Interakce proteinů s malými molekulami Molekulární dokování C3210 Strukturní bioinformatika, podzim 2023 Michaela Wimmerová Interakce proteinů • Molekulární rozpoznávání – interakce biomakromolekul, interakce biomakromolekul s malými molekulami. • Základ všech biologických procesů v živých organismech. • Proteiny: strukturní, mechanické, biochemické, signální funkce • Proteiny: interakce s proteiny, peptidy, nukleovými kyselinami, membránami, malými molekulami • Specifita – upřednostňování některých interakčních partnerů • Afinita – síla interakce • Ligand – molekula schopná interagovat s proteinem s vysokou specifitou a afinitou Vazebná kinetika a termodynamika P protein L ligand PL komplex protein ligand kon asociační rychlostní konstanta koff disociační rychlostní konstanta Rovnováha Kb (Ka) rovnovážná vazebná (asociační, afinitní) konstanta Kd rovnovážná disociační konstanta Kinetika interakce určuje termodynamiku interakce – stabilitu komplexu PL G Gibbsova energie H entalpie S entropie Mechanismy interakcí • Pro popis mechanismu interakcí (vazby) byly navrženy různé modely. • „Lock and the key“ (zámek a klíč) Protein a ligand jsou rigidní, ligand perfektně zapadá do vazebného místa. Mnohdy odporuje experimentálnímu pozorování. • „Induced fit“ (indukované přizpůsobení) Vazebné místo proteinu je flexibilní, konformační změna indukovaná ligandem. Nezohledňuje dynamiku proteinů. • „Conformational selection“ Protein se vyskytuje v mnoha různých konformačních stavech, ligand se váže na ten nejvhodnější. „Lock and the key“ „Induced fit“ „Conformational selection“ Experimentální metody studia interakcí • Izotermní (izotermická, izotermální) titrační kalorimetrie. • Zlatý standard (referenční metoda, nejlepší možná) studia interakcí. • Termodynamická technika pro charakteristiku jakékoliv vazebné interakce. • Během vazby je spotřebováno nebo uvolňováno teplo. Měření tepelných změn umožňuje přesné určení vazebných konstant, reakční stechiometrie, entalpie i entropie. Stechiometrie Afinita Entalpie DG0 = -RTln Ka DG = DH - TDS Molární poměr kJ/mol (vztaženonatitrant) Protein Ligand Bez značení, bez imobilizace Měření v roztoku “Eliminace” nespecifických interakcí Určení termodynamiky a afinity v jednom měření Experimentální metody studia interakcí • Izotermní (izotermická, izotermální) titrační kalorimetrie. • Zlatý standard (referenční metoda, nejlepší možná) studia interakcí. • Termodynamická technika pro charakteristiku jakékoliv vazebné interakce. • Během vazby je spotřebováno nebo uvolňováno teplo. Měření tepelných změn umožňuje přesné určení vazebných konstant, reakční stechiometrie, entalpie i entropie. Stechiometrie Afinita Entalpie DG0 = -RTln Ka DG = DH - TDS Molární poměr kJ/mol (vztaženonatitrant) Protein Ligand Vysoká spotřeba vzorku Citlivé na „buffer mismatch“ Problém bublin, agregace vzorku Experimentální metody studia interakcí • Rezonance povrchového plazmonu. • Jeden vazebný partner je imobilizován na povrchu biosenzoru, druhý volný v roztoku. • Za podmínek totálního vnitřního odrazu vzniká při dopadu paprsku šířeného v opticky hustším prostředí v opticky řidším prostředí exponenciální vlna (tlumená, zhášivá). • Při určité kombinaci úhlu dopadu a vlnové délky dochází k excitaci volných elektronů v kovu na povrchu biosenzoru, což se projeví poklesem intenzity odraženého světla. • Tento jev je závislý na indexu lomu prostředí, který se mění s vazbou „volného“ partnera na imobilizovaného. • Studium specifity, kinetiky a afinity interakcí. Měření v „reálném čase“ Bez nutnosti značení a detekční reakce Nízká spotřeba vzorku Vysoká citlivost Experimentální metody studia interakcí • Rezonance povrchového plazmonu. • Jeden vazebný partner je imobilizován na povrchu biosenzoru, druhý volný v roztoku. • Za