1 https://bpsbioscience.com/ Epigenetická informace Mitoticky i meioticky děděné změny genové exprese, které nesouvisí se změnou primární struktury DNA Epigenetickou kontrolu zprostředkovávají • modifikace makromolekul; DNA a histonů: METHYLACE DNA MODIFIKACE (methylace, acetylace, fosforylace, ubiquitinace) histonových proteinů • malé a nekódující molekuly RNA • architektura chromatinu Regulace aktivity a exprese genů během vývoje a diferenciance, reakce na změněné podmínky Spojka mezi genotypem a fenotypem 2 3 Ariv et al., Hypertension Res 2019 Epigeneze – Aristoteles, 384-322 př. n. l. individuální vývoj organismů souvisí s postupným růstem jejich komplexity (individuální tvorba tvarů během ontogeneze) X Proreformismus – ontogeneze je řízena předem danými strukturami individuální (ontogeneze; tvorba a vývin tvarů během životního cyklu individua) VÝVOJ historický (evoluce,fylogeneze; fixace tvarů – selekce, genetika) Historie termínu epigenetika 4 Historie termínu epigenetika Jean Baptiste Lamarck (1744-1829): • první pokus o výklad evoluční teorie • příroda se pod tlakem podmínek vyvíjí – teorie adaptivní evoluce • adaptivní změny jsou dědičné (teorie dědičnosti získaných znaků) August Weismann (1834-1914): • sledování dědičnosti indukovaných změn v somatické dráze • teorie divergence zárodečné a somatické dráhy – Weismannova bariéra Conrad Hal Waddington (1905-1975): • „epigenetika“, výsledná podoba organismu není předem absolutně daná, vzniká postupnými kreativními procesy • „epigenetická krajina“ 5 epigenetická krajina http://chreoda.nosquare.net/?page=chreoda&action=history&time=20080812-1446.bak Richard B. Goldschmidt (1878-1958) • fenotypová změna souvisí s vlivy prostředí • vzniká jen omezený počet fenotypů 6 (B. Vyskot, Epigenetika 2010) Methylace DNA Modifikace cytosinu v poloze 5, nejčastější modifikace DNA u eukaryot Postreplikativní modifikace SAM – S-adenosyl-methionin; v transmethylační reakci se konvertuje na S-adenosyl-homocystein 7 Methylace C v symetrických sekvencích – klíčové pro dědičnost methylačního obrazu - CpG (dublety) - CpHpG (triplety; rostliny; H = A,T,C) Distribuce methylace v genomech: Methylace DNA Chan et al., Nat Rev Genet 2005 8 Methylace C v symetrických sekvencích – klíčové pro dědičnost methylačního obrazu - CpG (dublety) - CpNpG (triplety; rostliny) Methylace C v asymetrických sekvencích (rostliny, omezeně u živočichů) Distribuce methylace v genomech: Methylace DNA Chan et al., Nat Rev Genet 2005 9 Methylace DNA a exprese genů UMLČENÍ GENU TRANSKRIPČNÍ POSTTRANSKRIPČNÍ - inaktivní promotor (žádný transkript nebo pouze malé množství) - methylace DNA v oblasti promotoru - normální transkripční aktivita promotoru - nestabilní transkript - methylace DNA v transkribované oblasti (hlavně na 3´konci genu) http://mmg-233-2014-genetics-genomics.wikia. com/wiki/DNA_Methylation upravenopodleKasinathanaHenikoff,2014000 10 Živočišné DNA methyltransferázy Udržovací (maintenance): methylace hemimetylovaných vláken po replikaci DNA; cytosiny v symetrických motivech (správný embryonální vývoj, imprinting, inaktivace chr. X) de novo: methylace dosud nemethylovaných úseků; musí existovat podnět (třeba přítomnost regulačních molekul RNA-dokázáno pouze v rostlinách; interakce DNA-DNA v