Kapalinová chromatografie Jiří Urban Nebát se a zeptat se Kancelář: A14/334 Kamenice 753/5 625 00 Brno E-mail: urban@chemi.muni.cz Web: http://urban.chemi.muni.cz Telefon: 549 49 8579 „Neexistují hloupé odpovědi, pouze chytré otázky.“ Aristoteles Separační techniky Separační techniky https://glossary.periodni.com https://chemed.chem.purdue.edu Destilace Extrakce Filtrace https://education.seattlepi.com https://shutterstock.com Sublimace Inspirace: Jan Havliš + + Kolonová chromatografie Chromatografie Michail Semjonovič Cvět  separace chlorofylových barviv na CaCO3  1901 – 1903 – 1905 – 1906 (pokus – odesláno – publikováno – název) Chromato-grafie  z řeckého chroma (barva) a graphein (psát)  цвет = barva Elektroforéza (Nobelova Cena 1948) Rozdělovací chromatografie (Nobelova Cena 1952) A. Tisselius A.J.P. Martin R. Synge www.wikipedia.org Chromatografie S03E10 Martin Prince Michail Semjonovič Cvět  separace chlorofylových barviv na CaCO3  1901 – 1903 – 1905 – 1906 (pokus – odesláno – publikováno – název) Chromato-grafie  z řeckého chroma (barva) a graphein (psát)  цвет = barva Elektroforéza (Nobelova Cena 1948) Rozdělovací chromatografie (Nobelova Cena 1952) A. Tisselius A.J.P. Martin R. Synge www.wikipedia.org Kapalinová chromatografie Kapalinová chromatografie Mobilní fáze Stacionární fáze Analyty 123 Neustálé ustalování rovnovážného rozdělení složek vzorku mezi fázemi. Instrumentace 1 – zásobník mobilní fáze 2 – odplyňovač mobilní fáze 3 – vysokotlaké čerpadlo 4 – dávkovač 5 – separační kolona 6 – termostat kolony 7 – detektor 8 – datová stanice 1 2 3 4 5 6 78 Vysokotlaká čerpadla Velkoobjemová stříkačka Pístové čerpadlo 30 – 50 – 100 MPa, odolnost vůči korozi, stabilní a reprodukovatelný průtok < 0,5 – 1% Aplikace Průměr kolony Průtok Konvenční LC 4,6 mm 0,5 – 1,0 ml/min Mikrokolonová LC 1 mm – 500 µm 40 µl/min – 20 µl/min Kapilární LC 500 µm – 100 µm 20 µl/min – 300 nl/min Nano LC 100 µm – 75 µm – 50 µm 300 nl/min – 180 nl/min – 80 nl/min Dávkování vzorků ̶ Nutno překonat protitlak mobilní fáze ̶ Automatické dávkovače (úprava vzorku, derivatizace,…) ̶ Nezapomenout, že objem vzorku ovlivňuje kvalitu separace! Vnější smyčka Vnitřní smyčka www.vici.com Velmi malé objemy (nl) Detekční techniky ̶ Selektivní – odezva pouze na koncentraci analyzované látky ̶ Univerzální – odezva úměrná celkové vlastnosti eluátu Ideální detektor Nejpoužívanější ̶ citlivý ̶ malý šum ̶ okamžitá odezva ̶ lineární v širokém koncentračním rozsahu ̶ hmotnostní (HPLC/MS) ̶ spektrofotometrický UV – VIS ̶ fluorimetrický ̶ elektrochemický ̶ vodivostní ̶ rozptyl světla ̶ odezva úměrná celkové vlastnosti eluátu ̶ minimální příspěvek k rozšiřování píků ̶ málo citlivý ke změnám tlaku, teploty a průtoku ̶ možnost práce s gradientem ̶ kompromis Detekční techniky ̶ Selektivní – odezva pouze na koncentraci analyzované látky ̶ Univerzální – odezva úměrná celkové vlastnosti eluátu Ideální detektor Nejpoužívanější ̶ citlivý ̶ malý šum ̶ okamžitá odezva ̶ lineární v širokém koncentračním rozsahu ̶ hmotnostní (HPLC/MS) ̶ spektrofotometrický UV – VIS ̶ fluorimetrický ̶ elektrochemický ̶ vodivostní ̶ rozptyl