Aplikace průtokové cytometrie v klinické
imunologii a hematologii
Lukáš Kubala
Imunologie - Stanovení stavu imunitního systému
• Vrozené nebo získané imunodeficience
- monitorování HIV positivních pacientů a stanovení efektivity
terapie
- monitorování efektivity imunosupresivní terapie u
transplantovaných pacientů
• Monitorování autoimunitních onemocnění a efektivity terapie
Hematologie
• Diagnóza maligních onemocnění
• Stanovení funkčních vlastností trombocytů
Metodologické přístupy
• Imunofenotypizace
Stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací leukocytů (obecně
krevních elementů v krvi, kostní dřeni nebo mozkomíšním moku)
• Funkční testy
- Aktivace lymfocytů
Změna exprese vybraných povrchových markrů (většinou receptory
nezbytné pro funkci daného lymfocytu)
Indukce proliferace (stanovení buněčného cyklu)
Produkce cytokinů
Stanovení cytotoxicity NK buněk a cytotoxických lymfocytů
- Aktivace fagocytů (mikrobicidní aktivita)
Změna exprese vybraných povrchových markrů
Produkce volných radikálů fagocyty
Fagocytární aktivita
- Stanovení funkčních vlastností trombocytů
Imunofenotypizace
• Na základě rozptylu světla jsou leukocytární populace rozděleny
podle velikosti a granularity
• Specifické monoklonální protilátky označené různými
fluorochromy proti vybraným CD antigenům umožňující rozdělení
buněk do populací
Stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací buněk (primárně
leukocytů) na základě exprese vybraných povrchových antigenů
případně v kombinaci s intracelulární produkcí cytokinů a expresí
intracelulárních antigenů
Konjugovaný fluorochrom
Protilátka
CD antigen (epitop)
Buňka
CD Antigeny
• Systém označení povrchových molekul leukocytů (buněk) mající stejný
epitop, identifikovatelný stejnou protilátkou umožňující rozpoznávání
buněčných populací při imunofenotypizaci
• Většina má alternativní názvy vztahující se k jejich funkci nebo
struktuře buňky
CD Antigeny
• Dodnes definovány CD1 přes CD300
• Některá CD jsou skupinami příbuzných molekul, a jednotlivé molekuly
se označují písmeny (např. CD62L, CD62P, CD62E)
• Zdroj informací o CD nomeklatuře – učebnice imunologie, www např.
PROW www.Ncbi.nlm.nih.gov/prow/
Vývojové
stádium
Exprese vybraných
povrchových znaků
Kmenová buňka CD34
Časný pro-B lymf.
CD34; CD45R; IL-7R;
CD10; CD19; CD38
Pozdní pro-B
lymf.
CD45R; IL-7R;
CD10; CD19; CD38;
CD20; CD40
Velký pre-B lymf.
CD45R; IL-7R;
CD19; CD38; CD20; CD25
(rec. IL-2); CD40
Malý pre-B lymf.
CD45R; CD19; CD38;
CD20; CD40
Exprese vybraných povrchových znaků
během vývoje B lymfocytů
Vývojové
stádium
Exprese vybraných
povrchových znaků
Nezralý
B lymf.
CD45R; CD19; CD20;
CD40
Zralý naivní
B lymf.
CD45R; CD19; CD20;
CD21; CD40
Lymfoblast
CD45R; CD19; CD20;
CD21; CD40
Paměťová
buňka
CD45R; CD19; CD20;
CD21; CD40
Plasmatická
buňka
CD135;
CD38
Nezralé CD3-(jen v cytoplasmě)4-8dvakrát-negativní
tymocyty
pTα:β+ CD3+ 4+ 8+
velké dvakrát-pozitivní tymocyty
γ:δ+ CD3+ 4- 8α:β+
CD3+ 4+ 8+
malé klidové dvakrátpozitivní
tymocyty
α:β+CD3+4+8- α:β+CD3+4-8+
malé jedenkrát-pozitivní tymocyty
Export do periferie
Vývoj T-lymfocytů
Vybrané povrchové molekuly charakteristické pro různé
typy leukocytů (“markery” jednotlivých typů)
Buněčný typ Charakteristické povrchové molekuly
Leukocyty (všechny) CD53, CD45, CD43
Hematopoetické prekurz. CD34, CD117, CD137
T lymfocyty CD2, CD3, CD5, CD6, CD7, CD27, CD28, CD96, TCR
T pomocné l. (Th) CD4
T cytotoxické l. (Tc) CD8
B lymfocyty CD19, CD20, CD22, CD37, CD39, CD40, CD79, BCR
Pre-B lymfocyty CD9, CD10, CD138
Plasmatické buňky CD28, CD138
NK lymfocyty CD2, CD11b, CD16b, CD56, CD57, Cd94, CD158
Neutrofilní granulocyty CD11b, CD15, CD87
Monocyty CD14, CD33, CD64, CD87, CD89
Dendritické buňky CD83, Cd86, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209
Příklad panelů pro měření imunitních buňek
Praktické provedení
imunofenotypizace
Zkumavka s 100 mikrolitry nesrážlivé krve
Přidání protilátek kombinace protilátek
Inkubace, fixace, lyze eytrocytů.
