Seminář 4 Monoklonální původ nádorů Bi9915 Speciální seminář z biologie nádorů Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Mgr. Lucia Knopfová, PhD Ústav experimentální biologie PřF MU Brno Jsou nádory monoklonální nebo polyklonální? Weinberg R.A. The Biology of Cancer, GS Garland Science, 2007 Jsou nádory monoklonální nebo polyklonální? •  Klonalitu lze studovat na základě sledování nějakého unikátního genetického/epigenetického markeru (např. Barrovo tělísko) ⇒ tak lze prokázat, že buněčná populace v nádoru je monoklonální •  obecný konsensus říká, že nádory jsou většinou monoklonální a jejich vývoj začíná jedinou odrodilou buňkou. Z Úvodní přednášky kurzu Molekulární biologie nádoru Jak studovat monoklonalitu/ polyklonalitu nádorů? •  Na základě sledování nějakého unikátního genetického/ epigenetického/biochemického markeru. •  například Barrovo tělísko •  V somatických buňkách samičího embrya dochází k nahodilé inaktivaci chromozomu X. Karyotypicky se projeví umlčený kondenzovaný chromozom jako malé, tzv. Barrovo tělísko. Inaktivace chromozomu X Průběh inaktivace chromozomu X: 1. upregulace xist a následný Xist RNA coating - netranslatovaná RNA pokryje povrch inaktivovaného chromozomu X 2. metylace H3K9 + hypoacetylace H3K9 + hypometylace H3K4 3. metylace ostrůvků CpG; H4 hypoacetylace; zvýšení obsahu histonu macroH2A Inaktivace chromozomu X •  Na počátku vývoje samičího embrya jsou oba chromozomy X (mateřský i otcovský) stejně aktivní. •  Brzy během vývoje dochází k nahodilé inaktivaci jednoho z nich, což způsobí umlčení téměř všech jeho genů. Všichni „potomci“ (celá následná linie) těchto buněk dědí tento znak. •  Dospělé samičí tělo je tvořeno klony buněk, které jsou buď Mp (inaktivace paternálního X) nebo mP (inaktivace maternálního X). Studium klonality nádorů pomocí Barrova tělíska •  Téměř všechny geny na inaktivovaném chromozomu jsou transkripčně reprimované. •  Na chromozomu X je lokalizován gen pro glukoso-6-fosfát dehydrogenázu (G6PD). Více než 30% afro-amerických žen je v tomto lokusu heterozygotních – mají dvě různé alely tohoto genu. Dvě formy enzymu jsou rozlišitelné buď pomocí škrobové gelové elektroforézy nebo díky tomu, že jedna forma je odolnější vůči teplotní inaktivaci. •  Díky inaktivaci X exprimuje každá buňka žen – heterozygotek jen jednu alelu genu G6PD. Rozlišení dvou variant glukoso-6-fosfát dehydrogenázy •  Opatrné zahřátí tkáně odliší oblasti (klony) buněk, které exprimují teplotně rezistentní, stále aktivní formu enzymu G6PD (tmavě modré tečky), od oblastí buněk exprimujících teplem inaktivovaný enzym. •  Buňky jednotlivých oblastí jsou potomstvem embryonální buňky, ve které došlo k inaktivaci jednoho chromozomu X. Weinberg R.A. The Biology of Cancer, GS Garland Science, 2007 •  Varianty G6PD mají různou elektroforetickou pohyblivost ve škrobovém gelu. •  1965 - analýza leiomyomů (benigní nádory děložní stěny) afro-amerických žen/ heterozygotek: každý nádor nesl buď jednu nebo druhou variantu G6PD. ⇒ Každý nádor je velmi pravděpodobně klonem buněk pocházejících z jediné („odrodilé“) buňky! Rozlišení dvou variant glukoso-6-fosfát dehydrogenázy Bup-Jong Kum J. et al., Am.J.Surg.Pathol. 