světla ̶ odezva úměrná celkové vlastnosti eluátu ̶ minimální příspěvek k rozšiřování píků ̶ málo citlivý ke změnám tlaku, teploty a průtoku ̶ možnost práce s gradientem ̶ kompromis 29 43 57 72 pentan Chromatografická kolona Délka konvenční kolony: 100 – 250 mm „high speed“ kolony < 50 mm Průměr 3 – 4 mm (analytické), 1 – 2 mm (mikrokolony), < 1 mm (kapilární), > 4 mm (preparativní) Částice LC > 20 mm (plněné za sucha) HPLC > 10 > 5 > 3 > 1.5 mm (suspenzní technika), kulové, pórovité, povrchově pórovité, neporézní, nejčastěji silikagel www.analytical-sales.com Optimalizace mimokolonových objemů Výběr instrumentace na základě kolony Aplikace Průměr kolony Průtok Konvenční LC 4,6 mm 0,5 – 1,0 ml/min Mikrokolonová LC 1 mm – 500 µm 40 µl/min – 20 µl/min Kapilární LC 500 µm – 100 µm 20 µl/min – 300 nl/min Nano LC 100 µm – 75 µm – 50 µm 300 nl/min – 180 nl/min – 80 nl/min Stacionární fáze Délka, průměr, velikost částic 150 x 4.6 mm, 5 mm L x ID x dp www.prozyme.com www.chromnet.net Velikost částic Porozita www.chromatographyshop.com Tvar částicStacionární fáze Stacionární fáze Délka, průměr, velikost částic 150 x 4.6 mm, 5 mm L x ID x dp www.prozyme.com www.chromnet.net Velikost částic Porozita www.chromatographyshop.com Tvar částicStacionární fáze Stacionární fáze Tlak na monolitické koloně 3-4x menší – vyšší permeabilita, zvyšování průtoku mobilní fáze - zhoršení účinnosti a rozlišení, větší naředění vzorku Monolitické www.crawfordscientific.com Omezení difúze látek do pórů > eliminace pórů. Snadné přetížení kolony, malé dávkované koncentrace (objemy). Neporézní www.merckmillipore.com Částice < 2 mm: Krátké kolony, technika UHPLC, speciální instrumentace, nejvyšší tlak na koloně, 100 – 150 MPa Kolony s částicemi s tenkou povrchovou pórovitou vrstvou na pevném jádře, menší tlak, vyšší permeabilita, vyšší průtoky, lepší rozlišení Povrchově-porézní Plně porézní Phys. Chem. Chem. Phys., 2014, 16, 6583- 6592. Povrchově porézní částice J. Chromatogr. A 1217 (2010) 3819. Chem. Commun., 2010, 46, 5832-5849 Monodispersní křemenné mikro částice (sub-2-3-mm) připravené pomocí Stöberovy metody (1968) Hydrolýza a polykondenzace tetraetyl-ortosilikátu probíhá v systému etanol/voda. Anal. Methods, 2016, 8, 919-924. Monolitické stacionární fáze – silikagel Monolitické stacionární fáze – polymer Silikagel Monolitické stacionární fáze Polymer Retenční mechanismy Rozdělení separačních metod 100 1 000 100 00010 000 chromatografie stérické výluky tenkovrstevná chromatografie vysokoúčinná kapalinová chromatografie plynová chromatografie molární hmotnost Vliv velikosti látek Mechanismy ̶ Adsorpce ̶ Rozdělování ̶ Chemická reakce ̶ Výměna iontů ̶ Srážení ̶ Sítový efekt Rozdělení separačních metod 100 1 000 100 00010 000 chromatografie stérické výluky tenkovrstevná chromatografie vysokoúčinná kapalinová chromatografie plynová chromatografie molární hmotnost Vliv velikosti látek Mechanismy ̶ Adsorpce ̶ Rozdělování ̶ Chemická reakce ̶ Výměna iontů ̶ Srážení ̶ Sítový efekt (Téměř) vše lze rozdělit… Seřaďte podle polarity Uracil Thiomočovina Fenol Toluen Ethylbenzen Propylbenzen Butylbenzen Seřaďte podle polarity Uracil Thiomočovina Fenol Toluen Ethylbenzen Propylbenzen Butylbenzen NEPOLÁRNÍ POLÁRNÍ Polarita www.wikipedia.org „Polární molekuly jsou molekuly, které mají stálý a nenulový dipólový moment, protože elektrický náboj je v nich rozložen nesymetricky.