Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 2 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie a, Representative flow cytometry plots (left) and percentage of degranulating NK cells isolated from the blood of ten healthy donors (right), as measured by surface CD107a, in response to uninfected and ZIKVinfected JEG-3 cells (8 h coculture, E:T ratio 1:3). b, NK cell-specific killing of uninfected and ZIKV-infected JEG-3 cells. c, ER stress, as assessed by XBP1 splicing (left) and increases in BIP (middle) and CHOP (right) mRNA, in JEG-3 cells that were uninfected or infected with ZIKV, HSV-2 or human cytomegalovirus (HCMV) for 1–2 days or treated with tunicamycin (Tu) for 1 day. Indicated samples were pretreated with the ER stress inhibitor salubrinal (n = 3 samples). mRNA levels, as assayed by quantitative PCR with reverse transcription (RT–qPCR), were normalized to ACTB. d, Effect of salubrinal pretreatment of target cells on NK cell killing of ZIKV-infected (top) and tunicamycin-treated (bottom) JEG-3 cells (n = 6 samples). e, Effect of NKR-blocking antibodies (Ab) on NK cell killing of uninfected or ZIKVinfected JEG-3 cells (n = 3–7 samples). Ctrl, control. f, Specific killing of the classical NK cell target 722.221 cells, or of uninfected or ZIKV-infected JEG- 3 cells by human NK cell line YT cells knocked out for NCR1 or NCR3 or treated with control single-guide RNAs (n = 3–6 samples). g, Representative flow cytometry histogram (left) and mean fluorescence intensity (MFI) of NKR–Ig fusion protein (NKp46–Ig and NKG2D–Ig) binding to uninfected or ZIKV-infected JEG- 3 cells (right) (n = 3 samples). b,d–f, Specific killing assessed by 8 h 51Cr release assay using an E:T ratio of 10:1 unless otherwise indicated. Data are mean ± s.e.m. of at least three independent experiments or technical replicates. Statistics were performed using two-tailed, nonparametric, unpaired t-test (a,b), one-way analysis of variance (ANOVA) (c), two-way ANOVA (e–g) or area under the curve followed by one-way ANOVA (d). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. -CD56 is a single transmembrane glycoprotein also known as N-CAM (Neural Cell Adhesion Molecule), Leu-19, or NKH1. It is a member of the Ig superfamily. The 140 kD isoform is expressed on NK cells and NK-T cells. CD56 is also expressed in the brain (cerebellum and cortex) and at neuromuscular junctions. -lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1 or CD107a) has been described as a marker of CD8+ T-cell degranulation following stimulation. Flow cytometry For surface staining, cells were stained for 30 min on ice in the dark with LIVE/DEAD-Violet stain (1:1,000) and then with primary antibodies for 15–30 min in PBS and 2% FCS (followed by secondary antibodies, when applicable, for 20 min). For protein–Ig staining, cells were incubated with 50 µg ml–1 fusion protein for 1 h at 4 °C and then stained with fluorescent-anti-human IgG for 1 h. Cells were fixed in 1% paraformaldehyde (Affymetrix) for 10 min before flow cytometry. Flow cytometry was assessed on gated live cells (Supplementary Fig. 1). For intracellular staining, cells were fixed and permeabilized using the CytoFix/CytoPerm kit. One of the treated samples was used for isotype staining, and MFI of staining with the isotype control antibody was subtracted from MFI of the specific antibody. Analysis was performed on a FACSCanto II (BD). BD FACSDiva 8.0 (BD) software was used for data collection, with analysis performed using FlowJo v.10.4.2 (TreeStar). Reprodukovatelnost výsledků Circ Res. 2015 Jan 2;116(1):116-26. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.114.303819. Reproducibility in science: improving the standard for basic and preclinical research. Begley CG1, Ioannidis JP2. Nature. 2015 Feb 5;518(7537):27-9. doi: 10.1038/518027a. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Bradbury A1, Plückthun A2. Nature 533, 452–454 (26 May 2016) doi:10.1038/533452a “I don’t know any case yet of a retracted paper that used synthetic creation to illustrate the results in that paper,” says Rocha, who is working with the blog Retraction Watch on this issue. “But it’s just a matter of time, I guess.” CST Antibody Validation Principles https://www.cellsignal.at/about-us/cst- antibody-validation-principles Dostupná technologie https://www.bosterbio.com/protocol-and-troubleshooting/flow-cytometry-principle new automatic cell cloning assay (ACCA) for determination of clonogenic capacity of CSCs single cell/well up to 384 well plate re-culture after sorting (2D, 3D) analysis: CyQuant, ATP, xCelligence, microscopy Principy průtokové cytometrie a sortrování ◼ Světlo ◼ Fluorescence ◼ Zdroje excitace, optické systémy a způsoby detekce fluorescence ◼ Fluidní systémy K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Pojmy Fotometrie: ◼ Světlo – elektromagnetické záření viditelné lidským okem (400-750 nm, nejcitlivější ~ 550 nm). Při měření pod 400 nm (UV, IF) se jedná detekci záření (radiometrie). ◼ Energie záření se vyjadřuje v joulech ◼ Světelný tok (radiant flux) je udávána jako hodnota energie v čase ve wattech (1 watt= 1 joule/sekundu) ◼ foton – elementární částice. Popisuje je jejich vlnová délka, frekvence, energie a hybnost. Životnost fotonu je nekonečná (přesto vznikají a zanikají), existují pouze v pohybu. Má nulovou klidovou hmotnost, ale nenulovou energii, definovanou vztahem E = hν, kde h je Planckova konstanta a ν frekvence. Neboť má energii, působí na něj gravitace dle obecné teorie relativity a on sám gravitačně působí na okolí. (http://cs.wikipedia.org/wiki/Foton) ◼ Energie fotonu je vyjádřena jako E=hn a E=hc/l [n-frequency (Hz), c – rychlost světla (3x108 m/s), l-wavelength (nm), h-Planckova konstanta (6.63 x 10-34 J/s)] ◼ Energie je vyšší při kratších vlnových délkách a nižší při delších vlnových délkách. Elektromagnetické spektrum Rozptyl světla ◼ Hmota rozptyluje světlo vlnových délek které není schopna absorbovat ◼ Viditelné spektrum je 350-850 nm proto malé částice a molekuly (< 1/10 l) spíše viditelné světlo rozptylují ◼ Pro malé částice byl popsán tzv. Rayleightův rozptyl (scatter) jehož intenzita je ~ stejná všemi směry ◼ Rozptyl větších částic charakterizuje tzv. Mieův rozptyl. Jeho množství je větší ve směru v jakém dopadá světlo na ozářenou částici  na tomto principu je založeno měření velikosti částic pomocí průtokového cytometru Shapiro p.106http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/atmos/blusky.html Rayleightův a Mieův rozptyl ◼ Rayleightův rozptyl – molekuly a velmi malé částice neabsorbují, ale rozptylují světlo které má menší vlnovou délku než je jejich velikost (modré nebe vzduch rozptyluje lépe kratší vlnové délky) ◼ Mieův rozptyl je charakteristický pro částice větší než je vlnová délka světla (bílá záře kolem slunečního kotouče, mlžné světlo) kj kj http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/atmos/blusky.html K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Ohyb a rozklad světla Krátké vlnové délky jsou “ohnuty” více než dlouhé kj original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy © Microsoft Corp, 1995 Elektromagnetiké spektrum Pouze malá oblast spektra je používána pro cytometrické aplikace © J. P. Robinson, Purdue University Fluorescence George Gabriel Stokes (1819 – 1903) Anglický fyzik a matematik působící na univerzitě v Cambridge http://www.nndb.com/people/131/000097837/ 1852 – popsal fluorescenci Název vznikl z anglického slova fluospar (fluorit, kazivec = nerost CaF2) - ke svému pozorování použil roztok chininu, jako zdroj světla sluneční paprsky, jako excitační filtr sloužilo tmavě modré okenní sklo a jako emisní filtr byla použita sklenice bílého vína G. C. Stokes „On the Change of Refrangibility of Light“ Philosophical Transactions of the Royal Society of London, 1852, vol. 142, p. 463.) K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Princip fluorescence Fluorescence (patří mezi fotoluminiscenční záření, které je vyvoláno buď účinkem jiného dopadajícího záření, nebo účinkem dopadajících částic) je výsledek tří fázového u jevu některých chemickýc látek - fluorochromů, fluorescenčních barev. Fáze 1: Excitace - Záření z externího zdroje (např. laser) excituje fluorofor. - Tím vzniká excitovaný stav (S1'). Fáze 2: Životnost excitovaného stavu - Excitovaný stav trvá krátkou dobu (1–10^-9 sekundy). - Fluorofor může procházet změnami a interakcemi. - Ztrácí část energie, vzniká uvolněný excitovaný stav (S1). - Některé molekuly nevrací energii formou fluorescenčního záření. - To ovlivňuje fluorescenční kvantový výtěžek. Fáze 3: Fluorescenční záření - Fluorofor emituje foton a vrátí se do základního stavu (S0). - Energie emitovaného fotonu (hvEM) je nižší a má delší vlnovou délku než excitační foton (hvEX). - Rozdíl se nazývá Stokesův posun a je klíčový pro citlivost fluorescenčních technik. Jablonski diagram K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Charakteristiky