.
Spolu se vzorkem se měří referenční standard (buňky organismu o známé velikosti genomu).
Z poměru standard/vzorek se stanoví velikost genomu vzorku.
Výsledek měření průtokovou cytometrií (histogram), osa X
– intenzita fluorescence, osa Y - počet částic (jader),
maxima odpovídají dvěma typům buněk – standardu a
vzorku.
Velikost genomu se nejčastěji uvádí jako tzv. C hodnota (1C), což odpovídá jeho haploidní
velikosti. Pro přepočet hmotnosti DNA na páry bazí platí, že 1 pg = 978 Mb.
Příprava chromozomového preparátu
Získání živé tkáně s větším počtem dělících se buněk je základem pro chromozomovou analýzu.
Relativně větší frakce dělících se buněk se nalézá v epitelech (např. střevo nebo epitel pohlavních
orgánů), možné je použít i vyvíjející se embrya. Nejčastěji používanou tkání bývají u bezobratlých
pohlavní orgány, kde lze navíc pozorovat i meiotické buňky. U pavoukovců preferujeme použití
samců, kteří jsou ve většině případů heterogametickým pohlavím. U organismů s morfologicky
diferencovanými pohlavními chromozomy je toto pohlaví pro studium výhodnější. Gonády samců
obsahují také mnohem více meiotických buněk než gonády samic.
Před preparací živočicha usmrtíme a ihned poté vypitváme tkáň. Ponoříme ji do hypotonického
roztoku (buňky v takovém roztoku přijímají vodu a zvětšují objem, chromozomy jsou pak lépe
rozprostřeny). Tkáň usmrtíme ve fixáži (nejčastěji směs jednosytného alkoholu a kyseliny octové).
Nakonec je nutno vyrobit suspenzi buněk. Ta je rozvlékána, nakapána nebo roztlačena na
mikroskopickém skle, čímž se snažíme docílit ideálního rozprostření chromozomů. Takto
připravený chromozomový preparát můžeme použít na další aplikace včetně technik molekulární
cytogenetiky.
Stanovení základních charakteristik karyotypu
Pokud preparát obarvíme (v živočišné cytogenetice se používá nejčastěji barvivo Giemsa) a
pozorujeme pod mikroskopem, můžeme zjistit základní znaky karyotypu. Spočítáním chromozomů
v mitózách stanovíme diploidní počet chromozomů (2n). Proměřením jednotlivých
chromozomových párů získáme informaci o jejich relativní délce, podle polohy centromery určíme
morfologii jednotlivých autozomových párů. Analýzou meiotického dělení heterogametického
pohlaví nebo porovnáním mitóz obou pohlaví lze stanovit systém pohlavních chromozomů, jejich
morfologii a velikost. Cenné informace nám poskytne i analýza průběhu meiotického dělení,
48
zaměřujeme se na různé modifikace meiozy (viz výše), frekvenci a polohu chiazmat a chování
pohlavních chromozomů (specifická spiralizace, průběh párování).
Diferenciální barvící techniky
K identifikaci jednotlivých chromozomových párů se v cytogenetice teplokrevných obratlovců
standardně používá G pruhování. Základem této techniky je natrávení preparátů trypsinem. Každý
chromozomový pár má poté specifický vzor tmavších a světlejších příčných pruhů umožňující
jejich identifikaci. U většiny bezobratlých nelze tuto metodu bohužel použít. Jedinou použitelnou
pruhovací metodou je většinou jen tzv. C – pruhování. Při něm dochází k vizualizaci
konstitutivního heterochromatinu. Většina heterochromatinu se nachází v oblastech centromer a
telomer, heterochromatin v jiných oblastech (např. uvnitř ramen) je vzácnější. Tento typický obraz
nalézáme také u většiny dosud prozkoumaných pavoukovců. Konstitutivním heterochromatinem
jsou tvořeny také tzv. B chromozomy. Jedná se o nadbytečné chromozomy, které jsou většinou
odvozeny ze standardních chromozomů. I když se organismus takových chromozomů často
nedokáže zbavit, dokáže je inaktivovat heterochromatinizací. Pro tyto chromozomy jsou typické
nondisjunkce v mitotickém a meiotickém dělení, jejich počet se tak může lišit nejen mezi jedinci
téhož druhu, ale i mezi různými buňkami téhož individua. U pavoukovců jsou tyto chromozomy
dosti vzácné, byly popsány jen u některých štírů, sekáčů a klíšťat.