“ voda hexan Rozdíl elektronegativit Mechanismy retence ̶ Normální fáze ̶ Obrácené fáze ̶ Hydrofilní interakce ̶ Iontová výměna ̶ Iontová chromatografie ̶ Chromatografie stérické výluky Mechanismy retence ̶ Normální fáze ̶ Obrácené fáze ̶ Hydrofilní interakce ̶ Iontová výměna ̶ Iontová chromatografie ̶ Chromatografie stérické výluky Teoretická vsuvka 𝑘 = 𝑡 𝑅 − 𝑡 𝑀 𝑡 𝑀 Retenční faktor Normální fáze (NP) ̶ Izomery ̶ Vysoce hydrofobní látky ̶ Hydrofilní látky (ANP, cukry) ̶ Nepoužívá se gradient Mechanismus Aplikace Mobilní fáze Nepolární hexan, heptan s přídavkem izopropanolu, chloroformu nebo octanu ethylnatého www.agc.com Stacionární fáze Polární Silikagel, Al2O3, polární gely www.silicycle.com Uhlovodíky < halogen sloučeniny < ethery < nitrily < nitro sloučeniny < ketony < aldehydy < alkoholy < kyseliny Pořadí eluce k – retenční faktor j – koncentrace polárního rozpouštědla a, m – konstanty Nepolární > Polární log 𝑘 = 𝑎 − 𝑚 ∙ log 𝜑 Aplikace – Normální fáze Amino kolona, Acetonitril/voda (75:25) 1 – fruktóza, 2 – glukóza, 3 – sukróza, 4 –maltóza. www.chromatographyshop.com YMC-Pack Polyamine II 250 x 4.6mmI.D., n-hexan/octan etylnatý (70/30) Izomery Vitamínu ECukry www.ymcamerica.com Silikagel ̶ Povrch je slabě kyselý, což způsobuje chvostování bazických látek. ̶ Chemicky stabilní do pH 8 Sil – gel, typ A (méně čistý) - neionizovatelné látky, póry 2.5 nm Sil – sol, typ B rozklad organosilanů, shlukování plynné fáze, čistý, stabilnější i při vyšším pH – i ionizovatelné látky, póry 4.5 – 7 nm Porézní forma oxidu křemičitého (SiO2) vyráběná synteticky z křemičitanu sodného. Desikant Stelivo Stacionární fáze Vysoký aktivní povrch (800 m2/g) a snadná absorpce vody (zahřátím na 150°C lze regenerovat). www.team-cag.com Reverzní fáze (RP) ̶ Biologické vědy ̶ Životní prostředí ̶ Průmysl ̶ Gradient mobilní fáze log 𝑘 = 𝑎 − 𝑚 ∙ 𝜑 k – retenční faktor j – koncentrace organického rozpouštědla a, m – konstanty 80 – 90 % všech aplikací MechanismusMobilní fáze Polární Acetonitril Metanol Tetrahydrofuran Voda Stacionární fáze Nepolární Chemicky vázané fáze -C4, -C8, -C18 silikagel, uhlík, polymery www.biocomma.com www.materialharvest.com Aplikace Pořadí eluce Polární > Nepolární Aplikace – Barbituráty www.sigmaaldrich.com Discovery C18, 15 cm × 4.6 mm, 5 μm, 40% metanol, 1 ml/min, 30°C Chemicky vázané stacionární fáze commons.wikimedia.org Hydrofilní interakce (HILIC) Mechanismus Mobilní fáze Polární Acetonitril Metanol Vody/Pufr (nízké koncentrace) Stacionární fáze Polární Silikagel Polární funkční skupiny www.merckmillipore.com Andrew J. Alpert Interakce ve vodné vrstvě Rozhodující role v mechanismu separace Snadná volba podmínek pro daný separační problém. Duální retenční mechanismus Retence ovlivněná složením mobilní fáze J. Sep. Sci. 2013, 36, 2806. fenol thiomočovina HILIC RP Retence 95 % ACN 60 % ACN 30 % ACN