2011 Jak studovat monoklonalitu/ polyklonalitu nádorů? Smíšený epiteliální a stromální nádor ledvin (MEST) •  vzácný nádor ledvin, s výraznou převahou výskytu u žen (pravděpodobně souvislost s hladinou hormonů) •  nádory převážně benigní, jen vzácně maligní •  Nádor tvořen jak epiteliálními tak mesenchymálními buňkami. Obecně je přijímáno, že stromální buňky v MEST jsou neoplastické, ale není jednoznačné, zda (1) epiteliální buňky jsou také neoplastické nebo (2) nejsou a jsou ovlivněny stromálními buňkami a hormony. •  Pokud by byly skutečně neoplastické jak stromální tak epiteliální buňky, předpokládalo by to existenci (jediné „odrodilé“) progenitorové buňky s kapacitou duální (mesenchymální a epiteliální) diferenciace. ⇒ analýza monoklonality původu Ø  21 žen s MEST, které prodělaly částečnou nebo radikální nefrektomii Ø  tkáňové řezy připravené s formol-parafinových bloků Ø  vyšetření inaktivace chromozomu X a genu HUMARA pro lidský androgenní receptor (human androgen receptor) v lokusu Xq11-12 Bup-Jong Kum J. et al., Am.J.Surg.Pathol. 2011 Příprava vyšetřovaného materiálu 1. Laserová mikrodisekce epiteliální (E) a stromální (S) komponenty MEST a normální (N) tkáně z tkáňových řezů připravených z formolparafinových bloků a obarvených hematoxylinem a eosinem. Bup-Jong Kum J. et al., Am.J.Surg.Pathol. 2011 1.  Mikrodisekce E, S a N tkání 2.  Izolace DNA 3.  Štěpení restrikční endonukleázou HhaI, citlivou na metylaci DNA 4.  Amplifikace úseku DNA (STR) 5.  Elektroforéza DNA Interpretace výsledků 1.  Informativní byly vzorky, u kterých v neštěpené kontrole byly dva bandy pro dvě alely genu HUMARA 2.  V nádorové tkáni byla nenahodilá (tedy klonální) inaktivace chromozomu X prokázána vymizením jednoho bandu ve vzorku štěpeném HhaI) 3.  Společný progenitor E a S komponenty byl předpokládán tam, kde u E i S komponenty chyběla stejná alela HUMARA Příprava vyšetřovaného materiálu Interpretace výsledků ← neinformativní vzorek, pouze 1 alela genu HUMARA v normální tkáni ← informativní vzorek, neklonální, dvě alely genu HUMARA ve všech typech tkáně - heterotyp Bup-Jong Kum J. et al., Am.J.Surg.Pathol. 2011 Interpretace výsledků ← převaha „vrchní“ alely genu HUMARA v epiteliální i stromální složce nádoru – monotyp, klonální změna, společný progenitor ← převaha „spodní“ alely genu HUMARA v epiteliální i stromální složce nádoru – monotyp, klonální změna, společný progenitor Bup-Jong Kum J. et al., Am.J.Surg.Pathol. 2011 Výsledky •  z 21 případů, 19 bylo informativních •  v 7 případech byla neklonální inaktivace chromozomu X (nekompletní štěpení Hha1? kontaminace nenádorovou tkání? Nestabilní/variabilní inaktivace X) •  ve 12 případech byla detekována klonální inaktivace chromozomu X (tj. přítomnost jen jednoho alelického bandu genu FUMARA) •  ve všech 12 případech byla shodná inaktivace chromozomu X v epiteliální a stromální složce MEST Bup-Jong Kum J. et al., Am.J.Surg.Pathol. 2011 Závěry 1.  Silná podpora toho, že neoplastické jsou jak buňky mesenchymální složky, tak buňky epiteliální složky MEST. 2.  Silná podpora teorie, že obě složky nádoru – epiteliální i stromální – se vyvinuly ze společné progenitorové („jediné odrodilé“) buňky, která měla kapacitu k duální diferenciaci. Bup-Jong Kum J. et al., Am.J.Surg.Pathol. 2011 Ale! Parsons B, Multiclonal tumor origin: Evidence and implication Mutat Res Rev Mutat Res 2018;777:1-18. Velikost “skvrn” – čím větší, tím spíše uvidíme monoklonalitu Dominantní klon během progrese nádoru (pseudomonoklonalita) Senzitivita testu (nenádorové buňky)– korekce proti heterotypům – pokud poměr alel 4:1 a více – monotyp monotyp není důkaz monoklonálního původu nádoru, Ale heterotyp (pokud vyloučíme technické problémy) prokazuje multiklonalitu Metastázy - nezávislé klony? • Katona TM et al. Am J Surg Pathol. 