podmínek totálního vnitřního odrazu vzniká při dopadu paprsku šířeného v opticky hustším prostředí v opticky řidším prostředí exponenciální vlna (tlumená, zhášivá). • Při určité kombinaci úhlu dopadu a vlnové délky dochází k excitaci volných elektronů v kovu na povrchu biosenzoru, což se projeví poklesem intenzity odraženého světla. • Tento jev je závislý na indexu lomu prostředí, který se mění s vazbou „volného“ partnera na imobilizovaného. • Studium specifity, kinetiky a afinity interakcí. Nutná imobilizace jednoho partnera Nespecifické interakce (vysoká citlivost) Finančně nákladné Výpočetní metody studia interakcí • Molekulární dokování („docking“). • In silico modelování interakcí – predikce vzájemné orientace a pozice interagujících molekul tvořících stabilní komplex, predikce změny volné vazebné energie. • Dokování protein-ligand: význam při vývoji nových léčiv, virtuální screening celých databází molekul pro výběr vhodného interakčního partnera (inhibitoru) proteinu. Struktura proteinu (experimentální, predikovaná) Virtuální screening desítek tisíců již schválených léčiv, léčiv z klinických testů, známých farmakologicky aktivních látek Identifikace potenciálních léčiv Výpočetní metody studia interakcí • Molekulární dokování („docking“). • In silico modelování interakcí – predikce vzájemné orientace a pozice interagujících molekul tvořících stabilní komplex, predikce změny volné vazebné energie. • Dokování protein-ligand: význam při vývoji nových léčiv, virtuální screening celých databází molekul pro výběr vhodného interakčního partnera (inhibitoru) proteinu. HIV protease inhibitor, 1997 Léčba závislosti na alkoholu Antihypertenzivum Dokování protein-ligand • Dokování protein-ligand: význam při vývoji nových léčiv, virtuální screening celých databází molekul pro výběr vhodného interakčního partnera (inhibitoru) proteinu. • Vstupy: struktura proteinu, struktura ligandu • Výstupy: struktura komplexu (póza – konkrétní geometrické uspořádání komplexu protein-ligand), vazebná afinita (skóre – reprezentuje sílu vazby). Reprezentace molekul Konformační vyhledávání Skórování Příprava Vlastní dokování Dokování protein-ligand • Dokování protein-ligand: význam při vývoji nových léčiv, virtuální screening celých databází molekul pro výběr vhodného interakčního partnera (inhibitoru) proteinu. • Vstupy: struktura proteinu, struktura ligandu • Výstupy: struktura komplexu (póza – konkrétní geometrické uspořádání komplexu protein-ligand), vazebná afinita (skóre – reprezentuje sílu vazby). Reprezentace molekul Vhodný (výpočetně) způsob, jak znázornit molekuly proteinu a ligandu (atomy, povrch) Konformační vyhledávání Skórování 10.1093/nar/gkt509 Dokování protein-ligand • Dokování protein-ligand: význam při vývoji nových léčiv, virtuální screening celých databází molekul pro výběr vhodného interakčního partnera (inhibitoru) proteinu. • Vstupy: struktura proteinu, struktura ligandu • Výstupy: struktura komplexu (póza – konkrétní geometrické uspořádání komplexu protein-ligand), vazebná afinita (skóre – reprezentuje sílu vazby). Reprezentace molekul Vhodný (výpočetně) způsob, jak znázornit molekuly proteinu a ligandu (atomy, povrch) Konformační vyhledávání Prohledávácí (searching, search) algoritmus vytváří množinu možných póz, ideálně s co nejnižší energií Skórování Dokování protein-ligand • Dokování protein-ligand: význam při vývoji nových léčiv, virtuální screening celých databází molekul pro výběr vhodného interakčního partnera (inhibitoru) proteinu. • Vstupy: struktura proteinu, struktura ligandu • Výstupy: struktura komplexu (póza – konkrétní geometrické uspořádání komplexu protein-ligand), vazebná afinita (skóre – reprezentuje sílu vazby). Reprezentace molekul Vhodný (výpočetně) způsob, jak znázornit molekuly