Barbituráty, monolitická kapilární kolona. Chromatographia 79 (2016) 657 – 666. Aplikace – „Bath Salts“ Ascentis Express HILIC (Si), 10 cm x 2.1 mm, 2.7 µm, mobile phase: (A) 5 mM ammonium formate acetonitrile; (B) 5 mM ammonium formate water; (98:2, A:B); flow rate: 0.6 mL/min Aplikace – „Bath Salts“ Ascentis Express HILIC (Si), 10 cm x 2.1 mm, 2.7 µm, mobile phase: (A) 5 mM ammonium formate acetonitrile; (B) 5 mM ammonium formate water; (98:2, A:B); flow rate: 0.6 mL/min Shrnutí NP x RP x HILIC NP RP HILIC Stacionární fáze Polární Nepolární Polární Mobilní fáze Nepolární Polární Polární Vzorky Méně polární Ne/Polární Polární Retenci a selektivitu ovlivňuje polarita vzorku a mobilní a stacionární fáze. Iontově-výměnná chromatografie (IEX) ̶ Katexy s anionickými sulfonovými nebo karboxylovými iontově-výměnnými skupinami ̶ Anexy s kvarterními nebo terciárními aminovými skupinami Stacionární fáze Roztoky elektrolytů (pufry, soli, slabé kyseliny či báze), protiionty C soutěží s ionty vzorku S: kationty: EX-C+ + S+  EX-S+ + C+ anionty: EX+C- + S-  EX+S- + CMobilní fáze Q - iontově-výměnná kapacita, m = s/c je poměr nábojů vyměňovaných iontů     m c s c s c S M S M S k c QK V V S S V V k   j0 1 www.shimadzu.com Organické polymerní sorbenty, silikagel s chemicky vázanými iontově-výměnnými skupinami. Iontová chromatografie (IC) ̶ Vodivostní (supresor) ̶ Nepřímá detekce ̶ Eluce ftaláty, salicyláty www.thermofisher.com Odstranění iontů mobilní fáze (silný katex pro anionty) Pitná voda, zubní pasty (F-), zelenina (NO3 -), biologické tekutiny (Na+, K+), speciační analýza (Cr3+, Cr6+) Stacionární fáze Mobilní fáze Detekce Silný měnič iontů NaOH, Na2CO3 Moderní forma iontově-výměnné chromatografie Supresor Aplikace (IC) LC&GC North America 31 (2013) S4b. J. Anal. At. Spectrom., 2015,30, 1405-1407 Speciace - Arsen Speciace - Chrom www.perkinelmer.com ̶ Iontové páry se zásadami – silné kyseliny (k. chloristá, alkansulfonové kyseliny) ̶ Iontové páry s kyselinami – kvarterní amoniové soli (tetrabutylamoniumfosfát) Chromatografie iontových párů Tvorba iontových párů mezi chromatografovanými disociovanými kyselinami nebo zásadami a opačně nabitými ionty ve vodné fázi. Neutralizovaný náboj, hydrofobní látky > systém obrácených fází Protiionty Analýza kyselých a bazických látek v barvářských meziproduktech, farmaceutických výrobcích a produktech látkové výměny. Aplikace Chromatografie stérické výluky (SEC) Celková porozita Mezičásticový prostor Póry v částici Chromatografie stérické výluky (SEC) Polymery www.hzg.de Mobilní fáze THF, H2O Stacionární fáze Gely, polymery 𝑙𝑜𝑔𝑀 = 𝐴 − 𝐵 ∙ 𝑉𝑒 www.shimadzu.com Kalibrace 𝜂 = 𝐾𝑀 𝑎 Mark-Houwinkova rovnice (kalibrace pro jiný polymer) Vodná SEC Standardy dextranů Biopolymery polystyreny Retenční charakteristiky Retenční faktor ̶ Eluční čas a objem ̶ Retenční faktor tM – mrtvý čas tR,A – retenční čas látky A tR,B – retenční čas látky B 𝑘 = 𝐾 𝐷 𝑉𝑆 𝑉 𝑀 𝑘 = 𝑉𝑅 − 𝑉 𝑀 𝑉 𝑀 = 𝑡 𝑅 − 𝑡 𝑀 𝑡 𝑀 VS – objem stacionární fáze VM – objem mobilní fáze Fm – průtok mobilní fáze 𝑉𝑅 = 𝑡 𝑅 ∙ 𝐹 𝑚 Účinnost separace ̶ Výškový ekvivalent teoretického patra, HETP 𝑁 = 5.545 ∙ 