fluorescence • intenzita – počet fotonů procházejících v daném směru jednotkovou plochou za jednotku času • spektrální složení – spektrální hustota fotonového toku na jednotkový interval vlnových délek nebo frekvencí • polarizace – směr kmitání elektrického vektoru elektromagnetické vlny • doba dohasínání – je dána vnitřní dobou života excitovaného stavu, z něhož dochází k emisi; úzce souvisí s pochody vedoucími k nezářivé deaktivaci tohoto stavu • koherenční vlastnosti – vztahy mezi fázemi světelných vln Fluorescenční spektra Fluorescenční proces je cyklický. Kromě fluorochromu nevratně zničeného (photobleaching - „vysvícení“) může být opakovaně excitován. Excitation of a fluorophore at three different wavelengths (EX 1, EX 2, EX 3) does not change the emission profile but does produce variations in fluorescenceemission intensity (EM 1, EM 2, EM 3) that correspond to the amplitude of the excitation spectrum. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescenční barviva • Fluorescenční barviva (fluorofory, fluorochromy) jsou chemické sloučeniny, které obsahují ve své molekule reaktivní skupinu, která je schopna reagovat s nukleofilními skupinami (NH₂, OH, SH). • Obecně se fluorofory dělí na vnitřní (vlastní, intrinsic) a vnější (nevlastní, extrinsic). Vnitřní fluorescence • Vnitřní fluorescence buněk je dána přítomností vnitřních fluoroforů, mezi které patří proteiny, redukované formy NADH a NADPH, vitamin A, cytochromy, peroxidáza, hemoglobin, myoglobin či chlorofyl. • Proteiny vyzařují fluorescenční záření v UV oblasti spektra. Hlavními fluorofory v proteinech jsou aromatické aminokyseliny (fenylalanin, tryptofan, tyrosin), jejichž absorpční i emisní pás leží mezí 240 a 300nm. • Ostatní uvedené látky vyzařují ve viditelné oblasti spektra (modrá, žlutá či červená). Vnější fluorescence • Vnější fluorofory jsou používány mnohem častěji než vnitřní. • Jsou přidávány ke studovanému vzorku a podle typu vazby jsou děleny na fluorescenční značky a fluorescenční sondy. Fluorescenční značky • Nejčastěji se používají k fluorescenčnímu značení proteinů, ke kterým se vážou kovalentní vazbou. • Nejznámějšími fluorescenčními značkami jsou FITC (fluorescein-5-isothiokyanát) a TRITC (tetramethylrhodamin-5isothiokyanát, tetramethylrhodamin-5-isothiokyanát). Fluorescenční sondy • vnější fluorofory, které se váží ke struktuře nekovalentní vazbou a často při tom mění své fluorescenční vlastnosti. Tyto fluorofory jsou používány ke studiu změn konformace bílkovin, tloušťky membrán, membránového potenciálu apod. • K identifikaci a vizualizaci nukleových kyselin se používá řada fluorescenčních sond (např: akridinová oranž, ethidium bromid, DAPI a další). • Nejznámější a také nejpoužívanější fluorescenční sondou pro vizualizaci veškeré jaderné DNA je DAPI. Chemicky se jedná o 4',6-Diamidino-2-fenylindol. Jeho absorpční maximum je při 345 nm, maximální fluorescence je při 455 nm (modrý fluorofor • Dalším často používaným fluoroforem je akridinová oranž. Jedná se o fluorescenční sondu, jejíž absorpční a emisní pásma se liší podle substrátu, ke kterému je vázána DNA/RNA. Obě jmenované jsou většinou dodávány v podobě chloridových solí. Detekce fluorescence Vybavení pro fluorescenci (1) zdroj excitace (2) fluorochrom (3) vlnové filtry pro izolaci emitovaných fotonů od excitovaných (4) detektory pro registraci emitovaných fotonů Fluorescenční přístroje - spektrofluorometer měří průměrné vlastnosti objemu vzorku v kyvetě. - fluorescenční mikroskop popisuje fluorescenci jako jev v prostorovém systému souřadnic - flow cytometer měří fluorescenci v proudícím toku, umožňuje detekovat a kvantivikovat subpopulace uvnitř velkého vzorku Fluorescenční signál - spektrofluorometer je flexibilní, umožňuje měřit v kontinuálním spektru excitačních a emisních vlnových délek - flow cytometr potřebuje fluorescenční značky excitovatelné určitou vlnovou délkou. Fluorescence pozadí - endogení složky - autofluorescence - nenávazané nebo nespecificky vázané značky = reagenční pozadí Vícebarevné značení - dvě a více značek, zároveň monitoruje různé funkce - nutné: vhodně zvolit značky zdroj excitace a separační filtry K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescence Output of Fluorophores Comparing Different Dyes F-actin ~ BODIPY FL phallacidin anti-ß tubulin ~ Texas Red goat anti–mouse IgG DNA ~ DAPI Mouse 3T3 l Hind III propidium iodide K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Procesy