Forward Scatter (linear)
SideScatter(linear)
Neutrofily
Monocyty
Lymfocyty
SideScatter
Forward Light Scatter
0 200 400 600 800 1000
02004006008001000
Klíčová informaci poskytuje SS a FS leukocytů
získaných z plné krve po lyzaci erytrocytů
Tří barevná imunofenotypizace pro
stanovení CD4 a CD8 lymfocytů
Kombinace tří protilátek anti-CD3, anti-CD4, antiCD8
označených třemi různými fluorochromy např. FITC, PE, Per CP
10 1 10 2 10 3 10 4
CD8 TC -->
101102103104
Anti-TCR-gamma-delta-1PE-->
CD8
CD4
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Side Scatter -->
101102103104
Anti-TCR-alpha-beta-1FITC-->
CD3
SIDE SCATTER
CD3
10 1 10 2 10 3 10 4
CD3 -->
101102103104
CD8-->
CD8
CD3-CD4- CD3-CD4+
CD3-CD8+ CD3+CD4+ Th lymf
CD3+CD8+ Tc lymf CD3+CD4-
10 1 10 2 10 3 10 4
CD3 -->
101102103104
CD4-->
CD3
CD4
10 1 10 2 10 3 10 4
CD8 -->
101102103104
CD4-->
CD8
CD4
Kombinace grafů - tří barevná
imunofenotypizace CD3, CD4, CD8
Čtyř barevná imunofenotypizace
CD3, CD4, CD8, CD56 v jedné zkumavce
Čtyřbarevná imunofenotypizace v klinice
(př. BD kity a HW/SW)
1. Zkumavka CD3 - FITC, CD45 - PerCP, CD4 - APC, CD8 - PE
2. Zkumavka CD3 - FITC, CD45 - PerCP, CD19 - APC, CD16 a CD 56 - PE
Čtyřbarevná imunofenotypizace v klinice (př. BD kit a HW/SW)
1. Zkumavka CD3FITC, CD45PerCP, CD4APC, CD8PE
2. Zkumavka CD3FITC, CD45PerCP, CD19APC, CD16+56PE
Výsledný report
Výsledný
report
Diferenciace pomocních T-lymfocytů
(CD4+ T-lymfocyty; Th lymfocyty)
Detekce intracelulární
produkce cytokinů
Tyto cytokiny jsou zodpovědné za funkci buněk
→ Imunofenotypizace - charakterizace různých subpopulací
leukocytů, které lze rozlišit na základě rozdílné produkce
cytokinů
→ Charakterizace funkčních vlastností buněk - odpověď na
vybraný stimul
1. Stimulate whole
blood or PBMC
+ Brefeldin A
(inhibitor of protein transport
from cell)
2. Lyse/Fix
Wash
3. Permeabilize
Wash
4. Stain
Wash
5. Flow
cytometry
CD69PE
anti-IFNγ FITC
BD FastImmune
TM
Cytokine Flow Cytometry Protocol
1.0%
6 h
Pokročilé imunofenotypizace T lymfocytů z lidské krve
Stanovení různých druhů paměťových buněk, vrozených lymfoidních buněk, odlišení různých
typů NK buněk, ..
Příklad různých 35-barevné imunofenotypizace
Dott T, Culina S, Chemali R, Mansour CA, Dubois F, Jagla B, et al. Standardized high-dimensional spectral cytometry protocol and panels for whole
blood immune phenotyping in clinical and translational studies. Cytometry. 2023. https://doi.org/10.1002/cyto.a.24801
Technické proměnné v imunofenotypizaci a přístupy k jejich minimalizaci
Technické proměnné Přístupy k minimalizaci negativních dopadů
Reagencie Definice standardních panelů protilátek pro imunofenotypizaci
Použití předem nakonfigurovaných lyofilizovaných protilátek
Manipulace se vzorky Automatizace zpracování vzorků v místě odběru
Jasně definovaný protokol pro kryoprezervaci PBMC a/nebo
pro barvení na místě
Nastavení přístroje Použití softwaru pro automatické nastavení kanálů
Nastavení amplifikace detektorů pomocí standardních částic na
pro reprodukovatelné nastavení přístroje v čase a mezi více
přístroji
Analýza dat Centrální analýza jedním nebo několika koordinovanými
odborníky
Použití automatických algoritmů stanovení populací
• Pomáhají k určení intenzity autofluorescence vzorku a prěsvěcování
dalších použitých protilátek do daného detektoru
• Izotypová kontrola slouží ke stanovení nespecifická vazba protilátek
a podobně jako FMO také k určení intenzity autofluorescence vzorku
a prěsvěcování dalších použitých protilátek do daného detektoru
Nezbytné pro správný „gating“ (ohraničení) populací
Izotypová a FMO (fluorescence minus one) kontrola
FMO (fluorescence minus one) kontrola
Izotypová kontrola
• Protilátka, která se používá jako negativní kontrola k detekci nespecifické vazby
• Je vytvořená proti antigenu, který není přítomen na analyzovaném buněčném typu byla
speciálně vyvinuta pro stanovení úrovně povrchového barvení pozadí
• Izotypové kontroly musí odpovídat hostitelskému druhu, podtřídě protilátky a
konjugaci primární protilátky
Avšak
• Nejsou vhodné pro intracelulární barvení
• Použití izotypových kontrol v průtokové cytometrii je kontroverzní
• Jsou pouze jednou z řady vhodných kontrol, které zlepší data průtokové cytometrie.