𝑡 𝑅 𝑤0.5 2 𝑁 = 16 ∙ 𝑡 𝑅 𝑤4𝜎 2 𝑁 = 𝑡 𝑅 2 𝜎𝑡 2 𝑓𝑛 𝑥 = 1 𝜎 2𝜋 𝑒 − (𝑥−𝜇)2 2𝜎2 Gaussova funkce s – směrodatná odchylka m – střední hodnota náhodné veličiny (tR) ̶ Počet teoretických pater, N www.wikipedie.org 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 𝐿 𝑁 ̶ Lineární rychlost, u 𝑢 = 𝐿 𝑡 𝑀 Van Deemterova rovnice www.thermofisher.com 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 𝐴 + 𝐵 𝑢 + 𝐶𝑠 + 𝐶 𝑚 ∙ 𝑢 C – odpor proti převodu hmoty A – turbulentní difúze B – molekulová difúze kvalita a rovnoměrnost náplně Difúzní koeficienty látek (malé vs. velké molekuly) Difúze ve stacionární fázi, tvar a velikosti náplně, „hloubka“ difúze 𝐻 = 𝐻𝐴 + 𝐻 𝐵 + 𝐻 𝐶𝑠 + 𝐻 𝐶𝑚 ℎ = 𝐻 𝑑 𝑝 𝜈 = 𝑢 ∙ 𝑑 𝑝 𝐷 𝑚 Redukované veličiny dp – velikost částic Dm – difúzní koeficient Velikost částic a účinnost Lineární rychlost, mm/s Výškapatra,mm 10 mm 5 mm 3 mm 1.7 mm Vyšší účinnost pro menší částice při vyšších průtocích 70. léta 80. léta 90. léta 21. století Ilustrativní zobrazení Velikost částic a účinnost Lineární rychlost, mm/s Výškapatra,mm 10 mm 5 mm 3 mm 1.7 mm Vyšší účinnost pro menší částice při vyšších průtocích 70. léta 80. léta 90. léta 21. století Ilustrativní zobrazení Roste pracovní tlak UHPLC ~ 100 MPa Rozlišení 𝑅1,2 = 𝑁 4 ∙ 𝑘2 − 𝑘1 𝑘1 ∙ 𝑘1 1 + 𝑘1 = 𝑁 4 ∙ 𝛼 − 1 𝛼 ∙ 𝑘1 1 + 𝑘1 web.natur.cuni.cz/~pcoufal/hplc.html 𝑅1,2 = 2 𝑡 𝑅,2 − 𝑡 𝑅,1 𝑤1 + 𝑤2 w1 w1 N – počet pater k – retenční faktor účinnost selektivita retence a – selektivita 𝛼 = 𝑘2 𝑘1 Kontrola rozlišení 0 100000 200000 300000 0 2 4 6 8 Rozlišení 0 10 20 30 D R(N) R(k) R(a) 1.0 1.1 1.2 1.3 N N a a k k Rozlišení dvou látek nejvíce ovlivňuje selektivita separace (stacionární a mobilní fáze) 𝑅1,2 = 𝑁 4 ∙ 𝛼 − 1 𝛼 ∙ 𝑘1 1 + 𝑘1 N = 25 000, k = 3, a = 1.05 Vliv teploty Viskozita mobilní fáze a permeabilita Acetonitril Metanol T [°C] T [°C] 𝜂 = 10 𝑎+ 𝑏 𝑇+𝑐 a, b, c – konstanty rozpouštědla T – teplota v K Rychlost analýzy 1x 5x 20x Účinnost 𝐻 = 𝐴 + 𝐵 𝑢 + 𝐶 ∙ 𝑢 C – odpor proti převodu hmoty A – turbulentní difúze B – molekulová difúze 𝐵~𝐷 𝑚~ 𝑇 𝜂 𝐶~ 1 𝐷 𝑚 ~ 𝜂 𝑇 𝑇 𝐵 𝐶~ ~ 𝐷 𝑚 = 7.4 ∙ 10−8 𝑇 𝜙𝑠𝑣 ∙ 𝑀𝑠𝑣 𝜂 𝑠𝑣 ∙ 𝑉𝐴 0.6 Difúzní koeficient Wilke-Changova rovnice Gibbsova energie nižší teplota vyšší retence vyšší teplota nižší retence -DH0 -DS0 RP retence ∆𝐺0 = −𝑅𝑇 ∙ ln 𝐾 Distribuční koeficient Gibbsova volná energie Gibbsova energie nižší teplota vyšší retence vyšší teplota nižší retence -DH0 -DS0 RP retence Gibbsova energie nižší teplota vyšší retence vyšší teplota nižší retence -DH0 -DS0 RP retence Josiah Willard Gibbs (1839 – 1903) van´t Hoffova rovnice ln 𝐾 = − ∆𝐻0 𝑅𝑇 − ∆𝑆0 𝑅 ln 𝐾 = ln 𝑘𝛽 ln 𝑘 = − ∆𝐻0 𝑅𝑇 + ∆𝑆0 𝑅 − ln 𝛽 ln 𝑘 = − ∆𝐻0 𝑅𝑇 + ∆𝑆0 𝑅 + ln 𝑉𝑆 𝑉 𝑀 Φ = 1 𝛽 = 𝑉𝑆 𝑉 𝑀 log 𝑘 = 𝐴 + 𝐵 𝑇𝛽 = 𝑉 𝑀𝑜𝑏𝑖𝑙𝑛í 𝑉𝑆𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛á𝑟𝑛í Fázový poměr ∆𝐺0 = −𝑅𝑇 ∙ ln 𝐾 Distribuční koeficientGibbsova volná energie ∆𝐺0 = ∆𝐻0 − 𝑇∆𝑆0 Standardní molární entalpie Standardní molární entropie převodu látky mezi stacionární a mobilní fází Van´t Hoffova rovnice R – plynová konstanta, 8.314 JK-1mol-1 , T – termodynamická teplota, K, k – retenční faktor www.chromatography-online.org/Retention/Thermodynamics/rs_1_15.php