interferující a detekcí fluorescence ◼ Quenching - „zhášení“ fluorescence pomocí polárních rozpouštědel, těžkých iontů. ◼ Bleaching – změna struktury fluorescenční molekuly vedoucí ke ztrátě fluorescence (působením světla a nebo chemickou interakcí. ◼ Photon saturation – stav kdy množství molekul v excitovaném stavu odpovídá množství molekul v bazální hladině K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Photobleaching - irreversible destruction or photobleaching of the excited fluorophore Oregon Green 514 goat anti–mouse IgG fluorescein goat anti–mouse IgG anti–human cytochrome oxidase subunit I K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Základ průtokové cytometrie Buňky v suspenzi protékají jednotlivě napříč osvětlenou částí kde rozptylují světlo a emitují fluorescenci, která je detekována, filtrována a převedena na digitální hodnoty uložené do počítače Fluidics Optics Electronics original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - zdroj světla • nutnost zaostřit zdroj světla na stejné místo, kde je zaostřen průtok buněk • Lasery • produkují jednotlivou vlnovou délku světla (325, 488, ~630nm) • poskytují mW - W světla • poskytují koherentní světelný proud • Obloukové lampy (Arc-lamps), s oučasných systémech je již nenajdeme • produkují směs vlnových délek, které musí být filtrovány • poskytují mW světla • levné - air-cooled • nekoherentní světelný proud - optické kanály • cesta světla z místa ozáření buněk k detektoru • optické části separují určité vlnové délky original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy LASER(y) - koherentní (souvislý světelný tok) - monochromatický - soustředěný http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/hframe.html http://www.ilt.fraunhofer.de/eng/100053.html http://en.wikipedia.org/wiki/Helium-neon_laser K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie LASER vs. Arc lamp http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Helium_neon_laser_spectrum.png H.M. Shapiro, Practical Flow Cytometry, 4th ed. http://en.wikipedia.org/wiki/Helium-neon_laser http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/sources.html K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Optika - „Forward Scatter“ kanál • část světla rozptýlená ve stejné ose jako je směr světelného paprsku • intenzita „forward scatteru“ odpovídá velikosti, tvaru a optické homogenitě buněk original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Forward Angle Light Scatter FALS Sensor Laser original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - „Side Scatter“ kanál • část světla rozptýlená kolmo do strany od osy směru světelného paprsku side (90o) scatter channel • intenzita „side scatteru“ odpovídá velikosti, tvaru a optické homogenitě buněk original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy 90 Degree Light Scatter FALS Sensor 90LS Sensor Laser original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - Light Scatter • „Forward scatter“ zachycuje povrchové vlastnosti a velikost částic • může být použit k rozlišení živých a mrtvých buněk • „Side scatter“ odpovídá inkluzím uvnitř buněk • možno odlišit granulární a negranulární populaci original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - fluorescenční kanály • fluorescence emitovaná z každého fluorochromu je detekována pomocí specifického fluorescenčního kanálu • specifita detekce je kontrolována vlnovou selektivitou filtru a zrcadel original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Laser Fluorescence Detectors Freq Fluorescence FALS Sensor Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.) original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - vlastnosti filtrů • jsou konstruovány z materiálů absorbujících určitou vlnovou délku (a propouštějí jinou) • přechod mezi absorbancí a transmisí není přesný; nutné specifikovat lom světla při konstrukci filtru original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optics - vlastnosti filtrů • „Long pass“ filtr propouští vlnovou délku nad „řezanou“ délkou • „Short pass“ filtr propouští vlnovou délku pod „řezanou“ délkou • „Band pass“ filtr propouští vlnovou délku v úzkém rozmezí okolo specifické vlnové délky original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Standard Long Pass Filters Transmitted LightLight Source 520 nm Long Pass Filter >520 nm Light Transmitted LightLight Source 575 nm Short Pass Filter <575 nm Light Standard Short Pass Filters