Kryoprezervace a fixace
Někdy je potřeba zejména při převozu pacientských vzorků stabilizace
vzorků pomocí fixace nebo kryoprezervace
– Fixace – formaldehyd, etanol, Transfix
– Zamražování živých buněk – Cellcover, Cytodelics
Negativní efekty kryoprezervace
Červené označení u jednotlivých protilátek značí nekompatibilitu s daným způsobem prezervace
Co všechno jde imunofenotypizovat?
• Buňky (povrchové epitopy, fosforylované epitopy,
intracelulární markry jako cytokíny a transkripční faktory)
• Tkáně (biopsie…)
• Synoviální tekutina
• Pro tkáňově-residentní buňky se často využívá místo
průtokové cytometrie imunofluorescence/imunohistochemie
Analýza glykanů
• Glykosylace proteinů – důležitá pro migraci, diferenciaci a maturaci
imunitních buněk
• Lektíny (proteíny, které vážů glykany) – důležité pro aktivaci a funkci
buněk
• Mnoho CD markrů nebo PAMPs tvoří lektíny a glykany
• Důležité hlavně při interakci imunitních a rakovinových buněk
Glykany a imunitní systém
• Glykany zahrnuté ve vývoji, proliferaci a diferenciaci lymfocytů
• Poruchy glykosylací spojené s:
– Autoimunitní onecmocnění – např. IBD (hyperreaktívní CD4+ T lymfocyty mající
snížený počet větvených glykanů na svém povrchu)
– Rakovina – nádorové buňky se maskují před imunitním systémem pomocí
povrchové glykosylace
– Glykany jako možné biomarkry
CAR T cell terapie
• T buňky pro CAR terapii se pomocí průtokové cytometrie vysortují z
krve pacienta
• Průtoková cytometrie i na ověření CAR-T buněčného specifického
usmrcení nádorových buněk
Hematologie
Použití imunofenoptypizace pro detekci
hematologických onemocnění
• Stanovení zastoupení jednotlivých buněčných
linií
• Stanovení stupně diferenciace
• Stanovení monoklonální populace (B-lymfocyty)
Granulocytes
granulocytes
Haematopoéza
CD34+
CD13-
(CD36+)
CD34+
CD13+
CD115+
CD34+
CD13+
CD115-
CD34+
CD13-
CD36-
CD115
FSC
erythroid
monoblasts
myeloblasts
26.6
39.6
Příklad identifikace buněk myeloidních linií
CD45 Human Leukocytes
CD3 Pan T Lymphocytes
CD5 Pan T Lymphocytes
CD7 Pan T Lymphocytes
CD4 T-helper Lymphocytes
CD8 T-suppressor/cytotoxic Lymphocytes
CD10 B-cells
CD19 Pan B-cells
CD20 Mature B-cells
FMC7 Activated B-cells
CD23 Activated B-cells
CD38 Plasma cells, activated T-cells
CD103 T and B Lymphocytes
CD11c T and B cells, NK cells, monocytes
CD25 Activated B-cells
CD22 B-cells
Kappa Light chains
Lambda Light chains
Příklad panelu CD
antigenů
stanovovaných při
detekci lymfomů
CD45 Human Leukocytes
CD5 Pan T Lymphocytes
CD10 B Lymphocytes
CD19 Pan B Lymphocytes
CD20 Mature B Lymphocytes
HLA-DR (I3) Activated T and B Lymphocytes
CD34 Progenitor Cell
CD117 Progenitor Cell
CD15 Monocytes/Granulocytes
CD33 Myelocyte/Monocyte
CD56 Natural Killer Cells
CD14 Monocyte
CD13 Myelocyte/Monocyte
CD64 Monocytes
cMPO Myeloperoxidase
c79a B Cells
C3 Cytoplasmic CD3 T Cells
cTDT Immature Lymphocytes/thymocytes
Příklad panelu
CD antigenů
stanovovaných
při detekci
leukemií
Funkční testy
Změna exprese vybraných povrchových markrů (většinou receptory
nezbytné pro funkci daného lymfocytu)
Produkce volných radikálů fagocyty
Detekce oxidu dusnatého
Fagocytární aktivita
Stanovení funkčních vlastností trombocytů
Pokračování druhé části přednášky Příklady aplikace
průtokové cytometrie v klinické imunologii a
hematologii