www.chromatographyonline.com/elevated-temperatures-liquid-chromatography-part-iii-closer- look-van-t-hoff-equation van´t Hoffova rovnice 1/T, K-1 logk l𝑛 𝑘 = 𝐵 𝑇 + 𝐴 ln 𝑘 = − ∆𝐻0 𝑅𝑇 + ∆𝑆0 𝑅 + ln 𝑉𝑆 𝑉 𝑀 směrnice úsek entalpický příspěvek entropický příspěvek Δ𝐻0 Δ𝑆0 log 𝑘 = 𝐴 + 𝐵 𝑇 𝑉𝑆 𝑉 𝑀 = 𝑉𝐶 − 𝑉 𝑀 𝑉 𝑀 = 1 − 𝜀 𝑇 𝜀 𝑇 Konstantní při různých teplotách (?) Fázový poměr Entalpie vs. Entropie Systém A Systém B ln k ln k 1/T 1/T Entalpie vs. Entropie − ∆𝑆0 𝑅 − ln 𝑉𝑆 𝑉 𝑀 Systém A ∆𝐻0 𝑅 Systém B − ∆𝑆0 𝑅 − ln 𝑉𝑆 𝑉 𝑀 ∆𝐻0 𝑅 ln k ln k 1/T 1/T Dominantní vliv entalpie Malý vliv entropie Malý vliv entalpie Velký vliv entropie Entalpie vs. Entropie Dominantní vliv entalpie Malý vliv entropie Malý vliv entalpie Velký vliv entropie Rozdělení kontrolují molekulární síly, interakce vzorku se stacionární fází Rozdělení kontrolované (náhodnou) entropií. Žádné interakce. Větší záporná entropie – větší retence (menší chaos). Chirální separace Size-exclusion 1/T 1/T − ∆𝑆0 𝑅 − ln 𝑉𝑆 𝑉 𝑀 Systém A ∆𝐻0 𝑅 Systém B − ∆𝑆0 𝑅 − ln 𝑉𝑆 𝑉 𝑀 ∆𝐻0 𝑅 ln k ln k Termodynamický popis retence Termodynamika retence popisuje, že existují dva hlavní mechanismy. Nelze ale přímo odvodit, jak lze takto retenci kontrolovat. To se musí dít/studovat skrze rozdělovací koeficient (K) ovlivněný molekulárními interakcemi a poměr objemů stacionární a mobilní fáze (VS/VM), tedy geometrií stacionární fáze. − ∆𝑆0 𝑅 − ln 𝑉𝑆 𝑉 𝑀 Systém A ∆𝐻0 𝑅 Systém B − ∆𝑆0 𝑅 − ln 𝑉𝑆 𝑉 𝑀 ∆𝐻0 𝑅 ln k ln k 1/T 1/T Antihistaminika 21 °C 29.0% ACN 1.35 ml/min 195 bar 12.5 min 80 °C 26.5% ACN 3.00 ml/min 195 bar 2.5 min ZirChrom-PBD, 100 x 4.6 mm J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31–62. 16.9 ml 7.5 ml Spotřeba mobilní fáze Tokoferoly a tokotrienoly J. Agric. Food Chem. 60 (2012) 2076−2082.Kolona PerfectSil Target, isopropanol/voda (75:25); průtok 0.3 mL/min Tokoferoly a tokotrienoly Kolona PerfectSil Target, isopropanol/voda (75:25); průtok 0.3 mL/min J. Agric. Food Chem. 60 (2012) 2076−2082. Gradientová eluce Konstantní složení mobilní fáze 40 % ACN Konstantní složení mobilní fáze 60 % ACN Konstantní složení mobilní fáze 80 % ACN Chromatografická eluce Izokratická eluce Gradientová eluce 40 % acetonitrilu 20 – 80 % acetonitrilu ve 20 min 70 minut 15 minut Kontinuální změna složení mobilní fáze. Snížení retence více zadržovaných látek Počáteční koncentrace 5 – 80 % za 30 minut 25 – 80 za 30 min Čím vyšší, tím rychlejší eluce málo zadržovaných látek A Koncová koncentrace 5 – 60 % za 30 minut 5 – 90 za 30 min jK Čím vyšší, tím rychlejší eluce více zadržovaných látek Čas gradientu 5 – 60 % za 30 minut 5 – 60 % za 15 min Čím vyšší, tím rychlejší eluce látek tG Strmost gradientu 5 – 60 % za 30 minut 5 – 60 % za 15 min Čím vyšší, tím rychlejší eluce látek B𝐵 = 𝜑 𝐾 − 𝐴 𝑡 𝐺 Převod metody 𝑉 𝑀 𝑉𝐺 = 𝑉 𝑀 𝑡 𝐺 𝐹𝑚 = 𝑑 𝑐 2 𝐿 𝑡 𝐺 𝐹𝑚 = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑎 Základní předpoklad Pozor na zpoždění gradientu  Použít v rovnicích popisujících retenci  Dávkovat do „začátku“ gradientu (ne každý systém to dovoluje) mobilnífáze Reálný průběh VD Složitější optimalizace než v izokratické eluci Průměr a délka kolony Převod metody Systém 1 