Molekulárně cytogenetické metody
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a její modifikace jsou nejpoužívanějšími metodami
molekulární cytogenetiky. Účelem FISH je lokalizovat určitou sekvenci DNA v karyotypu. Pokud
máme sondu pro určitý úsek DNA, označíme ji flourescenčním barvivem a denaturujeme (na
jednořetězcovou DNA). Obdobně denaturujeme také DNA chromozomů na preparátu, na který poté
aplikujeme sondu. Preparát necháme hybridizovat se sondou, která se spojí s komplementární
sekvencí na chromozomu. Při pozorování ve fluorescenčním mikroskopu označená sonda
vizualizuje cílovou část genomu. V různých variantách FISH můžeme vizualizovat jakoukoliv
sekvenci DNA (repetitivní sekvence, gen, část chromozomu, celý chromozom nebo genom).
Příklad FISH. Vizualizace genů pro 18S rRNA v karyotypu samce pavouka Stegodyphus dufouri (Eresidae) (2n = 30).
Jedná se o metafázi II, karyotyp je tvořen akrocentrickými chromozomy. Sonda je označena barvivem Cy3 (emituje
fluorescenci v červené části spektra), chromozomy jsou obarveny DAPI (emise v modré části spektra). Geny jsou
umístěny v terminálních oblastech dvou autozomových párů.
49
4.7 Přehled cytogenetiky jednotlivých skupin pavoukovců
Cytogenetice pavoukovců se soustavně věnuje jen několik výzkumných skupin, jedinou evropskou
skupinou je naše laboratoř. Karyotypy jednotlivých řádů jsou různě prostudovány. Největší
pozornosti se těší pavouci, dále pak akariformní a parazitiformní roztoči, štíři, štírci a sekáči.
Probádanost ostatních řádů je velmi nízká, u většiny z nich (Amblypygi, Ricinulei, Schizomida,
Solifugae) nebyly dosud publikovány žádné informace o karyotypu. Celkem byly popsány
karyotypy cca. 1400 druhů pavoukovců.
Scorpiones
Je prostudováno zhruba 70 druhů (2n = 6 - 176). Zástupci čeledi Buthidae mají holokinetické
chromozomy a nižší 2n (obvykle okolo 20). Ostatní zástupci mají monocentrické chromozomy a
vyšší 2n. Pohlavní chromozomy nejsou diferencovány, u všech dosud studovaných druhů byla
nalezena achiasmatická meioza. Častá je heterozygotnost pro translokace a fúze, důsledkem je
tvorba multivalentů v meiotickém dělení.
Tityus magnimanus (Buthidae), karyotyp zkonstruován
z postpachytene.
Opisthacanthus asper (Liochelidae), karyotyp z metafáze II.
Solifugae
Karyotypy dosud nebyly popsány. Podle našich předběžných výsledků jsou chromozomy
monocentrické.
Gluvia dorsalis (Daesidae), mitotická metafáze.
Palpigradi
Byly karyotypovány dva druhy rodu Eukoenenia. Chromosomy jsou drobné, patrně monocentrické.
Pohlavní chromozomy nejsou diferencovány.
50
Karyotypy dvou druhů štírenek – E. spelaea (2n = 18) (nahoře), E.
mirabilis (2n = 14) (dole). Druhý pár E. mirabilis nese konstrikci.
Acariformes
Diverzifikovaná skupina, karyotypy jsou tvořeny nízkým počtem drobných holocentrických
chromozomů (2n = 4 - 28), bylo prostudováno přibližně dvě stě druhů. Pohlavní chromozomy
většinou nejsou diferencovány (u čeledí Acarididae a Glycyphagidae byl popsány systémy X0 a
XY). Pohlaví je často určeno pomocí haplodiploidie.
Mitotická metafáze zástupce čeledi Tetranychidae.