2007 Jul;31(7):1029-37. Metastázy a primární nádory byly ve většině případů klonální (se stejnou inaktivací X chr) Ale v některých případech se u pacienta objevila nezavislá metastatická ložiska s inaktivací druhé alely (jiné než u primárního melanomu) – přítomnost více nezávislých klonů transformovaných melanocytů Inaktivace X chromozomu (HhaItreated AR alely) - Primarní melanom a metastázy v lymfatických uzlinách ! Laserová mikrodisekce nezávislé klony? • Cheng L et al. Cancer. 2002;94(1):104-10. Inaktivace X chromozomu (HhaI-treated AR alely) -(Mikro)sekce (T1-T5) karcinomu močového měchýře 9 pacientů informativních, u 7 z nich neklonální inaktivace X, u 2 stejný pattern nenáhodné inaktivace ve všech oblastech nádoru! Genomic mutational landscapes Boutros PC et al. Nat Genet. 2015;47(7):736-45. Evidence of multiclonal prostate cancer. CPCG0183 exhibits two regions sharing no genomic aberrations at either the CNA (copy number abberations) (a) or SNV (single nucleotide variants) (b) level, suggestive of multiclonality. Ale! Parsons B, Multiclonal tumor origin: Evidence and implication Mutat Res Rev Mutat Res 2018;777:1-18. When these data are extrapolated, taking into account the technical biases against detecting multiclonality and the potential for pseudomonoclonality in fully-developed tumors, it seems likely that most tumors are multiclonal. For tumors of myeloid cell lineages, most (but not all) evidence supports monoclonal tumor origin. Studies summarized here support multiclonal origin for at least some portion of 53 different tumors that develop across 24 different anatomical sites! Multiklonalita nádorů Maddipati R, Stanger BZ. Pancreatic Cancer Metastases Harbor Evidence of Polyclonality. Cancer Discov. 2015;5(10):1086-97. Sledování osudu jednotlivých buněk tkáně pomocí “lineage tracing” – RosaConfetti allela (“Confetti mice”) Rekombinace pomocí Cre rekombinázy (exprimované v buňkách slinivky – PDX – pancreatic and duodenal homeobox 1 promotor) – vede k náhodné expresi jedné ze 4 fluorescenčních značek – stabilní, přenášené na dceřinné buňky CX mice Multiklonalita nádorů Sledování osudu jednotlivých buněk tkáně pomocí “lineage tracing” – RosaConfetti allela (“Confetti mice”) Rekombinace pomocí Cre rekombinázy (exprimované v buňkách slinivky – PDX – pancreatic and duodenal homeobox 1 promotor) – vede k náhodné expresi jedné ze 4 fluorescenčních značek a současné expresi onkogenního Kras a depleci p53 KPCX mice – rozvoj pankreatických nádorů Sekvence: ADM – PanIN – PDAC 24% ADM je polychromatických – vzniká z různých acinárních buněk a klonální diverzita se ztrácí s další progresí Maddipati R, Stanger BZ. Cancer Discov. 2015;5(10):1086-97. Multiklonalita nádorů? Acha-Sagredo A et al. Ann Oncol. 2022;33(12):1239-1249. Velká četnost potenciálních cancer-driving mutací v histologicky normálních tkáních - Zvyšuje se s věkem, chronickým zánětem a expozicí mutagenům Somatické mutace v normálních tkáních Thus, aged sun-exposed skin is a patchwork of thousands of evolving clones with over a quarter of cells carrying cancer-causing mutations while maintaining the physiological functions of epidermis. Martincorena I et al. Science. 