proteinu a ligandu (atomy, povrch) Konformační vyhledávání Systematické: postupná optimalizace dílčích řešení Stochastické: náhodné modifikace strukturních parametrů Skórování Dokování protein-ligand • Dokování protein-ligand: význam při vývoji nových léčiv, virtuální screening celých databází molekul pro výběr vhodného interakčního partnera (inhibitoru) proteinu. • Vstupy: struktura proteinu, struktura ligandu • Výstupy: struktura komplexu (póza – konkrétní geometrické uspořádání komplexu protein-ligand), vazebná afinita (skóre – reprezentuje sílu vazby). Reprezentace molekul Vhodný (výpočetně) způsob, jak znázornit molekuly proteinu a ligandu (atomy, povrch) Konformační vyhledávání Prohledávácí (searching, search) algoritmus vytváří množinu možných póz, ideálně s co nejnižší energií Skórování Skórovací funkce vyhodnocuje energii komplexu. Odhad vazebné afinity póz, porovnání, výběr nejvýhodnějšího vazebného módu Dokování protein-ligand • Dokování protein-ligand: význam při vývoji nových léčiv, virtuální screening celých databází molekul pro výběr vhodného interakčního partnera (inhibitoru) proteinu. • Vstupy: struktura proteinu, struktura ligandu • Výstupy: struktura komplexu (póza – konkrétní geometrické uspořádání komplexu protein-ligand), vazebná afinita (skóre – reprezentuje sílu vazby). Reprezentace molekul Vhodný (výpočetně) způsob, jak znázornit molekuly proteinu a ligandu (atomy, povrch) Konformační vyhledávání Prohledávácí (searching, search) algoritmus vytváří množinu možných póz, ideálně s co nejnižší energií Skórování Skórovací funkce vyhodnocuje energii komplexu. Odhad vazebné afinity póz, porovnání, výběr nejvýhodnějšího vazebného módu Problém flexibility • Dokování protein-ligand: problém flexibility, tj. vzájemného přizpůsobení proteinu a ligandu, výskytu proteinu ve více konformacích. • Rigidní dokování – ani protein, ani ligand nejsou flexibilní (zámek a klíč). • Semiflexibilní dokování – rigidní protein, flexibilní ligand. • Flexibilní dokování – flexibilní protein, flexibilní ligand. Problém flexibility • Dokování protein-ligand: problém flexibility, tj. vzájemného přizpůsobení proteinu a ligandu, výskytu proteinu ve více konformacích. • Rigidní dokování – ani protein, ani ligand nejsou flexibilní (zámek a klíč). • Semiflexibilní dokování – rigidní protein, flexibilní ligand. • Flexibilní dokování – flexibilní protein, flexibilní ligand. Problém vody • Dokování protein-ligand: problém modelování molekul vody, molekuly vody mají vliv na změnu solvatační entropie, mohou se přímo zapojovat do vazby mezi proteinem a ligandem. • Implicitní model – vodné prostředí je modelováno pomocí elektrické permitivity (konstantní x závislá na vzdálenosti atomů). • Explicitní model – do modelu se přímo přidají molekuly vody (výpočetně náročné). https://web.vscht.cz/~spiwokv/modelovani/glossary.html „Blind docking“ • Molekulární dokování („docking“). • In silico modelování interakcí – predikce vzájemné orientace a pozice interagujících molekul tvořících stabilní komplex, predikce změny volné vazebné energie. • Vstupy: struktura proteinu, struktura ligandu • Vazebné místo: známé x neznámé („blind docking“) • „Blind docking“ – prohledávání celého povrchu proteinu, hledání míst, kam se mohou stabilně navázat ligandy. Možnost objevení (nových) vazebných míst pro navázaní ligandu (léčiva, inhibitoru). Výpočetně náročné. https://doi.org/10.1007/s11227-019-02834-5 Kovalentní dokování Klasický dokovací algoritmus (Attracting Cavities) Pózy QM/MM Výsledky • Dokování protein-ligand: význam při vývoji nových léčiv. • Kovalentní inhibitor: vysoká účinnost, dlouhotrvající účinek. • Kovalentní dokování: nutné modelovat kovalentní vazbu. Jak zahrnout příspěvek kovalentní vazby do skórovací funkce? • Pro popis