Parasitifomes
Známe karyotypy asi 100 druhů, 2n = 6 až 36. Je zde značná diverzita způsobů determinace
pohlaví. U klíšťat jsou diferencovány pohlavní chromozomy, byly popsány systémy XY a X0.
Často se vyskytuje haplodiploidie včetně parahaploidie (Gamasida), thelytokie.
Klíště Rhipicephalus microplus (Ixodidae), 2n =
22, karyotyp samice.
Ricinulei
Žádný zástupce tohoto řádu dosud nebyl studován.
Opiliones
Dosud byly popsány karyotypy asi 80 druhů, 2n = 10 - 88. Karyotypy jsou tvořeny
monocentrickými chromozomy (většinou dvouramennými). U některých byly popsány B
chromozomy. Pohlavní chromozomy jsou většinou XY (nejsou většinou morfologicky příliš
diferencovány); zástupci čeledi Phalangiidae mají typ Abraxas (ZW, opět nízký stupeň
diferenciace). U některých skupin se vyskytuje thelytokie. Thelytokní formy jsou často polyploidní.
U novosvětských zástupců skupiny Laniatores byl zjištěn vysoký počet chromozomů (viz obrázek),
předpokládá se u nich polyploidizace.
51
Goniosoma proximum (Gonyleptidae) - sekáč s nejvyšším počtem chromozomů (2n = 88).
Pseudoscorpiones
Dosud publikovány karyotypy cca 50 druhů. Počet chromozomů: 2n♂ = 7 (Olpiidae) – 135
(Atemnidae). Značná proměnlivost počtu a morfologie chromozomů. V karyotypech převažují
dvouramenné chromozomy (kromě čeledi Chthoniidae). Pohlavní chromozomy dobře vyvinuty.
Nejčastěji se jedná o X0 systém, chromozom X je dvouramenný a většinou největší chromozom
karyotypu. Systém pohlavních chromozomů může být i XY.
Roncus sp. (Neobisiidae), diplotene. Ve výseku
je podlouhlý bivalent XY.
Lasiochernes pilosus (Chernetidae) 2n♂ = 61, X0.
Pedipalpi: Amblypygi, Uropygi a Schizomida
Publikován byl jen karyotyp 1 druhu řádu Uropygi. Podle našich předběžných výsledků jsou
chromozomy těchto skupin monocentrické.
52
Ginosigma schimkewitchi (Uropygi: Thelyphonidae), 2n♂
= 44, metafáze II.
Araneae
Pohlavní chromozomy pavouků
Jak už bylo zmíněno, systémy pohlavních chromozomů tvořené více chromozomy X se nacházejí u
většiny dosud studovaných pavouků. U ostatních živočichů jsou tyto systémy vzácné. Nejčastěji
nalézaným stavem je X1X20 systém. Ten byl nalezen u cca 70% studovaných druhů.
Pravděpodobně je evolučně původní, neboť byl objeven i u nejprimitivnějších pavouků – sklípkošů.
X1X20 systém se v evoluci dále vyvíjel. Poměrně často nalézáme systémy se třemi chromozomy X.
Vzácněji byly objeveny i systémy s větším počtem X. Jiným typem chromozomového určení
pohlaví u pavouků je systém X0. Všechny tyto systémy můžeme nalézt u nepříbuzných čeledí, tudíž
vznikaly opakovaně. Systém X0 vznikal patrně fúzemi popř. degenerací jednoho chromozomu X
v systému X1X20. Systémy s více chromozomy X vznikaly nondisjunkcemi či rozpady.
Oecobius spp., pozdní profáze I. Systémy pohlavních chromozomů X0, X1X20, X1X2X30.
Systémy obsahující chromozom Y
Jako odvozené stavy vznikly u pavouků systémy nepohlavních chromozomů, obsahují vždy
chromozom(y) Y.
53
Vlevo: Schématické znázornění vzniku systému X1X2X3Y u skákavek rodu Habronatus. Systém vznikl tandemovou
fúzí chromozomu X2 a autosomu A1 a centrickou fúzí autozomů A1 a A2. Vpravo: Diakineze s multivalentem
pohlavních chromozomů X1X2Y
Jiným systémem obsahujícím chromozom Y je X1X2Y, objevený u pěti čeledí haplogynních
pavouků. Vznik tohoto systému není objasněn, může se jednat o starobylý nepohlavní systém.