repeticích; neobvyklé struktury DNA) Dnmt2 - u savců, rostlin; Drosophila – slabá non-CG methylace v časných fázích vývoje; S. pombe – mutace, kóduje nefunkční protein, ale je exprimován 2006 - v savčích buňkách methyluje tRNA (Asp) (Bird A, Science, 1999) DnmtL – DNA methyltransferázový motiv, katalyticky inaktivní Funkční kooperace s Dnmt3a/b, nezbytná pro genový imprinting 11 12 Živočišné DNA methyltransferázy Sharif and Koseki, Science 2018 MET1 (Methyltransferase 1) - udržovací methylace cytosinů v dubletech CG; homolog Dnmt1 CMT3 (Chromomethylase 3) - methylace cytosinů v tripletech CHG; unikátní pro rostliny DRM2 (Domains Rearranged Methyltransferase 2) - de novo methylace cytosinů ve všech sekvenčních motivech, musí existovat permanentní stimul – RNA?; homolog Dnmt3 - jinak řazené podjednotky – příčina odlišné substrátové specificity? DRM3 – VI, IX, X, I-V Dnmt3 – I-VI, IX, X (DDM1 (Decrease in DNA methylation 1) – kóduje protein, který je součástí komplexu remodelujícího chromatin, role v udržování CG i non-CH methylace) Rostlinné DNA methyltransferázy 13 Biologická role CpG a non-CpG methylace u rostlin CG: zajišťuje stabilní epigenetický obraz A.thaliana mutanty deficientní v udržování methylace CG – aktivace alternativních epigenetických mechanismů – non-CG methylace, H3K9Me2, architektura jádra (Mathieu O. et al, Cell 2007) Nefunkční MET1 – poruší se celý epigenetický obraz, fenotypické defekty – přetrvávají i po obnovení funkce enzymu. rostlina divokého typu met1 mutant 14 CG: zajišťuje stabilní epigenetický obraz A.thaliana mutanty deficientní v udržování methylace CG – aktivace alternativních epigenetických mechanismů – non-CG metylace, H3K9Me2, architektura jádra (Mathieu O. et al, Cell 2007) Nefunkční MET1 – poruší se celý epigenetický obraz, fenotypické defekty – přetrvávají i po obnovení funkce enzymu. Nefunkční CMT3 nebo DRM2 – bez fenotypu Nefunkční CMT3 a DRM2 - fenotypové změny po obnovení funkcí enzymů se methylační i fenotypový obraz vrací k normálu Biologická role CpG a non-CpG methylace u rostlin 15 1. PASÍVNÍ – ne-funkce udržovacích methyltransferáz Inhibitory DNA methyltransferáz Analogy cytosinu: 5-aza-deoxycytidine zebularine DHPA: (S)-9-(2,3-dihydroxypropyl)adenin (inhibitor SAH-hydrolázy) homocysteinmethionin SAH hydroláza cytosin 5-methylcytosin DHPA Prof. Antonín Holý 16 Demethylace DNA 1. PASÍVNÍ – ne-funkce udržovacích methyltransferáz 2. AKTIVNÍ (v rostlinách) DEMETER (DME) REPRESOR OF SILENCING (ROS) DNA glykosylázová doména – odstraní 5-mC, lyáza otevře vlákno. Polymerázy a ligázy doplní mezeru. DME – vývoj rostliny; kontroluje parentální imprinting genů v endospermu – hypomethylace promotorů maternálních alel genů MEA (regulátor vývoje endospermu) a FWA (transkripční faktor, podílí se na kontrole doby kvetení). ROS – uvolňuje TGS transgenů s hypermetylovanými promotory Kim and Zilbermann, Trends Plant Sci 2014 17 Demethylace DNA (www.nature.com/reviews) 18 1. PASÍVNÍ – ne-funkce udržovacích methyltransferáz 2. AKTIVNÍ (v živočišných buňkách) http://he-group.uchicago.edu 5 – hmC 2006 – objeven v myších a lidských mozcích Funkce (?) v regulaci exprese genů, korelace s acetylací histonů (pozitivní epigenetické značka) TET – methylcytosine dioxygenase TDG /BER thymin DNA glycosylase / base excision repair 19 Demethylace DNA (Elhamamsy, Cell Biochem Funct 2016) Změny methylace DNA během vývoje - savci (Zeng and Chen, Genes 2019) Změny methylace DNA během vývoje - rostliny (Han et al., Plants 2019) METODY STUDIA METHYLACE DNA 1. Digesce methylačně citlivými restrikčními endonukleázami - v rozpoznávací sekvenci mají cytosin, neštěpí, pokud je methylován CG: HpaII mCmCGG CfoI GmCGC SmaI CCmCGGG TaiI AmCGT CNG: MspI mCCGG CHH: Sau96I GG(A/T)mCmC (záleží na tom, co v sekvenci následuje) (Fojtová et al., Pharmacol Res 2006) 23 2. Modifikace DNA bisulfitem - cytosiny kovertovány na uracily, mC nereagují. Metody studia methylace DNA 24 NaHSO3 hydrogensiřičitan sodný 2. Modifikace DNA bisulfitem cytosiny kovertovány na uracily, mC nereagují. Modifikovaná DNA je namnožena pomocí PCR, uracily se párují s adeninem jako thyminy. Primery musí amplifikovat modifikovaný i nemodifikovaný templát; amplifikuje se každé vlákno zvlášť – nejsou komplementární. PCR produkt se klonuje a sekvenuje – cytosiny jsou pouze tam, kde byly původně mC. Výhoda analýzy: informace o lokalizaci methylovaných cytosinů v celé sekvenci, ne pouze v konkrétním restrikčním místě Metody studia methylace DNA 25 (Fojtová et al., Nucleic Acids Res 2006) 26 Metody studia methylace DNA 3. Sekvenování DNA po modifikaci bisulfitem, imunoprecipitace pomocí protilátek proti mC nebo afinitní purifikace pomocí mC vazebného proteinu Výsledky analýzy genomu Arabidopsis: • cca 20% cytosinů v genomu je methylovaných • nejvíce mC je v transpozonech a repetitivních sekvencích • nejméně methylované jsou promotory endogenních genů • asi 1/3 genů obsahuje „body methylation“ (CG místa na 3´konci kódující oblasti) 27 Metody studia methylace DNA Modifikace histonů Methylace – např. lysin v poloze 9 na histonu H3 (H3K9) Distribuce euchromatinových a heterochromatinových značek v Arabidopsis thaliana a myši (podle Fransz et al., 2006) Modifika ce Stupe ň A. thaliana myš euchromati n hererochromat in euchromati n heterochromat in H3K9 mono - + + di - + + tri + - - + H4K20 mono - + + di + - + tri + - - + 5m-C - + - + Jde o druhově- a dokonce lokus-specifické, dynamické modifikace 28 Modifikace histonů Acetylace – přídavek acetylové skupiny kompenzuje kladný náboj lysinových zbytků – oslabení interakcí mezi DNA a histony Acetylovaný chromatin – euchromatin Deacetylovaný chromatin – heterochromatin Enzymy: histon acetyltransferázy histondeacetylázy 29 30 Writers, readers, erasers Epigenetic tools. A representation of epigenetic writers, readers and erasers. These enzymes and protein domains carry out most of the epigenetic modifications on DNA and histone tails. Apart from the enzymes and protein domains highlighted here, other enzymes and protein domains are also available. DNMTs – DNA methyltransferases, HKMTs – Histone lysine methyltransferases, PRMTs – Protein arginine methyltransferases, HATs – Histone acetyltransferases, MBDs – Methyl-CpG-binding domains, PHD – Plant homeodomain, HKDMs – Histone lysine demethylases, HDACs – Histone deacetylases. BiswasandRao,EurJPharmacol2018 31 Dědičnost histonových modifikací semikonzervativní model (Zhu and Reinberg, Cell Res 2011) 32 Dědičnost histonových modifikací „piggy back“ model (Zhu and Reinberg, Cell Res 2011) Vztah