2015 May 22; 348(6237): 880–886. Somatické mutace v normálních tkáních – nepřítel nebo ne? Colom B et al. Nature 2021;598(7881):510-514 Mutant clones in normal epithelium outcompete and eliminate emerging tumours Nádory jícnu myší po expozici mutagenu - většina z nich časem zmizí Nádorová heterogenita Nádorová heterogenita Nádorová heterogenita Nádorová heterogenita Nádorová heterogenita Neelakantan D et al. Cell Adh Migr. 2015;9(4):265-76. Heterogeneity can arise from both genetic and non-genetic mechanisms. Intratumoral heterogeneity can arise through a variety of mechanisms. (A) A strictly genetic mechanism can involve genetic mutations (lightening bolt), some of which may give a clone a fitness advantage over nearby tumor cells (light blue and orange genotype is more fit than green genotype). This model can involve genetic fitness being selected for by the local microenvironment. (B) An alternative model involves cancer stem cells (CSCs), which arise due to differentiation hierarchies that may not involve genetic alterations, but may act in combination with mutations. A self-renewing tumor cell, the CSC, can undergo asymmetric division, increasing the overall number of CSC and non-CSC tumor cells. Genetic mutation of a CSC can lead to the outgrowth of a more fit genetic clone (dark blue), that may or may not be affected by the local microenvironment. Additionally, the microenvironment can trigger phenotypic changes, such as what occurs in a hypoxic environment (red cells). Importantly, if the original clone is outcompeted over time, it would not be detectable in patient biopsies. Nádorová heterogenita Parsons B. Mutat Res Rev Mutat Res 2018;777:1-18. Four common explanations for how monoclonal tumor origin results in phenotypically and genetically heterogeneous tumors. Heterogeneity of monoclonal tumors arises through mutation accumulation and clonal selection (A), through cooperation between malignant and non-malignant cell types (B), through epithelial to mesenchymal or mesenchymal to epithelial transitions (C), and through proliferation and subsequent differentiation of a mutant stem cell (D). Genetická heterogenita •  Na počátku vývoje nádorů stojí několik mutací aktivujících protoonkogeny a inaktivujících nádorové supresory (monoklonální původ nádorů). •  Nicméně vývoj nádorů je mnohem komplexnější proces připomínající Darwinovskou evoluci. •  Kombinace mnoha buněčných cyklů nutných k vývoji makroskopického nádoru a zvýšené genetické nestability umožňují značnou genetickou diverzifikaci populace nádorových buněk. Marusyk A. et al., Nature Rev. 2012 Nádorová heterogenita Typy nádorů z hlediska genetické nádorové heterogenity •  Jednoduché klonální nádory mají minimální úroveň genetické nestability; jsou často řízeny balancovanou translokací; jsou málo geneticky heterogenní. •  Nádory s komplexními klony nesou stejné řídící mutace, ale rozdílné subpopulace v nádoru mají privátní genetické anomálie; ty jsou „běžně“ neutrální, ale mají potenciál stát se řídícími mutacemi rezistence k cílené léčbě. •  Mozaikové nádory složeny z buněk, které sdílejí některé prvotní genetické události, ale klonální heterogenita je značná. Turner NC a Reis-Filho JS, Lancet Oncology. 