Systém 2 L – délka kolony dc – průměr kolony dp – velikost částic Vi – dávkovaný objem F – Průtok mobilní fáze p – Pracovní tlak N – účinnost tg – čas (v) gradientu 𝑉 𝑀 𝑉𝐺 = 𝑉 𝑀 𝑡 𝐺 𝐹𝑚 = 𝑑 𝑐 2 𝐿 𝑡 𝐺 𝐹𝑚 = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑎 Převod metody Systém 1 Systém 2Průtok mobilní fáze 𝐹2 = 𝐹1 ∙ 𝑑 𝑐(2) 2 𝑑 𝑐(1) 2 ∙ 𝑑 𝑝(1) 𝑑 𝑝(2) Dávkovaný objem 𝑉𝑖(2) = 𝑉𝑖(1) ∙ 𝑑 𝑐(2) 2 ∙ 𝐿2 𝑑 𝑐(1) 2 ∙ 𝐿1 Profil gradientu 𝑡 𝑔(2) = 𝑡 𝑔(1) ∙ 𝑉 𝑀(2) 𝑉 𝑀(1) ∙ 𝐹1 𝐹2 Účinnost 𝑁2 = 𝑁1 ∙ 𝑑 𝑝(1) 𝑑 𝑝(2) ∙ 𝐿2 𝐿1 𝑝2 = 𝑝1 ∙ 𝐿2 ∙ 𝐹2 𝐿1 ∙ 𝐹1 ∙ 𝑑 𝑝(1) ∙ 𝑑 𝑐(1) 𝑑 𝑝(2) ∙ 𝑑 𝑐(2) 2 Pracovní tlak Vícerozměrné separace Moderní umění (?) www.tjbiochip.com (2D) gelová elektroforéza www.tjbiochip.com Molárníhmotnost pH 1D HPLC První dimenze, 1nc 2D HPLC První dimenze, 1nc 𝑛 𝑐,2𝐷 = 1 𝑛 𝑐 × 2 𝑛 𝑐 Násobné zvýšení píkové kapacity Comprehensive 2D-LC www.laboratory-journal.com Dvourozměrná chromatografie J. Chromatogr. A 1189 (2008) 207–220 Fenolické látky a flavony Pilsner Urquell J. Sep. Sci. 31 (2008) 3309 – 3328. SFC Superkritická fluidní chromatografie (SFC) ̶ Mobilní fází je stlačený CO2 (80 bar) ̶ Eluce jako v normálních fází ̶ Organický modifikátor ̶ > 5 % metanol, ethanol, isopropanol ̶ gradient ̶ Polární látky: silikagel, kyano-, diol-, amino- stacionární fáze ̶ Nepolární látky: RP stacionární fáze (C4, C8, C18) ̶ Chirální separace https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/5991-5509EN.pdf https://www.southampton.ac.uk/~gjl/Research/sfc.htm (pod)kritické podmínky Instrumentace Regulátor tlaku (stlačený plyn) Mobilní fáze Hustota, gcm-3 Dm, cm2s-1 Viskozita, gcm-1s-1 Plyn 10-3 10-1 10-4 Superkritická tekutina 10-1 - 1 Jako kapalina 10-4 - 10-3 Jako kapalina 10-4 - 10-3 Jako plyn Kapalina 1 < 10-5 10-2 https://www.southampton.ac.uk/~gjl/Research/sfc.htm Tlak je v SFC ve srovnání s HPLC třetinový až pětinový při třikrát až pětkrát větších průtocích Využití SFC Farmakologie Ortogonální k reverzním fázím 1 – kafein, 2 – theofylin, 3 – kortison, 4 – prednisol, 5 – hydrokortison, 6 – prednisilon, 7 – sulfamerazin, 8 – sulfachinoxalin 5 – 25 % MeOH v CO2 ve 3 minutách 10 – 90 % MeOH ve vodě ve 4.5 minutách CO2 Mobilní fáze Metanol ̶ Snadno dostupný ̶ Levný ̶ Dosažitelný kritický bod (31 °C, 70 bar) ̶ Relativně bezpečný ̶ „Zelený“ (protože byl recyklován) ̶ Mísitelný s mnoha organickými modifikátory ̶ Dostupný ̶ Levný ̶ Plně mísitelný s CO2 ̶ Nízký práh absorpce (~205 nm) ̶ Relativně nízká toxicita Aditiva ̶ Vysoce polární látky ̶ 0.1 – 2 % v modifikátoru ̶ Potlačení ionizace ̶ Tvorba iontových párů ̶ Potlačení aktivních míst S.F. Vliv polarity modifikátoru (chirální separace) Vliv aditiva – Chirální separace S triethylaminem Bez triethylaminu Vliv stacionární fáze 1) Kafein 2) Theofylin 3) Theobromin metanol Aplikace – paprikový extrakt Aplikace – polární látky 1) Kafein 2) Theofylin 3) Theobromin 4) Uracil Změna elučního pořadí Preparativní chromatografie Preparativní chromatografie Slouží k izolaci čistých (nebo alespoň čistějších) složek vzorku, které jsou dále použity (k chemické reakci, další separaci apod.) wikipedia.org