mezi methylací DNA a modifikacemi histonů 1. Heterochromatinová modifikace H3K9me2 rekrutuje další enzymové aktivity (histodeacetylázu, HP1, DNA methyltransferázy) tvorba kompaktního uspořádání a fixace heterochromatinového stavu 2. V Arabidopsis thaliana byly vyřazeny geny pro histon methyltransferázy (SUVH4, SUVH5, SUVH6) aktivace transpozonů spojená s jejich hypomethylací 3. Proteiny obsahující Jumonji doménu jsou schopny odstraňovat methylové skupiny z histonů. V Arabidopsis byl identifikován protein IBM1 s Jumonji doménou, který reguluje (snižuje) hladinu methylace CNG v transkribovaných oblastech 4. „piggy – back“ model vs. de novo methylace DNA řízená modifikacemi histonů 33 mRNA – kopíruje genetickou informaci z molekuly DNA, přenáší ji do místa, kde dojde k překladu do struktury proteinu tRNA – překládá kód sekvence bází do sekvence aminokyselin. cca 80 nukleotidů, koncová sekvence –CCA, na ni se váže příslušná AK rRNA – tvoří (s proteiny) ribozom. Prokaryota: 5S, 16S, 23S Eukaryota: 5S, 5.8S, 18S, 28S ribozym – (Ribonucleic acid enzyme), RNA s katalytickou funkcí Nobelova cena za chemii (1989) 23S rRNA ve velké podjednotce ribozomu katalyzující syntézu peptidové vazby (peptidyl transferáza) RNázaP – štěpí RNA, maturace tRNA představa RNA světa v jistém stádiu evoluce, kdy byly molekuly RNA hlavními biologickými katalyzátory Biologická úloha RNA 34 Dlouhá dvouvláknová RNA (dsRNA; >200 nt) může umlčet expresi cílových genů v různých organismech (Caenorhabditis elegans, Drosophila, rostliny). Dlouhé dsRNA vstupují do metabolické dráhy nazývané RNA interference (RNAi). Dvouvláknová RNA je v reakci katalyzované enzymem Dicer štěpena na úseky dlouhé 20-25 nukleotidů, tzv. krátké interferující RNA (siRNA). siRNAs jsou začleněny do komplexu obsahující enzymy s ribonukleázovou aktivitou zvaného „RNA-induced silencing complexes“ (RISC). Dvouvláknové siRNA jsou rozvolněny, čímž dochází k aktivaci komplexu. siRNA navádějí RISC k molekulám RNA s komplementární sekvencí a dochází ke štěpení těchto molekul, a to blízko středu úseku, který je navázán k vláknu siRNA. RNA INTERFERENCE - SHRNUTÍ http://courses.biology.utah.edu/ bastiani/3230/DB%20Lecture/ Lectures/WormRNAi.html 35 Začalo to červem…….., ale na počátku byly kytky Jorgensen et al., 1990 Que, Jorgensen, 1998 PTGS Guo, Kemphues, 1995 Fire, Mello, 1998 RNAi Vlastnosti procesu RNA interference: * vlastní interferující molekulou je dsRNA (ne antisenseRNA) * efekt je vysoce specifický * velice potentní (několik molekul dsRNA v buňce stačí pro vyvolání efektivní odpovědi) * mobilní (je možno indukovat interferenci v buňkách a tkáních vzdálených od místa injektáže) 36 Šlechtění petunií – zintenzivnění barvy květů. Logický přístup – více kopií příslušného genu (chsA) – vyšší exprese žíhané rostliny až zastavení syntézy barviva KOSUPRESE -přítomnost transgenu vede k omezení exprese homologních (trans)genů ALE 37 Začalo to červem…….., ale na počátku byly kytky Jorgensen et al., 1990 Que, Jorgensen, 1998 PTGS Guo, Kemphues, 1995 Fire, Mello, 1998 RNAi Vlastnosti procesu RNA interference: * vlastní interferující molekulou je dsRNA (ne antisenseRNA) * efekt je vysoce specifický * velice potentní (několik molekul dsRNA v buňce stačí pro vyvolání efektivní odpovědi) * mobilní (je možno indukovat interferenci v buňkách a tkáních vzdálených od místa injektáže) 38 1. + asRNA zablokování exprese XX + sense RNA zablokování exprese 2. + mix sense a antisense RNA několikanásobně vyšší umlčovací efekt INJEKTÁŽE Caenorhabditis elegans (háďátko obecné) • analogie s pokusy na petuniích • saturace translačních faktorů  • základem interference je dsRNA • existence amplifikačního kroku 39 Figure 1. Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex- 3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. Each embryo is approximately 50 µm in length. (For details see: Fire et al. '98 "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans " Nature 391: 806-11) 40 Začalo to červem…….., ale na počátku byly kytky Jorgensen et al., 1990 Que, Jorgensen, 1998 PTGS Guo, Kemphues, 1995 Fire, Mello, 1998 RNAi Vlastnosti procesu RNA interference: * vlastní interferující molekulou je dsRNA (ne antisenseRNA) * efekt je vysoce specifický * velice potentní (několik molekul dsRNA v buňce stačí pro vyvolání efektivní odpovědi) * mobilní (je možno indukovat interferenci v buňkách a tkáních vzdálených od místa injektáže) 41 Molekulární základ RNAi http://www.ambion.com/techlib/ append/RNAi_mechanism.html 42 VZNIK dsRNA: - pokud je transgen uspořádán jako invertovaná repetice – transkripce přes střed IR P35S P35SnptII nptII 3´chs 3´chs RB LB LB - aberantní molekuly mRNA - předčasně terminované, nesprávně procesované substrát pro RdRP (RNA-dependent RNA polymerase) katalyzuje syntézu dsRNA (nebyla identifikována u Drosophila, u obratlovců nedávno) 43 Molekulární základ RNAi 44 DICER • vlastní iniciátor umlčení, identifikován v Drosophila • RNase III-like enzym (N-konec: helikázová doména, C-konec: RNaseIII doména a dsRNA vazebný motiv) • štěpení molekul dsRNA siRNA (21 - 25 nt) • evolučně konzervativní (houby, živočichové, rostliny) • ATP - dependentní nukleáza, funguje procesivně, ATP využívá k translokaci podél substrátu • C. elegans s mutací v genu kódujícím DICER – fenotypové defekty, důkaz zapojení RNAi do regulace vývojových procesů Živočichové, C. elegans, S. pombe – jeden DICER protein Drosophila – dva DICER Rostliny – čtyři!, mutace mají dramatický vliv na vývoj rostliny 45 Molekulární základ RNAi 46 RISC • RNA-induced silencing complex, efektorový komplex, destrukce cílové mRNA • aktivace RISC • jednovláknové siRNA - na základě komplementarity bazí navádí komplex k cílovému místu • helikáza, nukleázy s endo- a exo- aktivitou, protein recA (homology searching activity) ARGONAUTE – proteinová rodina, interakce s Dicer, součást komplexu RISC. 47 Proteiny rodiny ARGONAUT (Ago) Bazické proteiny (schopnost vazby na RNA) PAZ doména – protein-proteinové interakce asi přispívá i k vazbě siRNA PIWI doména – vazba siRNA v RISC Účastní se produkce siRNA, jejich „nasměrování“do příslušného efektorového komplexu i vlastní degradace mRNA, u rostlin procesu RDDM. Multigenové rodiny (Arabidopsis – 10 členů, Drosophila – 4, C. elegans – 3, člověk – 7, myš - 8). 