original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Standard Band Pass Filters Transmitted LightWhite Light Source 630 nm BandPass Filter 620 -640 nm Light original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - vlastnosti filtrů • pokud je filtr umístěn v 45o úhlu ke zdroji světla, světlo, které má projít tak projde, ale blokované světlo je odraženo v 90o úhlu • dichroické filtry, dichroická zrcadla original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Dichroic Filter/Mirror Filter placed at 45o Reflected light Transmitted LightLight Source original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - uspořádání filtrů • k společnému měření více než jednoho „scatteru“ nebo fluorescence , používáme mnohonásobné kanály (a detektory) • multikanálové uspořádání musí splňovat • spektrální vlastnosti použitého fluorochromu • správný řád uspořádání filtrů a zrcadel original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - detektory • dva obecné typy detektorů • fotodioda •v minulosti zejména pro silný signál (forward scatter detector) •současnost – vysoce citlivé AVALANCHE“ fotodiody (APD) • fotonásobič (photomultiplier tube - PMT) •citlivější než běžná fotodioda, muže být poškozen přesvícením original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Photomultiplier tubes (photomultipliers, PMTs) http://en.wikipedia.org/wiki/Photomultiplier http://hamamatsu.magnet.fsu.edu/articles/photomultipliers.html Základní charakteristika: -vysoce citlivé detektory (jeden foton) -velké zesílení signálu/nízký šum -velká plocha detekce -rychlá frekvence odpovědi -velké pracovní napětí (1000 – 2000 V) K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie “bežná“ fotodioda Porovnání s PMT Výhody: 1. excelentní linearita signálu 2. rozsah spektrální detekce 190 nm to 1100 nm (silicon) 3. nízký šum 4. Odolnost vůči mechanickým vlivům 5. nízká cena 6. malá velikost a hmotnost 7. dlouhá životnost 8. Vysoká kvantová účinnost (~80%) 9. Nepotřebuje vysoká napětí Nevýhody 1. Malá plocha 2. Nemožnost integrálního zesílení 3. Mnohem nižní citlivost 4. Počítání fotonů pouze u speciálních produktů 5. Kratší čas odpovědi http://en.wikipedia.org/wiki/Photodiode K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie https://en.wikipedia.org/wiki/Avalanche_photodiode Současnost: „AVALANCHE“ fotodiody (APD) - Vysoce citlivé polovodiče - srovnatelné s PMT PMT PMT PMT PMT Dichroic Filters Bandpass Filters Example Channel Layout for Laserbased Flow Cytometry Laser 1 2 3 4 Flow cell original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy BD FACSCalibur system http://www.bdbiosciences.com/immunocytometry_systems/ K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie BD LSR II system http://jcsmr.anu.edu.au/facslab/facs/LSR2.html BD FACSVerse system http://www.bdbiosciences.com/instruments/facsverse/features/index.jsp Aria II SP6800 spectral analyzer Image Stream & Flowsight Amnis – kombinace průtokové cytometrie a analýzy obrazu Amnis - aplikace CellStream, Luminex ThermoFisherScientific: Attune CytPix Flow Cytometer BD FACSDiscover S8 SCIENCE 20 Jan 2022 Vol 375, Issue 6578 pp. 315-320 DOI: 10.1126/science.abj3013 Ethidium PE cis-Parinaric acid Texas Red PE-TR Conj. PI FITC 600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm 457350 514 610 632488Common Laser Lines Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Octagon Detection System SSC PE PE-Cy7 FITC PerCP-Cy5.5 PE-TxRed “kostka” pro konvenční fluorescenční mikroskop Acousto Optical Beam Splitter AOBS® Acousto Optical Beam Splitter AOBS® http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/filters/aotf/index.html http://simple.wikipedia.org/wiki/Tellurium Supercontinuum Generation -a nonlinear process for strong spectral broadening of light The benefits of AOBS® •Adaptable to any new dye •8 lines simultaneously •Reflected light imaging •High transmission •Truly confocal – real optical sectioning •Fast switching •Freely tunable •Fluorescence correlation spectroscopy with multi-line lasers https://www.bdbiosciences.com/en-eu/resources/bd- spectrum-viewer Fluorescence Spectrum Viewers K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life- science/cell-analysis/labeling- chemistry/fluorescence-spectraviewer.html http://www.biolegend.com/panelselector http://www.biolegend.com/spectraanalyzer http://www.biolegend.com/webtoolstab https://fluorofinder.com https://www.bosterbio.com/protocol-and-troubleshooting/flow-cytometry-principle