vzniku/štěpení kovalentních vazeb nestačí klasické dokování, vyžaduje kvantově-mechanický přístup. Nebo trik. Kovalentní dokování • Dokování protein-ligand: význam při vývoji nových léčiv. • Kovalentní inhibitor: vysoká účinnost, dlouhotrvající účinek. • Kovalentní dokování: nutné modelovat kovalentní vazbu. Jak zahrnout příspěvek kovalentní vazby do skórovací funkce? • Pro popis vzniku/štěpení kovalentních vazeb nestačí klasické dokování, vyžaduje kvantově-mechanický přístup. Nebo trik. Klasický dokovací algoritmus (Attracting Cavities) Pózy QM/MM Výsledky Příspěvek kovalentní vazby vyjádřen pomocí Morseho potenciálu Morseho potenciál: model potenciální energie dvouatomové molekuly Validace dokovacích nástrojů • Validační množiny: ligandy s krystalograficky určenou konformací ve vazebném místě cílové molekuly a experimentálně zjištěnou afinitou k cílové molekule (actives) + molekuly podobné ligandům, ale neschopné tvořit s cílovou molekulou komplex (decoys). http://dude.docking.org/ Soutěže a výzvy: D3R Grand Challenge https://drugdesigndata.org/about/grand-challenge https://www.ebi.ac.uk/pdbe/complex-pred/capri/ Predikce vazebných míst (LBSs – ligand-binding sites) • Identifikace vazebných míst je důležitá pro studium interakcí a vývoj léčiv. • Experimentální metody (X-Ray) jsou přesné, ale časově náročné. • Predikce vazebných míst – metody založené na studiu 3D struktur proteinů • Předpoklad – pro vznik stabilního komplexu je nutné dostatečně velké interakční rozhraní. • Vyhledávání kapes a kavit, které mohou sloužit jako vazebná místa. http://cao.labshare.cn/cb-dock/ Predikce vazebných míst (LBSs – ligand-binding sites) • Identifikace vazebných míst je důležitá pro studium interakcí a vývoj léčiv. • Experimentální metody (X-Ray) jsou přesné, ale časově náročné. • Predikce vazebných míst – metody založené na podobnosti • Předpoklad – proteiny jsou výsledkem evoluce, homologní proteiny jsou strukturně a funkčně podobné. • Využití známých proteinů jako templátů (sekvence x struktura). https://zhanggroup.org/COACH/ Predikce vazebných míst (LBSs – ligand-binding sites) • Identifikace vazebných míst je důležitá pro studium interakcí a vývoj léčiv. • Experimentální metody (X-Ray) jsou přesné, ale časově náročné. • Predikce vazebných míst – metody založené na podobnosti • Předpoklad – proteiny jsou výsledkem evoluce, homologní proteiny jsou strukturně a funkčně podobné. • Využití známých proteinů jako templátů (sekvence x struktura). Predikce vazebných míst (LBSs – ligand-binding sites) • Identifikace vazebných míst je důležitá pro studium interakcí a vývoj léčiv. • Experimentální metody (X-Ray) jsou přesné, ale časově náročné. • Predikce vazebných míst – metody založené na podobnosti • Předpoklad – proteiny jsou výsledkem evoluce, homologní proteiny jsou strukturně a funkčně podobné. • Využití známých proteinů jako templátů (sekvence x struktura). Predikce vazebných míst (LBSs – ligand-binding sites) • Identifikace vazebných míst je důležitá pro studium interakcí a vývoj léčiv. • Experimentální metody (X-Ray) jsou přesné, ale časově náročné. • Predikce vazebných míst – metody využívající strojové učení • Využití umělé inteligence, v současnosti hlavně metody „deep learning“ (hluboké učení). https://playmolecule.com/deepsite/ Predikce vazebných míst (LBSs – ligand-binding sites) https://playmolecule.com/deepsite/ Shrnutí • Molekulární rozpoznávání - základ všech biologických procesů • Vazebná kinetika + termodynamika • Různé modely mechanismu interakcí • Experimentální metody studia interakcí – náročné na čas, peníze a vzorek • Molekulární dokování – predikce • Mnoho různých typů dokování – různě náročné, různě přesné • Predikce vazebných míst – 3D struktury, podobnost, strojové učení Použitá a doporučená literatura