48 Molekulární základ RNAi RDDM (RNA-directed DNA methylation); v rostlinách v rostlinách infikovaných rekombinantními viroidy nesoucími min. 300 nt homologii s kódující sekvencí methylace a PTGS pokud je homologie s promotorem TGS 49 RDDM • Vznik dsRNA transkripce přes IR (RNA pol II nebo RNA pol IV) vznik ze ssRNA (RdRP-RDR2) • dsRNA je procesována DICER, vznikající molekuly řídí methylaci DNA v komplementárních sekvencích (MET1 podílí se na CG de novo DRM2 de novo všechny kontexty DRD1 chromatin remodelující protein) • RNA nezávislý proces uchování methylačního obrazu (kromě CNN) 50 KO-EXISTENCE RNAi a methylace DNA Rostliny, obratlovci, Neurospora - methylovaná DNA a RNAi Drosophila, S. pombe – RNAi a Dnmt2 (?) C. elegans – RNAi, ale nemá gen pro DNA methyltransferázu S. cerevisiae – nemá methylaci ani RNAi Methylace DNA není univerzálním epigenetickým regulačním mechanismem existence alternativních mechanismů produkty genů skupiny Polycomb / Tritorax – udržení genů ve vypnutém / zapnutém stavu 51 microRNA endogenní malé molekuly RNA, kódovány geny ODLIŠNÝMI od těch, jež regulují. 21 nt, vazba na parciálně komplementární místa na 3´netranslatovaném konci cílové mRNA - represe translace. Vznik z vlásenkového prekursoru (70 bp), přepisován z intergenových oblastí. Živočichové – jeden prekursor společný pro několik miRNA. Rostliny – každá miRNA má svůj prekursor, maturované miRNA jsou methylované (HEN1). 52 ROSTLINY - degradace mRNA (AGO1) - vysoká komplementarita s cílovou sekvencí - 2/3 regulují expresi transkripčních faktorů ŽIVOČICHOVÉ - represe translace cílové sekvence spojená s její destabilizací - limitovaná komplementarita s cílovou sekvencí - širokospektrý účinek (vývoj) microRNA http://courses.biology.utah.edu/bastiani/3230/DB%20Lecture/Lectures/WormRNAi.html 53 siRNA A HETROCHROMATIN Heterochromatin obsahuje repetitivní sekvence a transpozony, transkripčně umlčená oblast. (Trans)geny inzertované do heterochromatinových oblastí – umlčení (Drosophila – PEV). RNAi – významná role ve formování a umlčení heterochromatinu X „umlčený“ heterochromatin není transkribován 54 Mutantní forma kvasinky Schizosaccharomyces pombe, blokována RNAi (mutace v genech Dicer, Rdp1, ago) neschopnost tvorby heterochromatinových struktur v centromerách během buněčného dělení (Volpe et al., 2002, Science) Mutantní formy Tetrahymena thermophila molekuly siRNA jsou nezbytné pro procesy rearangementu DNA v průběhu konjugace jader (Mochizuki et al., 2002, Cell) RNAi a heterochromatin 55 Telomerové transkripty Telomery jsou typický heterochromatin (?) (epigenetické modifikace, neobsahují geny, telomere position effect (TPE)) transkripčně neaktivní V savčích buňkách – TERRA (TElomeric Repeat containing RNA) 100 bp – 9 kb v jaderné frakci UUAGGG repetice (jenom slabý signál pro CCCUAA) počátek transkripce v subtelomerické oblasti aspoň část jich zůstává asociována s telomerami in vitro experimenty: TERRA ovlivňují aktivitu telomerázy (Azzalin et al. Science, 2007) 56 RNA polymerázy RNA pol. I – syntéza pre-rRNA 45S (28S, 18S, 5.8S rRNA) RNA pol. II – prekursory mRNA, ncRNA, miRNA RNA pol. III – tRNA, 5S rRNA a ostatní krátké RNA v jádře a cytoplasmě RNA polymerázy v mitochondriích a chloroplastech V rostlinách – RNA polymeráza IV transkripce heterochromatinových oblastí (intergenové sekvence, repetice) vznikají krátké transkripty substráty pro RDRP RNA polymeráza V transkripty zapojené do procesu RDDM 57 (Wierzbicki et al., Genes Develop, 2012) 58 https://www.youtube.com/watch?v=cK-OGB1_ELE 59