Loxosceles spinulosa –Pohlavní chromozomy X1, X2 a Y tvoří v profázi I samce
typický trivalent. Systém X1X2Y se vyskytuje u celé řady haplogynních pavouků.
Tento systém se u čeledi Pholcidae dále vyvíjel (dole) až na systém X0. Sérií inverzí
se z metacentrických X1 a X2 staly akrocentrické X1 a X2, po centrické fúzi vznikl
dvouramenný X. Y zmizel z karyotypu degenerací.
Základní údaje o karyotypech jednotlivých větví pavouků
Publikovány jsou karyotypy téměř 700 druhů. Seznam karyotypovaných pavouků a dalších
pavoukovců můžete nalézt na http://www.arthropodacytogenetics.bio.br/spiderdatabase/index.htm.
Nejprostudovanější skupinou pavouků jsou entelegynní pavouci, ostatní skupiny byly studovány
spíše okrajově.
Sklípkoši (Mesothelae): karyotypován jeden druh (Heptathela kimurai, 2n♂ = 80, X1X20),
chromozomy jsou akrocentrické.
Sklípkani (Mygalomorphae): převažují dvouramenné chromozomy, značný rozsah počtu
chromozomů (2n♂ = 14 – 32). Enormní variabilita v systémech pohlavních chromozomů,
nejčastější jsou systémy s jedním až čtyřmi chromozomy X. Vzácně se vyskytují i systémy s více
než deseti (!) chromozomy X.
54
Diverzita mezi karyotypy dvou blízce příbuzných druhů sklípkánků rodu Atypus (Atypidae). Vlevo - A. muralis
(2n♂ = 41, X0). Vpravo A. affinis (2n♂ = 14, XY). Karyotyp tohoto druhu vznikl sérií fúzí. Karyotypy byly
sestaveny z mitotických metafází.
Araneomorphae
Haplogynae a skupiny s nejistým zařazením
Z cytogenetického hlediska zde můžeme rozlišit dvě základní linie: a) pavouky s holokinetickými
chromozomy (nadčeleď Dysderoidea) a b) pavouky s monocentrickými chromozomy (ostatní
studované skupiny).
Dysderoidea: Patří sem pavouci s nejnižším počtem chromozomů. Díky holokinetické stavbě
chromozomů jsou u těchto pavouků snáze tolerovány rozpady a fúze chromozomů resp. další
přestavby chromozomů. Velkou diverzitu v karyotypech některých rodů lze využít pro
cytotaxonomické účely.
Ostatní haplogynní pavouci: karyotyp je tvořen převážně dvouramennými chromozomy, 2n♂ =
13 – 37. Častý výskyt systému pohlavních chromozomů X1X2Y (méně často X0, XY nebo X1X20).
Entelegynae: Karyotyp většiny entelegynů je tvořen výlučně akrocentrickými chromozomy, 2n♂ se
pohybuje obvykle mezi 20 a 40. Ancestrální karyotyp byl pravděpodobně 2n♂ = 42, X1X20 nebo
2n♂ = 43, X1X2X30, v evoluci docházelo ke snižování počtu chromozomů fúzemi. Většinou nízká
diverzita karyotypu (není výjimkou, že celá čeleď nebo dokonce několik příbuzných čeledí má
shodný počet chromozomů).
55
Karyotypy araneomorfních pavouků. a – haplogynní pavouk Kukulcania aff. hibernalis (Filistatidae), 2n♂ = 25,
X1X2Y. Chromozomy jsou dvouramenné, včetně mikrochromozomu Y (zvětšen ve výseku). b – Dasumia carpathica
(Dysderoidea), 2n♂= 7, X0. Karyotyp je tvořen nízkým počtem holokinetických chromozomů. c – zástupce
entelegynních pavouků, slíďák Pardosa wagleri (Lycosidae), 2n♂ = 28, X1X20. Všechny chromozomy jsou
akrocentrické. Všechny nesou centromerický heterochromatin (vizualizován pomocí C - pruhování).
56
Úkol