2012 Negenetická heterogenita •  Je vlastní normálním tkáním: téměř všechny buňky mají stejný genotyp, ale výrazně se fenotypově liší. •  Je dvou typů: (1) deterministická: související s tkáňově specifickou diferenciační hierarchií; a (2) stochastická, která je odrazem přechodných rozdílů mezi jednotlivými buňkami v důsledku fluktuace biochemických procesů, genové exprese a organizace chromatinu. •  Diferenciační hierarchie nádorových tkání (i) odráží to, co je shrnuto v konceptu CSC (Cancer Stem Cell): do určité míry kopíruje normální diferenciaci v normálních tkáních plus navýšená ochota k dediferenciaci v důsledku onkogenních mutací; Marusyk A. et al., Nature Rev. 2012 (ii) míra diferenciace je významným prognostickým faktorem. Nádorová heterogenita Negenetická heterogenita nádorových tkání •  Epigenetická krajina a síť genové regulace: (a) vrcholy a údolí znázorňují přechodné a stabilní fenotypové stavy; (b) na osách hladiny některých určujících faktorů: (i) např. transkripčních faktorů spojených s diferenciací, tj. vnitřní stav buněk; (ii) růstových faktorů v okolí buňky, tj. vliv nádorového mikroprostředí (komplexní: angiogeneze, přestavba ECM, zánět, …) Marusyk A. et al., Nature Rev. 2012 buňka •  Dynamika evoluce populace nádorových buněk vede ke koexistenci klonálních variant s genetickými a epigenetickými rozdíly – a to vše s mnoha biologickými a klinickými důsledky. Nádorová heterogenita Co ovlivňuje buněčný fenotyp: normální vs. nádorová tkáň •  Onkogenní mutace v nádorových buňkách navyšují stochastickou fluktuaci (noise) buněčných procesů, což může navyšovat šanci na překonání „hřebene“ epigenetické krajiny a k fenotypovému „přepnutí“. •  Genotyp je homogennější v normální tkáni než v nádorové tkáni (genetická nestabilita). •  Mikroprostředí je v normální tkáni mnohem strukturovanější a má jen omezený a organizovaný počet niches. Nádorová tkáň je dezorganizovaná, má mnohem více a méně vyhraněných niches. •  V normální tkáni je stabilnější regulační síť s nižším počtem signálů ovlivňujících genovou expresi. ⇒ Integrace všech těchto vlivů vede k vyšší variabilitě méně stabilních buněčných fenotypů u nádorů ve srovnání s normální tkání. Marusyk A. et al., Nature Rev. 2012 Marusyk A. et al., Nature Rev. 2012 Co ovlivňuje buněčný fenotyp: normální vs. nádorová tkáň Heterogenita v metastázách •  Otázka intranádorové – včetně „intra- i inter-metastázové“ – heterogenity je nesmírně důležitá i v souvislosti s tím, že terapeutická rozhodnutí se nejvíce dělají na základě analýzy primárních nádorů, ale nejčastější příčinou smrti bývají vzdálené metastázy… •  Dva krajní modely: (1) získání metastatického potenciálu jako finální krok v progresi nádoru z nejagresivnějšího klonu primárního nádoru → pak značná podobnost primárního nádoru a metastáz; (2) raný rozsev nádoru a spíše paralelní progrese nádoru primárního a metastáz → může vést ke značným rozdílům… •  Experimentálně lze doložit oba modely a samozřejmě mnoho možných variant mezi nimi.. Ø  Obecně: nelze zobecňovat - ani jeden ze dvou uvedených modelů… Marusyk A. et al., Nature Rev. 2012 Heterogenita v metastázách Marusyk A. et al., Nature Rev. 2012 Heterogenita v metastázách – polyklonální původ Cheung KJ et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(7):E854-63. Heterogenita v metastázách – polyklonální původ Cheung KJ et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(7):E854-63. Serial seeding? Výhoda polyklonálního seedingu? Heterogenita v metastázách – polyklonální původ Cheung KJ et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(7):E854-63. optical barcoding approach based on a multicolor panel of Lentiviral Gene Ontology (LeGO) vectors Heterogenita v metastázách – polyklonální původ Intrametastatická heterogenita metastáz v plicích a játrech Většina metastáz monochromatická, ale více polychromatických mets v plicích (17 %) než v játrech (1.2 %) Ale těchto 17 % tvoří téměř 90 % celkového objemu metastáz v plicích Některé klony častěji spolu v polychromatických ložiscích Cheung KJ et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(7):E854-63. Důsledky nádorové heterogenity Biologické •  Klonální heterogenita jako pohon evoluce nádoru •  Biologické interakce mezi odlišnými nádorovými klony Kooperace mezi různými klony – v očních discích Drosophily: 1.  