https://www.waters.com/waters/en_US/Preparative-Liquid-Chromatography-Primer/nav.htm?locale=en_US&cid=134929140 Preparativní separace ̶ Kolony ̶ Kratší, širší ̶ Rozměry ovlivňují množství vzorku ̶ Vývoj metody ̶ Gradientová eluce s klesající finální koncentrací 10 – 90 % 10 – 75 % 10 – 50 % 10 – 25 % Gradient Vliv pH na selektivitu Vliv dávkovaného objemu a délky kolony Kapacita kolony a Aplikace Úroveň (měřítko) Cílené množství Typická aplikace Analytická mikropurifikace µg Izolace enzymů, případně vývoj bioaktivních sloučenin v malém měřítku Semi-Prep mg Biologické testování, Určování struktury metabolitů Prep g Analytické referenční standardy, Toxikologické studie Proces kg Výroba chemikálií v průmyslovém měřítku Průměr (mm) Délka (mm) 4.6 10 19 30 50 50 3 15 45 110 310 75 — — — 165 — 100 5 25 90 225 620 150 8 40 135 335 930 250 13 60 225 560 1550 Průtok (mL/min) 1.4 6.6 24 60 164 Dávkovan ý objem (µL) 20 100 350 880 2450 Kapacita kolony (mg) Aplikace Sběr frakcí ̶ Na základě informace z detektoru Tenkovrstevná chromatografie Tenkovrstevná chromatografie wikipedia.org Výběr stacionární fáze Materiál Princip Typická aplikace Oxid hlinitý Adsorpční chromatografie (polární interakce) Alkaloidy, steroidy, terpeny, alifatické, aromatické a bazické sloučeniny Celulóza NP/RP, záleží na obsahu acetylu Antrachinony, antioxidanty, polycyklické aromáty, karboxylové kyseliny, nitrofenoly, sladidla Křemelina Impregnovaný materiál pro RP Aflatoxiny, herbicidy, tetracyklické sloučeniny Silikagel (SiO2) Standardní silikagel NP Nejčastěji využívaný materiál, aflatoxiny Silikagel G, impregnovaný síranem amonným Surfaktanty, lipidy Surfactants, lipids (syndrom dechové tísně u dětí, lecitin/sfingomyelin) Silikagel 60, impregnovaný kafeinem Přenos náboje komplexy Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH) Nitrilová skupina (kyano, CN) NP a RP Pesticidy, fenoly, konzervanty, steroidy Diolová skupina Steroidy, hormony Amino skupina Iontová výměna (anionty), NP a RP Nukleotidy, pesticidy, fenoly, deriváty purinu, steroidy, vitamíny, sulfonové kyseliny, karboxylové kyseliny, xantiny Obrácené fáze RP-2, RP-8, RP-18 Nepolární látky (lipidy, aromatické sloučeniny) Silanizovaný silikagel 60 Polární látky (bazické a kyselé farmaceutické přídavky) Smáčivý RP-18 W/UV254 NP a RP Aminofenoly, barbituráty, konzervanty, nukleové báze, PAH, steroidy, tetracyklíny, ftaláty Sférický silikagel LiChrospher® Si 60 NP Pesticidy, fytofamraceutika Zdroj: Applied Thin-Layer Chromatography, Elke Hahn-Deinstrop, strany 22-23, www.merckmillipore.com HPTLC HPTLC TLC Velikost částic 5 - 6 µm 10 - 12 µm Distribuce částic 4 - 8 µm 5 - 20 µm Tloušťka vrstvy 200 µm (100 µm) 250 µm HETP 12 µm 30 µm Typická migrační vzdálenost 3 - 6 cm 10 - 15 cm Čas separace 3 - 20 min 20 - 200 min Počet vzorků na desce < 36 (72) < 10 Objem vzorku 0.1 - 0.5 µl 1 - 5 µl Detekční limity: absorpce 100 - 500 pg 1 - 5 ng fluorescence 5 - 10 pg 50 - 100 pg HPTLC TLC Identické podmínky separace aminokyseliny značených dansyl chloridem TLC-MS https://theanalyticalscientist.com/techniques-tools/state-of-the-art-tlc-ms DOI: 10.4236/ajac.2011.26075 HPTLC-MS deska HPTLC deska