klon s overexpresí mutantní formy Ras onkogenu – mírný růst 2.  Klon deficientní pro TS Scribble – buněčná smrt 3.  Oba klony v blízkosti – velké metastatické tumory Wu M et al. Nature. 2010;463(7280):545-8. Důsledky nádorové heterogenity Biologické •  Klonální heterogenita jako pohon evoluce nádoru •  Biologické interakce mezi odlišnými nádorovými klony Subclonal cooperation drives metastasis by modulating local and systemic immune microenvironments Janiszewska et al. Nat Cell Biol. 2019;21(7):879-888. Polyclonal tumours initiated from 5% IL11+ and 5% FIGF+RFP+ cells with 90% GFP+ parental cells grew faster and were more metastatic than monoclonal and parental tumours Důsledky nádorové heterogenity Biologické •  Klonální heterogenita jako pohon evoluce nádoru •  Biologické interakce mezi odlišnými nádorovými klony Cooperation between melanoma cell states promotes metastasis through heterotypic cluster formation Janiszewska et al. Nat Cell Biol. 2019;21(7):879-888. Melanomas can have multiple coexisting cell states, including proliferative (PRO) versus invasive (INV) subpopulations that represent a “go or grow” trade-off; INV and PRO cells form spatially structured heterotypic clusters and cooperate in the seeding of metastasis, maintaining cell state heterogeneity. INV cells adhere tightly to each other and form clusters with a rim of PRO cells. Důsledky nádorové heterogenity Biologické •  Klonální heterogenita jako pohon evoluce nádoru •  Biologické interakce mezi odlišnými nádorovými klony Klinické •  „Sampling“ (výběr vzorku k analýze) a heterogenita v klinické diagnóze •  … Marusyk A. and Polyak K., Biochim Bipophys Acta 2010 Marusyk A. et al., Nature Rev. 2012 Heterogenita v klinické diagnóze Marusyk A. et al., Nature Rev. 2012 Biologické •  Klonální heterogenita jako pohon evoluce nádoru •  Biologické interakce mezi odlišnými nádorovými klony Klinické •  „Sampling“ (výběr vzorku k analýze) a heterogenita v klinické diagnóze •  Heterogenita v odpovědi na terapii (→ selekce: „bottleneck“ a dočasná redukce heterogenity → další evoluce, progrese rezistentních klonů…) Důsledky nádorové heterogenity Marusyk A. and Polyak K., Biochim Bipophys Acta 2010 Marusyk A. et al., Nature Rev. 2012 Gerlinger M a Swanton C, Br J Cancer 2010 Heterogenita v odpovědi na terapii „Získaná“ rezistence k terapii •  Podle současných znalostí je klinický obraz tzv. získané rezistence k terapii spíše následkem přítomnosti již existujících odolných klonů, které jsou „pouze“ vyselektovány léčbou. Např. v komplexních klonálních GIST s mutací KIT nesou všechny buňky aktivační mutaci KIT, ale mnohočetné sekundární mutace KIT lze nalézt u subklonů daného nádoru a mají schopnost způsobit rezistenci k léčbě. •  obecně: Nádory s vysokou mírou genetické nestability a s vysokým stupněm genetické heterogenity jsou spojeny se špatnou prognózou. Turner NC a Reis-Filho JS, Lancet Oncology. 2012 Děkuji za pozornost!